Abstract
cyclin-avhengig kinase inhibitor 1B (p27Kip1) er en viktig protein i beslutningen mellom spredning og cellesyklus exit . Hvilende celler viser atom p27Kip1, men dette proteinet eksporteres til cytoplasma i respons til prolifererende signaler. Vi har nylig rapportert at katalase behandling øker nivået av p27Kip1
in vitro Hotell og
in vivo
i en musemodell. For å karakterisere og utvide disse funnene, vurderte vi regulering av p27Kip1 av hydrogenperoksyd (H
2o
2) i humane melanomceller og melanocytter. Vi har observert en høy prosentandel av p27Kip1 positive kjerner i melanomceller som overuttrykker eller behandlet med eksogen katalase, mens ikke-behandlede kontroller viste en cytoplasmisk lokalisering av p27Kip1. Da vi studerte nivåene av p27Kip1 fosforylert (p27p) på serin 10 (S10) og på treonin 198 (T198) fordi fosforylering på disse områdene gjør at atom utførsel av dette proteinet, som fører til opphopning og stabilisering av p27pT198 i cytoplasma. Vi demonstrert av western blot en nedgang i p27pS10 og p27pT198 nivåer som svar på H
2o
2 fjerning i melanomceller, assosiert med kjernefysiske p27Kip1. Melanocytter også utstilt atom p27Kip1 og lavere nivåer av p27pS10 og p27pT198 enn melanom celler, som viste cytoplasma p27Kip1. Vi viser også at tilsetningen av H
2o
2 (0,1 uM) til melanomceller arrestert i G1 av serum sult induserer proliferasjon og øker nivået av p27pS10 og p27pT198 fører til cytoplasmatisk lokalisering av p27Kip1. Nukleære lokaliserings og post-translasjonelle modifikasjoner av p27Kip1 ble også demonstrert ved katalase behandling av kolorektal karsinom og neuroblastom-celler, som strekker seg våre funn til disse andre humane krefttyper. I konklusjonen, vi viste i dette arbeidet at H
2o
2 spyle hindrer atom utførsel av p27Kip1, slik at cellesyklus arrest, noe som tyder på at kreftceller dra nytte av deres iboende pro-oksidanter staten til å favorisere cytoplasma lokalisering av p27Kip1 .
Citation: Ibañez IL, Bracalente C, Notcovich C, Tropper jeg, Molinari BL, Policastro LL et al. (2012) Fosforylering og subcellulære lokalisering av p27Kip1 Regulert av Hydrogenperoksid Modulation i kreftceller. PLoS ONE 7 (9): e44502. doi: 10,1371 /journal.pone.0044502
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 26 januar 2012; Godkjent: 08.08.2012; Publisert: 06.09.2012
Copyright: © Ibañez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra det nasjonale kontoret for vitenskapelig og teknologisk Promotion (ANPCyT), Argentina (PICT 2007-01628 og PICT 05-14330) og non-profit organisasjon Fundación Florencio Fiorini. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
cellecyklusprogresjonen trasé er endepunktet for signalering kaskader involvert i cellevekst og celledeling. Cellesyklus er tett koordineres ved sekvensiell montering og aktivering av fase-spesifikt protein-kinase-komplekser [1], [2], dannet av cykliner og cyklin-avhengige kinaser (CDK), som også reguleres av den INK4 proteiner og de CDK-inhibitorer ( CDKIs). D-type sykliner er uttrykt gjennom hele syklusen i respons til mitogen stimulering [2]. Cyklin D-CDK4 og syklin E-CDK2 komplekser er nødvendig for passasje fra G1 til S-fasen. Den CDKI 1B (CDKN1B), også kjent som p27Kip1, ble først identifisert som en viktig negativ regulator av CDK2 og G1 /S cellesyklusprogresjon [2], [3]. Nivåene av denne CDKI er høy i hvilende celler, faller i respons til mitogen stimulering, ligge på terskelnivåer i prolifererende celler, og øke igjen når mitogener trekkes [2].
I de senere år ble det funnet som p27Kip1 er involvert i reguleringen av andre prosesser så som cellevandring [4] sammen med celleproliferasjon, differensiering og apoptose [5]. Interessant, kan dette proteinet utøve både positive og negative funksjoner på disse prosessene [5]. Aktivitetene til p27Kip1 er kontrollert av dets konsentrasjon, subcellulære lokalisering og fosforylering status [5]. For eksempel, fosforyleringen av p27Kip1 ved serin 10 (S10) formidler p27Kip1 utførsel til cytoplasma [6] – [9], fosforyleringen ved treonin 198 (T198) stabiliserer proteinet i cytoplasma og øker p27Kip1-avhengig celle motilitet [4 ] og fosforylering på treonin 187 (T187) peker p27Kip1 som et mål for proteolyse av polyubiquitination [9] – [11]. Fosforyleringen av andre områder av proteinet svekker atom innførsel av p27Kip1 og forbedrer montering av cyklin D1-CDK4 kompleks [9], [12] – [15] eller initierer overgang av p27Kip1 fra inhibitor of cyclin E-CDK2 til substratet for proteolyse [16], [17]. Endringer i p27Kip1 fosforylering kan føre til tap av stabilitet, avvikende funksjon eller mislocalization av proteinet, som i sin tur kan bidra til onkogenesen [5], [9]. I denne forstand, har både tap av kjernefysisk p27Kip1 og dets cytoplasmatiske lokalisering blitt foreslått som prognostisk markør for melanom progresjon og verre klinisk utfall [18].
ekstracellulær Miljø kan Initiere Cellesyklus divisjon eller Arrest ved å aktivere eller deaktivere Cyclin -CDK Komplekser gjennom ulike veier
reaktive oksygenforbindelser (ROS) er i stand til å utøve ulike effekter på cellene etter sin art, lokalisering og nivåer [19]. Spesielt mange typer av pattedyrceller kan øke deres vekst når de utsettes for moderate nivåer av hydrogenperoksid (H
2o
2) og kan indusere apoptose [20], terminal differensiering [21] eller cytotoksisitet [20] ved eksponering for høye nivåer av H
2o
2. Scavenging av H
2o
2 i tumorceller, enten behandles med eksogen katalase eller som uttrykker transfektert katalase hemmer celleproliferasjon [22] – [25]. Det er godt dokumentert at H
2o
2 som er involvert i signaloverføringsreaksjonsveier [26], [27], f.eks økte nivåer av H
2o
2 indusere mitogene signaler, for eksempel de som er knyttet til Ras /ekstracellulære signalregulerte kinaser 1 og 2 (ERK1 /2) vei, og stress-responsive signaler, slik som de som er knyttet til c -Jun N-terminale kinaser (JNKs) og p38 mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) trasé [26] – [28]. Videre ROS, og spesielt H
2o
2, ble også underforstått i modulering av reseptor-tyrosin-kinaser (RTK) [29] og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT [30] veier.
det har blitt rapportert at endringer observert i den intracellulære redoks-tilstand i løpet av cellesyklusprogresjon kan være linket oksidative metabolske prosesser til cellesyklusregulering [31], [32]. H
2o
2 svingninger langs cellesyklusen ble knyttet til regulering av cyclin D1 uttrykk [33]. I kontrast, fjerning av endogen H
2o
2 ved overekspresjon av katalase og glutation peroxidase induserer G0 /G1 arrest [25] og reduserer celle DNA-syntese [34]. En fersk studie fra vårt laboratorium viste økt nivå av p27Kip1 svar på katalase behandling i en murine modell av plateepitelkarsinom
in vitro Hotell og
in vivo product: [35]. Imidlertid er involvert i denne cellesyklus proteinet regulering av H mekanismer
2o
2 er ikke fullt ut forstått. Tatt i betraktning at p27Kip1 ble foreslått som en prognostisk biomarkør for human melanoma [18], og at disse tumorer oppviste en pro-oksidant oppførsel på grunn av en ubalanse i antioksidantsystem [36], [37], og til den melanin deregulering [38], human melanomceller bli en interessant modell for å utvide våre tidligere resultater på H
2o
2 regulering av p27Kip1.
Formålet med denne studien var å evaluere effekten av modulering av H
2o
to nivåer på G1 /S overgang og, spesielt, på regulering av CDKI protein, p27Kip1, i human melanoma og melanocyte cellelinjer. Vi demonstrerte den intracellulære relocalization av p27Kip1 etter katalase eller H
2o
2 behandlinger. Dette var forbundet med variasjoner i nivået av fosforylert p27Kip1 ved S10 (p27pS10) og T198 (p27pT198), som spiller en viktig rolle i reguleringen av den subcellulære lokalisering av dette protein. Resultater på p27Kip1 modulasjon ble utvidet til andre menneskelige kreftcelletyper, tykktarmskreft og neuroblastom celler. Våre funn kan gi en ledetråd for å forstå effekten av H
2o
2 på modulering av en nøkkel regulatorisk protein av G1 /S overgang med påfølgende effekt på cellesyklus og celledeling.
resultater
Catalase Behandling hemmer melanoma celleformering av G1 Arrest
det har vært antydet at celler med en permanent oksidativt skift i redox status kan gjennomgå kontinuerlig spredning som kan i sin tur være en avgjørende begivenhet i utseendet av den maligne fenotype [23], [39]. I denne forstand er produksjonen av store mengder av ROS og, i særdeleshet, H
2o
2, ble rapportert i tumorcellelinjer [23], [40]. Katalase er en antioksidant enzym som bryter ned H
2o
2 i vann og oksygen. Tatt i betraktning at H
2o
2 kan diffundere over membraner, kan tilsetningen av katalase til kulturmediet frembringe en reduksjon i den intracellulære nivået av H
2o
2 å nå en tilsvarende lavere steady state konsentrasjonen i og utenfor cellen [26], [33], [35]. Vi validert vår modell av melanomceller behandlet med katalase tilsatt til kulturmediet ved å måle reduksjonen i nivåene av ROS gjennom 2 «, 7»-dichlorodihydro-fluorescein-diacetat (DCFH-DA) analyse (figur 1A og 1B). Denne reduksjonen i ROS-nivået indusert av katalase resulterte i en signifikant inhibering (p 0,01) av celleproliferasjon (figur 2A). Videre A375 celler som overuttrykker katalase (A375-CAT-E9) vises lav sats av celleproliferasjon sammenlignet med kontrollceller (figur 2B). Denne klon, A375-CAT-E9, viste de laveste intracellulære ROS-nivåer av stabile Geneticin-resistente kloner som genereres (fig S1A) og en signifikant reduksjon i disse nivåene sammenlignet med celler transfektert med et tomt plasmid (A375-pcDNA3) eller ikke- -transfected (A375 kontroll) (Tall 1C og 1D). Disse resultatene er enig med høyere nivåer av katalase uttrykk og aktivitet observert i A375-CAT-E9 sammenlignet med kontrollceller (Figur S1B og S1C).
(A-D) Intracellulær ROS-nivåer redusert i melanom celler enten ved behandling med katalase, eller når det overekspresjon. (A) Representative histogrammer av DCF fluorescensen til melanom-celler ble behandlet med 500 (blå linje) og 1000 (oransje linje) U /ml katalase eller ubehandlet (grønn linje) i 24 timer. Kontrollceller ikke utsettes for DCFH-DA (svart linje) og kontroll celler behandlet med katalase like før DCFH-DA inkubasjon (rød linje). (B) DCF mener fluorescens (vilkårlige enheter) vs. katalase (CAT) dose. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 vs. ubehandlede celler (0 U /ml katalase). (C) Representative histogrammer av DCF fluorescens av melanom celler som overuttrykker katalase (A375-CAT-E9) og dets kontroller (A375-pcDNA3 og ubehandlede A375-celler). Kontrollceller ikke utsettes for DCFH-DA (svart linje), kontrollceller behandlet med katalase like før DCFH-DA inkubasjon (rød linje) og celler inkubert med DCFH-DA (grønn linje). (D) DCF gjennomsnittlig fluorescens (vilkårlige enheter) av A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 og A375 kontrollceller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 vs. A375 kontroll. (E-F) melanomceller (A375) viste høyere nivåer av intracellulær ROS enn deres ikke-tumor motstykke (PIG-1 melanocytter). (E) Representative histogrammer av DCF fluorescens av PIG-en og A375 celler: kontrollceller ikke er utsatt for DCFH-DA (svarte linjer), kontrollceller behandlet med katalase like før DCFH-DA inkubasjon (rød linje) og celler inkubert med DCFH- DA (grønn linje). (F) DCF mener fluorescens (vilkårlige enheter) av PIG-1 melanocytter og A375 melanomceller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 vs. PIG-en
(A) Celleproliferering frekvensen av melanom celler behandlet med katalase for 24 timer, i forhold til å kontrollere celler, evaluert av MTT analysen.. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 vs. kontroll. (B) spredningshastighet i A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 og A375 kontrollceller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05 vs. A375 kontroll. (C) formeringshastigheten av ikke-tumor (PIG-1) og tumor (A375) celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 vs. A375. (D-I) cellesyklusanalyse bestemt ved strømningscytometri etter farging med propidiumjodid. (D) Representative histogrammer av DNA-innhold av A375-melanomceller ble behandlet med 1000 U /ml katalase (CAT) i løpet av 24 timer og A375 kontrollceller. (E) Prosent av melanomceller i de ulike faser av cellesyklusen som respons på CAT behandling. FBS sultet celler ble anvendt som kontroll av G1 arrest. (□) Ubehandlede kontrollceller, () 500 U /ml og (■) 1000 U /ml CAT og () FBS sultet celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05 og ** p 0,01 vs. ubehandlet kontroll. (F) Representative histogrammer av DNA innhold av A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 og A375 kontrollceller. (G) Prosent av A375-CAT-E9 (■), A375-pcDNA3 () og A375 kontrollceller (□) i de ulike fasene av cellesyklusen. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 vs. A375 kontroll. (H) Representative histogrammer av DNA innhold av PIG-1 melanocytter og A375-melanomceller. (I) Prosent av (■) ikke-tumor (PIG-1) og (□) tumor (A375) celler i de forskjellige faser av cellesyklusen. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P. 0,01 vs. PIG-1 celler
For å vurdere ikke-tumor og kreftceller i forbindelse med sine intracellulære ROS-nivåer, analyserte vi melanocytter vs. melanomceller. Figur 2C viser den formeringshastigheten av PIG-1 melanocytter i forhold til A375 melanomceller. Vi bekreftet at kreftceller viste høyere intracellulære nivåer av ROS enn sine ikke-tumor motpart i denne melanom /melanocyte modell (figur 1E og 1F). Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i nivåene av ROS og i formeringshastigheten (figur S2) mellom ikke-behandlet og varmeinaktiverte katalase behandlede celler i det melanom-modellen. Således ble varme-inaktivert katalase anvendt som kontroll.
En vesentlig G1 cellesyklusrest ble funnet i forbindelse med inhibering av celleproliferasjon i melanomceller behandlet med katalase i 24 timer (figurene 2D og 2E). Tilsvarende resultater ble observert for A375-CAT-E9 vs. A375-pcDNA3 eller A375 kontrollceller (Tall 2F og 2G). Melanocytter viste høyere prosentandel av celler i G1 fase og en lavere prosentandel i S-fasen enn melanomceller (fig 2H og 2i).
Når det gjelder nivåene av cykliner og CDK involvert i G1 /S overgang, cyklin D1, cyclin E, CDK4 og CDK2, evaluert ved western blot, ble det observert en signifikant reduksjon i cyklin D1 nivåer etter H
2o
2 fjernelse av katalase behandling eller katalase overekspresjon (figur S3), i overensstemmelse med tidligere funn [35 ], [41].
Videre er signalet for cyklin D1 detektert ved immunfluorescens var ekstremt lavt i kjernen av celler behandlet med katalase og en betydelig reduksjon av prosentandelen av positive kjerner ble funnet i disse celler sammenlignet med kontrollceller (figur S4). Melanomceller viste høyere mengde av både cyklin D1 nivåer, og prosentandelen av positive kjerner for cyklin D1, vurdert ved Western blot og immunfluorescens enn deres ikke-tumor motstykke PIG-1 (figur S3 og S4), som ville være relatert til økte nivåer av ROS og andelen av A375 celler i S-fasen. Ingen signifikante forskjeller i cyclin E ble det ikke observert CDK2 og CDK4 nivåer mellom katalase-behandlede og kontrollcellene og mellom ikke-tumor og tumorceller (figur S3). Dermed vil nedgangen i cyclin D1 nivåer observert være involvert i G1 /S arrest indusert av katalase i A375 celler.
Catalase Behandling Induced Nuclear Lokalisering av p27Kip1
Med tanke på G1 arrest indusert av katalase og betydningen av den subcellulære lokalisering av inhiberende protein p27Kip1 for sin regulerende aktivitet, ble effekten av H
2o
2-inaktiverende på lokalisering av dette proteinet undersøkt ved immunfluorescens. Bemerkelsesverdig, p27Kip1 ble lokalisert primært i kjernen i melanomceller behandlet med eller overekspresjon katalase sammenlignet med kontroller, hvori p27Kip1 fordeling var overveiende cytoplasmiske (Figurene 3A-3D). I tillegg melanocytter viste en høyere prosentandel av positive p27Kip1 celler enn det av A375-melanomceller (figurene 3E og 3F). Dette proteinet var hovedsakelig lokalisert i kjernen i ikke-tumorceller og i cytoplasma i tumorceller (figurene 3E og 3F).
(A-F) subcellulær lokalisering av p27Kip1 evaluert ved immunocytofluorescence. (A-B) melanom-celler ble behandlet med 500 og 1000 U /ml katalase (CAT) i perioder på 6 eller 24 timer eller ubehandlet. FBS sultet celler ble anvendt som kontroll av G1 arrest. (C-D) Catalase overekspresjon modell (A375-CAT-E9 celler) vs. kontroller (A375-pcDNA3 og A375 kontrollceller). (E-F) Ikke-tumor (PIG-1) vs. tumor (A375) celler. (A, C og E) Representative bilder av p27Kip1 immunocytofluorescence som viser den subcellulære lokalisering av proteinet. DAPI: farging av nukleært DNA; p27Kip1: FITC farging av p27Kip1 protein. (B, D og F) Prosentandel positive (□) cytoplasms og positive (■) kjerner for p27Kip1 i forhold til det totale antall celler telles. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. (B) ** p 0,01 vs. kontroll. (D) * p 0,05 og ** p 0,01 vs. A375 kontroll. (F) * p 0,05 og ** p 0,01 vs. ikke-tumorceller. (G-H) Økt ekspresjon av kjerne p27Kip1 i A375-celler etter 1000 U /ml katalase (CAT) behandling sammenlignet med kontroll A375-celler (behandlet med 1000 U /ml varme-inaktivert katalase, IN-CAT) i 24 timer, påvist av western blot av kjernefysiske og cytosoliske ekstrakter (se Methods). (G) Representative Immunoblotanalyse Bildene vises. C: cytoplasmatiske ekstrakter; N: Nuclear ekstrakter. Aktin og Ku-70 densitometriske verdier ble brukt til å standardisere for cytoplasma og kjernefysisk protein lasting, hhv. (H) Relative densitometriske verdier av (□) cytoplasmiske og (■) atom p27Kip1 nivåer. Resultatene er referert til kontrollceller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * P. 0,05 vs. kontroll
For å bekrefte effekten av H
2o
2 scavenging på p27Kip1 lokalisering observert av immunfluorescens, nivåene av dette proteinet i kjernefysisk og cytosolic ekstrakter av melanomceller behandlet med katalase ble undersøkt ved western blot. Vi viser en signifikant økning av p27Kip1 nivåer i nukleære ekstrakter av celler behandlet med katalase sammenlignet med kontroll (figur 3G og 3H).
Disse resultater viser modulering av den intracellulære lokalisering av p27Kip1 i reguleringen av celleproliferasjon av katalase og bekrefter våre tidligere funn [35], utvide disse resultatene til menneske A375 celler. Utholdenhet av p27Kip1 i kjernen indusert av H
2o
2 fjerning ville favorisere blokkering av cellesyklus i G1 /S overgang.
H
2o
2 Modulation fører til Post-translasjonelle modifikasjoner av p27Kip1
Vi demonstrerte også en betydelig økning i det totale nivå av p27Kip1 i respons til katalase behandling eller overekspresjon vurdert ved western blot (Figur 4). Dette kan ha sammenheng med de høye nivåene av p27Kip1 observert i kjernen av katalase behandlede celler (Figur 3E). Videre melanomceller oppviste lavere nivåer av denne inhiberende protein i forhold til melanocytter (figur 4). Angå western blot (figur 4) og immunfluorescens (figur 3) resultater og vurderer at p27Kip1 nivåer, funksjon og lokalisering er regulert av phosphorylations, nivåene av p27Kip1 fosforylert på S10 (p27pS10), T198 (p27pT198) og T187 (p27pT187) som svar H
2o
2 scavenging ble evaluert av western blot. Fosforyleringen av p27Kip1 ved S10 og T198 er en nøkkel arrangement for atom utførsel av dette proteinet og progresjonen av cellesyklusen, og vi viste en betydelig reduksjon i nivåene av p27pS10 og p27pT198 i celler som overuttrykker eller behandlet med katalase, sammenlignet med kontroller (figur 4 ). Videre PIG-1 melanocytter viste lavere nivåer av p27pS10 og p27pT198 enn deres svulst motpart (figur 4).
uttrykk for p27Kip1 og p27Kip1 fosforylert på S10 (p27pS10) og T198 (p27pT198) ble analysert ved western blot . (A-B) A375-melanomceller behandlet med katalase (CAT) for 6 og 24 timer. FBS sultet celler ble anvendt som kontroll av G1 arrest. (C-D) Catalase overekspresjon modell (A375-CAT-E9 celler) vs. kontroller (A375-pcDNA3 og A375 kontrollceller). (E-F) Ikke-tumor (PIG-1) vs. tumor (A375) celler. (A, C og E) Representative Immunoblotanalyse bilder. (B, D og F) Relativ densitometriske verdier av () p27Kip1 nivåer, (□) p27pS10 og (■) p27pT198. Actin densitometriske verdier ble anvendt for å standardisere for protein lasting. Resultatene er henvist til å få tak uten behandling (i B og D) og til ikke-tumor (PIG-1) celler (i F). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. (B) * p 0,05 og ** p 0,01 vs. ubehandlet kontroll. (D) ** p 0,01 vs. A375 kontroll. (F) ** p. 0,01 vs. ikke-kreftceller
Disse funnene tyder på at reduserte nivåer av H
2o
2 av katalase hindre fosforylering av spesifikke områder av p27Kip1 således unngå atom eksport av proteinet og som fører til cellesyklus-stans gjennom oppbygging av p27Kip1 i kjernen. I tillegg ble fosforyleringen av p27Kip1 ved T187, som er involvert i å utløse proteolyse av dette protein, evaluert i katalase-behandlede melanomceller og ingen signifikante forskjeller ble observert sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur S5).
i betraktning at vekstfaktorer utløse H
2o
2 produksjon som fører til aktivering av signalveier som styrer celleformering [27], vi vurdert hvor H
2o
2 er involvert i modulering av p27Kip1 i G1 arrestert A375 celler ved FBS sult inkubert med ulike nivåer av H
2o
2 i 24 timer. Figur 5A viser økte intracellulære nivåer av ROS i en doseavhengig måte i celler behandlet med 0,1 til 10 uM H
2o
2 i forhold til FBS sultet celler. Det har tidligere vært rapportert at anvendelsen av 0,1 til 7 mikrometer H
2o
2 til dyrkede celler fører til intracellulær H
2o
2 nivåer på ca. 0,01 til 0,07 mikrometer og direkte stimulerer celleproliferasjon. På den annen side, økende mengder av celledød forekomme med anvendt konsentrasjoner av H
2o
2≥10 pM [gjennomgått i 26]. I vår cellulære modell, inkubasjon av FBS sultet celler med 0,1 mikrometer H
2o
2 indusert en økning i spredning hastighet i forhold til ubehandlede FBS sultet celler. På den annen side ble ingen virkning på celleformering observert med de andre doser av H
2o
2 benyttes (figur 5B). Celler behandlet med 0,1 mikrometer H
2o
2 viste en overveiende cytoplasma p27Kip1 distribusjon; i likhet med celler inkubert med 10% FBS mens p27Kip1 ble hovedsakelig funnet i kjernen i ubehandlede FBS sultet celler (Figurene 5C og 5D). Den subcellulære lokalisering av dette protein i celler behandlet med 0,01 uM av H
2o
2 ble sammenlignes med mønsteret observert i FBS sultet celler og tilsetning av 1-10 uM H
2o
2 til A375 FBS sultet celler resulterte i en tilsvarende andel av kjernefysisk og cytoplasma p27Kip1 (Tall 5C og 5D). Western blot viste reduserte nivåer av p27Kip1 i celler behandlet med 0,01 mikrometer fra H
2o
2 i forhold til FBS sultet celler og celler behandlet med 0,1-10 mikrometer fra H
2o
2 (Tall 5E og 5F). Nivåene av p27pS10 og p27pT198 i celler behandlet med 0,1 mM av H
2o
2 økt som i celler inkubert med 10% FBS mens FBS sultet celler viste lave nivåer av p27pS10 og p27pT198 (figurene 5E og 5F). På den annen side ble ingen signifikante forskjeller funnet i nivåene av p27pT187 i celler behandlet med eksogent H
2o
2 (0,1 og 10 uM), sammenlignet med både FBS sultet og 10% FBS inkuberte kontrollceller (figur S5 ). Disse funnene tyder på at H
2o
2 på en mitogen nivå på 0,1 mikrometer for vår mobilmodell regulerer p27Kip1 fosforylering fører til cytoplasma lokalisering av dette proteinet og favorisering celleproliferasjon.
Melanom (A375) celler dyrket i fullstendig medium med 10% FBS ble arrestert av FBS sult (0% FBS) i en periode på 24 timer og deretter celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av H
2o
2 (0,01-10 uM) eller til 10% FBS. (A) Intracellulær ROS-nivåer målt ved DCFH-DA-analysen. (B) Celle proliferasjonsrate bedømt ved MTT-assay. (C) Representative bilder av p27Kip1 immunocytofluorescence som viser den subcellulære lokalisering av proteinet. DAPI: farging av nukleært DNA; p27Kip1: FITC farging av p27Kip1 protein. (D) Prosentandel positive (□) cytoplasms og positive (■) kjerner for p27Kip1 i forhold til det totale antall celler telles. (E) Ekspresjon av p27Kip1, p27pS10 og p27pT198 analysert ved hjelp av western blot. (F) De relative densitometriske verdier av () p27Kip1 nivåer, (□) p27pS10 og (■) p27pT198. Actin densitometriske verdier ble anvendt for å standardisere for protein lasting. Resultatene er referert til kontroll ble inkubert med 10% FBS. (A, B, D og F) Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05, ** p 0,01 og *** p 0,001 vs. celler inkubert med 10% FBS;
# p 0,05,
## p 0,01 og
### p 0,001 vs. FBS-sultet celler ikke-eksponert for H
2o
2
Derfor viste vi at H
2o
2 vil være underforstått i modulering av viktige regulatoriske posttranslasjonelle modifikasjoner av p27Kip1 protein i melanomceller.
Catalase modulerer også Cell Proliferation og subcellulære lokalisering av p27Kip1 i kolorektalt karsinom og neuroblastom-celler
for å utvide resultatene observert for melanomceller behandlet med katalase for andre humane kreftcelletyper, evaluert vi celleproliferasjon, cellesyklus og p27Kip1 intracellulær fordeling i kolorektal karsinom (LoVo) og neuroblastom (Paju) celler. Karakterisering av våre cellemodeller på ROS nivå viste at LoVo celler utstilt lavere intracellulære ROS-nivåer enn Paju og A375 celler (figur S6). Interessant, observerte vi en lav spredningshastighet (p 0,01) for både LoVo og Paju celler (figur 6) som reaksjon på de reduserte nivåer av ROS indusert ved tilsetning av katalase i cellekulturer (figur 6). LoVo og Paju celler behandlet med katalase i 24 timer, viste en betydelig G1 cellesyklus-stans (figur 6) assosiert med en reduksjon i cyklin D1-nivåer (figur S7). I samsvar med disse resultatene, signalet for cyklin D1 detektert ved immunfluorescens var ekstremt lavt i kjernen av celler behandlet med katalase og en betydelig reduksjon av prosentandelen av positive kjerner ble funnet i disse celler sammenlignet med kontrollceller (figur S8). Ingen signifikante forskjeller i cyclin E ble det ikke observert CDK2 og CDK4 nivåer mellom katalase-behandlede og ikke-behandlede celler (figur S7).
LoVo og Paju celler ble behandlet med 0-1000 U /ml katalase (CAT) i 24 timer. (A-B) Intracellulær ROS-nivåer bestemt ved DCFH-DA-analyse. (A) Representative histogrammer av DCF fluorescens fra celler behandlet med 500 (blå linje) og 1000 (oransje linje) U /ml katalase eller ubehandlet (grønn linje) i 24 timer. Kontrollceller ikke utsettes for DCFH-DA (svart linje) og kontroll celler behandlet med katalase like før DCFH-DA inkubasjon (rød linje). (B) DCF mener fluorescens (vilkårlige enheter) vs. katalase dose. (C) Celleformeringshastigheten av LoVo og Paju celler behandlet med katalase i 24 timer, i forhold til kontrollceller, bedømt ved MTT-analyse. (D-E) cellesyklusanalyse bestemt ved strømningscytometri etter farging med propidiumjodid. (D) Representative histogrammer av DNA-innhold celler behandlet med katalase (CAT). (E) Prosent av celler i de forskjellige faser av cellesyklusen som respons på CAT behandling. FBS sultet celler ble anvendt som kontroll av G1 arrest. (□) Ubehandlede kontrollceller, () 500 U /ml og (■) 1000 U /ml CAT og () FBS sultet celler. (B, C og E) Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05 og ** p. 0,01 vs. kontroll
(A og B) Nuclear lokalisering av p27Kip1 med katalase (CAT) ble oppdaget av immunocytofluorescence. (A) Representative bilder av p27Kip1 immunocytofluorescence som viser den subcellulære lokalisering av proteinet. DAPI: farging av nukleært DNA; p27Kip1: FITC farging av p27Kip1 protein. (B) Prosent av positive cytoplasms (□) og positive kjerner (■) for p27Kip1 i forhold til det totale antall celler telles. (C og D) Økning av p27Kip1 nivåer og reduksjon av p27Kip1 fosforylert ved S10 (p27pS10) og T198 (p27pT198) som reaksjon på H
2o
2 scavenging, analysert ved hjelp av western blot. (C) Representative Immunoblotanalyse bilder. (D) De relative densitometriske verdier av () p27Kip1 nivåer, (□) p27pS10 og (■) p27pT198. Actin densitometriske verdier ble anvendt for å standardisere for protein lasting. Resultatene er henvist til å få tak uten behandling. (B og D) Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05 og ** p 0,01 vs. ubehandlet kontroll. (A-D) FBS sultet celler ble anvendt som kontroll av G1 arrest.
kolorektalt karsinom og neuroblastom-celler behandlet med katalase viste også p27Kip1 lokalisert primært i kjernen sammenlignet med kontroller, hvori p27Kip1 fordeling var overveiende cytoplasma (7A og 7B viser behandlinger i 24 timer og figurene S9A og S9B viser behandlinger for 6t). I tillegg demonstrerte vi ved western blot en betydelig økning i nivåene av p27Kip1 i respons til katalase behandling for både LoVo og Paju celler (figurene 7C og 7D behandlinger for 24 timer og figurene S9C og S9D behandlinger i 6 timer). Endelig gjengis vi en betydelig reduksjon i nivåene av p27pS10 og p27pT198 i kolorektal karsinom og neuroblastom-celler behandlet med katalase, sammenlignet med kontroller (figur 7C og 7D behandlinger for 24 timer og figurene S9C og S9D behandlinger i 6 timer).
Disse resultatene bekreftet og utvidet våre tidligere funn.
