Abstract
Formål
For å gi ytterligere funksjonell informasjon for svulst karakterisering undersøkte vi bruken av dual-energi computertomografi for avbildning murine lungesvulster. Tumor blodvolum og vaskulær permeabilitet ble kvantifisert ved hjelp av gull og jod nanopartikler. Denne fremgangsmåten ble sammenlignet med en eneste kontrastmiddel /enkelt-energi CT-metoden.
Ex vivo
valideringsstudier ble utført for å demonstrere nøyaktigheten av
in vivo
kontrastmiddel kvantifisering av CT.
Metoder
Primære lungesvulster ble generert i
LSL-Kras
G12D; p53
FL /FL
mus. Gull nanopartikler ble injisert, fulgt av jod nanopartikler to dager senere. Gullet akkumuleres i tumorer, mens jod gitt intravaskulær kontrast. Tre dobbel-energi-CT-skanninger ble utført to og for det eneste kontrastmiddel fremgangsmåte og en for de to kontrastmidlet metode. Gull og jod konsentrasjonene i hvert scan ble beregnet ved hjelp av en dual-energi nedbryting. For hver metode, ble tumor fraksjonert blodvolum beregnet på grunnlag av jodkonsentrasjon, og tumor vaskulær permeabilitet ble beregnet på grunnlag av samlet gull konsentrasjon. For validering, ble CT-avledede målinger sammenlignet med histologi og induktivt koblet plasma optisk emisjonsspektroskopi målinger av gull konsentrasjoner i vev.
Resultater
Dual-energi CT aktivert
in vivo
separasjon av gull og kontrast jod midler og viste opptak av gull nanopartikler i milt, lever og svulster. Tumor brøk blodvolummålinger bestemt fra de to avbildningsmetoder var enige, og en høy korrelasjon (R
2 = 0,81) ble funnet mellom målt brøk blodvolum og histologi-avledet mikrovaskulær tetthet. Vaskulær permeabilitet målinger innhentet fra de to avbildningsmetoder enige godt med
ex vivo
målinger.
Konklusjoner
Dual-energi CT ved hjelp av to typer nanopartikler tilsvarer ett nanopartikkel metoden, men tillater måling av fraksjonert blodvolum og gjennomtrengelighet med en enkelt skanning. Som bekreftet av
ex vivo
metoder, CT-avledet nanopartikkel konsentrasjoner er nøyaktige. Denne metoden kan spille en viktig rolle i lunge svulst karakterisering av CT
Citation. Ashton JR, Clark DP, Moding EJ, Ghaghada K, Kirsch DG, West JL, et al. (2014) Dual-Energy Micro-CT Functional Imaging of Primary Lung Cancer in Mus Bruke gull og Jod partikler kontrastmidlene: En valideringsstudie. PLoS ONE 9 (2): e88129. doi: 10,1371 /journal.pone.0088129
Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 05.09.2013; Godkjent: 06.01.2014; Publisert: 10 februar 2014
Copyright: © 2014 Ashton et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra en National Institutes of Health /National Center for Forskning Resources National Biomedical Technology Resource Center stipend (P41 EB015897) (CTB), og fra National Cancer Institute U54 CA151668 (JLW). Annen støtte ble gitt av NIH /NCI R21 CA175839 og NIH /National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer K02 AI093866 (DGK). JRA er støttet av en medisinsk forsker Training Program Training Grant (T32 GM007171) og en Duke Institutional Fellowship. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. KG innehar opsjoner i Marval biovitenskap, et nystartet selskap forfølge utviklingen av en liposomal jodert CT kontrastmiddel. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, og antallet dødsfall tilskrevet til lungekreft er forventet å øke 50% innen 2020 [1]. Computertomografi (CT) er standard avbildning test for vurdering av pasienter med mistanke om lungekreft. Dessverre, ondartede og godartede lunge knuter viser ofte lignende radiografiske funksjoner i CT [2], så malignitet kan ikke alltid være riktig identifisert og behandlet. I Nasjonal Lung Cancer Screening Trial (NLCST), CT screening hos høyrisikopasienter redusert kreftspesifikk dødelighet lunge [3], og USA forebyggende Services Task Force har nylig anbefalt rutine CT lungekreft screening for høyrisikopasienter; men dette screening fører uunngåelig til påvisning av små lunge knuter ( 1 cm) som ikke er godt preget av tilgjengelige bildediagnostikk (PET, CT eller MR) [4]. Den NLCST viste seg at de fleste av disse knuter er ikke klinisk signifikant. Det er derfor et behov for å utvide informasjonen fra CT bildebehandling for nodule karakterisering, både for å karakterisere kjente svulster og for å differensiere nyoppdagede ondartede svulster fra godartede knuter.
En mulig metode for ytterligere svulst karakterisering er å studere lunge svulst blodkar. Angiogenese er en viktig faktor i kreft vekst og metastasering. Spesielt fremmer angiogenese tumorvekst ved tilførsel av tumorer med nødvendige næringsstoffer og tilveiebringer en kanal for metastatisk spredning. Tumor blodkar dannes ved hurtig angiogenese tendens til å være mindre godt organisert og mer gjennomtrengelig enn normalt blodkar [5]. Tettheten av tumor-karsystemet, som ofte er korrelert med graden av angiogenese, er relatert til tumor aggressivitet og kan korrelere med overlevelse [6]. Det er også bevis for at den grad av vaskularitet og vaskulær permeabilitet varierer mellom godartet og ondartet lungeknuter [7]; imidlertid mer omfattende studier, som er best utført på prekliniske nivå, er nødvendig for å belyse betydningen av disse vaskulære biomarkører i lungekreft.
Ved hjelp av prekliniske studier på mus, vi har tidligere vist at lat og aggressiv lunge tumorer kan differensieres ved hjelp av enkle energi mikro-CT og en jod-inneholdende liposomal (Lip-I) kontrastmiddel [8]. Økt akkumulering av nanopartikler (på grunn av økt vaskulær permeabilitet) ble vist i mer aggressive svulster i forhold til lat seg, mens vaskulær tetthet var lik i de to krefttypene. Den eneste kontrastmiddel eksperimenter kreves to CT atskilt av flere dager for å tillate fullstendig blod klarering av kontrastmidlet for å kvantifisere og skille vaskulære signal fra tumor akkumulering signal. Forsinkelsen mellom tidlig og forsinket fase bildebehandling kan ikke være nødvendig hvis vi vedta en mer elegant løsning med to forskjellige typer nanopartikler og CT bildebehandling metoder som spektral eller dual-energi (DE) CT.
DE bildebehandling er en avansert teknikk som nylig har steget i forkant av CT teknologi [9]. Absorpsjon av røntgenstråler av kontrastmidler er sterkt avhengig av både kontrastmidlet er atomvekt og energien av den innfallende røntgen. Således kan to materialer med forskjellig atomvekt skilles fra hverandre på grunnlag av deres unike dempningskoeffisienter ved to forskjellige røntgenstråle-energier. DE-CT muliggjør selektiv visualisering og kvantifisering av flere kontrastmidler i et enkelt scan. DE-CT har gjort betydelige fremskritt i klinisk kreft bildebehandling. For lungesvulster, har det vist seg at jod forbedring i kliniske DE-CT-skanninger kan korreleres med SUV
maks
18FDG- PET [10], [11], og viser at DE-CT har potensial å utvide CT bildebehandling utover det rent anatomisk avbildning til funksjonell og molekylær avbildning. Mens DE-CT viser høy løftet i klinikk for kreft bildebehandling, har det ikke vært stor grad vedtatt i prekliniske domene grunn av utfordringer knyttet til høyere romlig oppløsning, tidsmessig oppløsning, og støynivået i mikro-CT. Vi har imidlertid vært i stand til adressen noen av disse utfordringene og har vist at DE mikro-CT ved hjelp av nanopartikler som kontrastmidler kan spille en viktig rolle i preklinisk avbildning for hjerte [12], lunge [13], og kreft applikasjoner [14] [15].
partikler kontrastmidler er viktig for å prekliniske CT studier fordi konvensjonelle kontrastmidler er fjernet fra blodet for fort for effektiv bildebehandling. De prekliniske dyremodeller, spesielt mus, er i stand til å klare nedsatt molekylvekt kliniske kontrastmidler lavt fra blodet i løpet av sekunder (normal blodhalveringstid hos mennesker er 2-3 timer [16]), på grunn av deres ekstremt høye blodsirkulasjon. Nanopartikler som anvendes som CT-kontrastmidler har vanligvis en lang (mer enn 2 timer) halveringstid og har også en tendens til å hope seg opp i svulster på grunn av økt permeabilitet og retensjon (EPR) virkning [17]. Nytten av disse midlene i preklinisk CT bildebehandling har blitt godt etablert [14], [18] – [24]
Vi har nylig utviklet en DE mikro-CT metode for å skille gull og jod-baserte nanopartikler for. vaskulær avbildning i myke vev sarkomer [14]. I denne metoden, er gull nanopartikler injiseres og tillatt å akkumulere i tumorvev i to dager. Liposomal jod blir deretter injisert og umiddelbart etterfulgt av en DE-CT scan mens jod forblir intra. Vaskulær permeabilitet (rate av svulst nanopartikkel opptak) beregnes på grunnlag av målte gull konsentrasjonen i vev, mens blodvolum er beregnet ut fra konsentrasjonene vev jod. Dette arbeidet tar sikte på å bruke DE mikro-CT-metoden til den utfordrende oppgaven med bildebehandling lungesvulster for kvantifisering av tumorblodvolum og vaskulær permeabilitet. I denne studien, viser vi at de to kontrastmiddel (to-materiale) metoden, som krever bare en enkelt CT scan, sammenlignet med våre tidligere utgitt eneste kontrastmiddel (single-materiale), som krevde to CT fordelt flere dager bortsett [8]. Viktigere, vi tar også sikte på å validere våre
dual-energi resultater med
ex vivo
gull standard målinger in vivo. Så langt vi kjenner til, har det ikke vært noen publiserte kliniske eller prekliniske studier med streng validering av beregnede
in vivo
betydelige konsentrasjoner av DE-CT. DE målinger er vanligvis kalibreres ved hjelp av
in vitro
spøkelser, som omtrentlige, men ikke fullt ut representerer,
in vivo
forhold. Derfor er det potensial for betydelig feil i DE målinger når stole bare på in vitro fantom kalibreringer. I dette manuskriptet, forplikter vi
in vivo
validering, noe som er avgjørende for å videreutvikle DE-CT for prekliniske modeller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrene ble håndtert i tråd med god dyr praksis som definert av de relevante nasjonale og /eller lokale dyrevern organer, og alle dyr arbeidet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC protokollen A283-11-11) av Duke University Medical Center. The Duke University Medical Center dyr management program er akkreditert av American Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) og møter National Institutes of Health standarder som angitt i «Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr» (DHHS publikasjon nr (NIH) 85-23, revidert 1985). Institusjonen aksepterer også som obligatorisk PHS «Policy på Humane Stell og bruk av forsøksdyr ved prisvinner institusjoner» og «NIH Prinsipper for Utnyttelse og vedlikehold av virveldyr Brukes i Testing, forskning og opplæring.».
liposomal jod Fabrication
liposomalt jod ble produsert som beskrevet tidligere [25]. En lipid-blanding (200 mmol /l) som består av 1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DPPC), kolesterol, og 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-phosphoethanolamine-N- [metoksy ( polyetylenglykol) -2000] (DSPE-MPEG 2000) i en 55:40: 5 molart forhold ble oppløst i etanol og hydrert med en konsentrert oppløsning iodixanol (550 mg i /ml). Den resulterende lipid løsning ble sekvensielt ekstrudert på en Lipex Thermo ekstruder (Northern lipider, Vancouver, British Columbia, Canada) til størrelse liposomene til ~ 100 nm. Liposomet Løsningen ble diafiltrert ved anvendelse av en MicroKros® modul (Spectrum Laboratories, Milpitas, CA) for å fjerne un-innkapslet iodixanol.
Liposomal Jod Karakterisering
størrelsedistribusjonen av liposomer i den endelige formulering var bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) ved anvendelse av en Malvern Zetasizer Nanoseries (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) ved 25 ° C. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ble utført for ytterligere størrelsesanalyse og kontrastmiddel karakterisering. Liposomer var spot-tørket på en carbon film rutenett og avbildes ved hjelp av en FEI Tecnai G
2 Twin TEM (FEI, Hillsboro, Oregon) med en driftsspenning på 120 mV. Partikkel diameter ble målt til 200 liposomer som bruker ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH). Konsentrasjonen jod i den endelige liposomal oppløsningen ble kvantifisert ved måling av UV-absorbansen ved 245 nm ved hjelp av et Cary 50 spektrofotometer (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA).
In vitro
stabiliteten av liposomene ble bekreftet ved å måle frigivelse av iodixanol fra liposomene etter inkubering i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved 37 ° C i 72 timer. Konsentrasjonen av iodixanol løslatt etter inkubasjon ble bestemt av dialyse liposomene mot 500 ml PBS og måle UV-absorbans av dialyse i en kvarts kyvette.
Gold partikler Fabrication
Gull nanopartikler (AuNPs) ble fremstilt ved bruk av Frens metoden [26]. 500 ml av en 1 mM oppløsning av HAuCl
4 i ultrarent vann ble brakt til koking. En forvarmet løsning av 540 mg natriumcitrat ble oppløst i 3 ml vann ble hurtig injisert i gull-løsning, og den resulterende blanding ble omrørt kraftig. Fargen forandret seg fra gul til fargeløs til mørkerød i løpet av 30 sekunder. Reaksjonen ble fortsatt ved koking i 15 minutter, hvoretter reaksjonskaret ble fjernet fra varmekilden og får avkjøles med kontinuerlig omrøring i 1 time. Etter avkjøling ble de nanopartikler filtrert ved anvendelse av et 0,45 um-filter polyetersulfon. For å passivere de produserte nanopartikler, et stort overskudd av 5 kDa tiol-terminert polyetylenglykol (PEG; Laysan Bio, Arab, AL) ble tilsatt til de filtrerte nanopartikler, som deretter ble rystet ved romtemperatur i 4 timer. Ubundne PEG-molekyler ble fjernet og partiklene konsentreres ved anvendelse av en 100 kDa sentrifugalfilter.
gullpartikler Karakterisering
størrelsesfordelingen og overflateladningen av gullnanopartikler ble karakterisert ved DLS og zeta-potensial ved hjelp av en Malvern Zetasizer Nanoseries ved 25 ° C. DLS størrelsesfordeling ble bekreftet ved TEM hjelp av en FEI Tecnai G
2 Twin TEM opererer på 200 mV. Partikkel diameter og størrelsesforholdet ble målt til 200 AuNPs bruker ImageJ. Absorbans-spektra av AuNPs suspendert i ultrarent vann ble oppsamlet fra 400 til 650 nm ved hjelp av et UV-Vis-spektrofotometer. Stabilitet av de PEGylerte nanopartikler mot aggregering ble bekreftet ved å overvåke UV-Vis-spekteret i 6 timer etter tilsetning av fysiologiske saltoppløsninger av 0,9% NaCl eller Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) kulturmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS) til løsninger av nakne eller PEGylert AuNPs. Den endelige konsentrasjonen av gull i den konsentrerte AuNP oppløsningen ble bestemt ved UV-Vis-absorbans ved hjelp av publiserte ekstinksjonskoeffisient på 12 nm AuNPs ved 450 nm [27] og ble deretter korrelert med målinger fra induktivt koblet plasma optisk emisjonsspektroskopi (ICP-OES ), som beskrevet nedenfor.
In Vivo
tumor Imaging
lungesvulster ble generert ved intranasal injeksjon av adenovirus uttrykke Cre recombinase (Gene Transfer Vector Core, University of Iowa) i
LSL-Kras
G12D; p53
FL /FL
forbindelsen mutante mus som tidligere beskrevet [28] – [30]. Mus med primær lungesvulster ble brukt for avbildnings studien etter 12 uker etter Adeno-Cre-infeksjon, ved hvilket punkt flere aggressive lunge adenokarsinomer (~0.5-1.5 mm i diameter) var til stede i hver mus. Alle dyr ble fotografert ved 24-30 ukers alder. Totalt fem dyr ble brukt for avbildnings studien. På grunn av den langsgående natur denne studien, hver mus tjente som sin egen kontroll.
Langsgående DE mikro-CT-avbildning ble utført i alle dyr som vist i figur 1. Tre DE mikro-CT-skanninger ble utført for hvert musen for å sammenligne enkelt materialet metode (CT 1 og 2) med vår nye to-materialet metode (CT scan 3). Vi merker oss at, i motsetning til i vårt tidligere studium [14], DE-mikro-CT ble utført selv ved bruk av en enkelt kontrastmiddel, som tillot oss å måle gull konsentrasjon uten behov for en sammenligning skanning pre-kontrast. På dag 1, ble det AuNP kontrastmiddelet injisert intravenøst ved halevenen ved en volumdose på 0,32 ml /25 g kroppsvekt og etter injeksjon skanner (CT scan 1) ble umiddelbart anskaffet. Vi ventet 48 timer for å gi tilstrekkelig tid for gull opphopning å skje i svulstene. Etter denne forsinkelse (dag 3) en andre dobbel-energi CT-scan (CT 2) ble erholdt. Umiddelbart etter den andre skanne, ble det liposomale jod kontrastmidlet injiseres med halevenen ved en volumdose på 0,3 ml /25 g kroppsvekt, og et tredje dobbelt energi CT-scan (CT scan 3) ble utført. Etter den tredje skanningen ble musene avlivet og vev ble høstet for valideringsstudier, som beskrevet nedenfor.
AuNPs ble injisert på dag 1, etterfulgt umiddelbart av CT scan 1. To dager senere, CT scan to ble gjort , umiddelbart etterfulgt av Lip-I injeksjon og CT scan 3. Alle skanninger var dual-energi mikro-CT oppkjøp.
dual-Energy Micro-CT System
Et spesialtilpasset dual-kilde mikro-CT-avbildningssystem ble brukt for å studere [31]. Dyrene ble skannet mens fri pust under bedøvelse bruker 2-3% isofluran levert av nese-cone. Kroppstemperaturen ble opprettholdt med varmelamper, en rektal probe og en feedback-kontroller (Digi-Sense®, Cole Parmer, Chicago, IL). Prospektiv respiratorisk gating ble brukt for å minimalisere virkningene av animalsk respiratorisk bevegelse under skanning [32]. En pneumatisk pute plassert på dyrenes thorax koblet til en trykkomformer ble brukt til å overvåke puste. En LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) søknaden ble brukt til å overvåke luft signal og utløse x-ray-rør ved utgangen utløp ved å beregne en fast tidsforsinkelse fra toppen luft signal. Oppkjøp ble utført for både bildekjeder på hver rotasjonsvinkel med en 10 millisekunder forsinkelse mellom de to x-ray tube eksponeringer for å redusere risikoen for kryss scatter. Siden dette er en svært kort forsinkelse i forhold til lengden på den flate enden ekspirasjonsfase, betyr det ikke påvirke ytelsen til luft gating. Totalt 360 visninger ble kjøpt for hver bildekjede over 360 ° rotasjon. Hver prospektivt-gated scan tok ca 7 minutter å fullføre. Skanne parametere for dual-energi skanninger var: 80 kVp, 160 mA, 10 ms /eksponering for første bildekjede og 40 kVp, 250 mA, 16 ms /eksponering for andre bildekjeden. Den totale stråledosen i forbindelse med de tre CT var 0,39 Gy.
Post-prosessering og Dual-Energy Nedbrytnings
DE mikro-CT databehandling fulgt flytskjemaet i figur 2. Raw 40 kVp og 80 kVp datasett ble rekonstruert ved hjelp av Feldkamp algoritmen [33] i en matrise på 512 x 512 x 512 ved 88-um isotropisk voxel størrelse. Affine registreringen ble utført for å forbedre registreringen mellom tilsvarende 40 og 80 kVp rekonstruert volumer ved hjelp av maur, en åpen kildekode, ITK-basert registrering Toolkit (Avansert Normalisering Verktøy, https://picsl.upenn.edu/ANTS/, svn 1409 [ ,,,0],34], [35]). For å forbedre nedbryting, ble hvert datasett denoised bruker felles bilaterale filtrering (BF). Joint BF er en spektral utvidelse av godt karakterisert kant bevarende glatting filter som tar hensyn til fordelingen av nabo voksler i både plass og intensitet. Joint BF ble gjennomført ved hjelp av MATLAB (MathWorks, Natick MA), og generelt ferdig innen 15 til 20 minutter per sett av energier. Detaljer om bruk av felles BF overfor murine mikro CT data [36] og en kvantitativ vurdering av søknaden fra BF til DE mikro-CT [13] har blitt beskrevet tidligere.
Raw 40 kVp og 80 KVP datasett ble kjøpt, og da de gjennomgikk affine registrering og felles bilaterale filtrering for å produsere filtrert datasett. Dual-energi nedbrytning ble utført på følgende filtrerte bilder, noe som resulterte i to uavhengige bilder (maps) som representerer jod og gull-konsentrasjonen i hver voksel. Etter å ha oppnådd de to kartene, ble bilder over hverandre og benene ble segmentert ut (farget hvit) for å danne den endelige konsentrasjonen kartet overlegg. Disse bildene ble tatt fra CT scan 3, der både jod og gull var tilstede i blodet. Målestokk representerer 1 cm i alle bilder. De 40 og 80 KVP bildene vindus -300 til 1200 HU, er jod kart vindus 0,25 til 15 mg /ml, og gull kart er vindus 0,25 til 6 mg /ml.
DE nedbrytning av gull og jod ble utført etter registrering og filtrering, ved bruk av tilsvarende 80 og 40 kVp-filtrerte data, slik som beskrevet tidligere [14], [37]. For hver voksel, som er involvert i nedbrytning å løse et system av to ligninger med to ukjente, C
I og C
Au, som representerer konsentrasjonen av jod og gull, henholdsvis innenfor den gitte voksel. Den målte verdi CT dempning i hver voxel representerer en lineær kombinasjon av de ukjente gull og jod konsentrasjoner i mg /ml multiplisert med koeffisientene i CT følsomhet matrise som vist i de følgende ligninger:
Her C
i og C
Au er de ukjente konsentrasjoner av jod og gull, henholdsvis, i en gitt voksel, CT
40 og CT
80 er de målte dempninger i volumelementet ved 40 og 80 kVp, og CT
i, 40, CT
i, 80, CT
Au, 40, og CT
Au, 80 blir empirisk bestemt koeffisientene for den konstante følsomheten matrise for jod og gull på 40 og 80 kVp i målte dempningen (HU-enheter) per middelkonsentrasjon kontrast (mg /ml). De ukjente konsentrasjoner av jod og gull i hver voxel ble bestemt ved å invertere matrisen denne følsomhet og å finne den minste kvadraters løsning av det følgende system av ligninger i MATLAB:
Scanning energier for optimal gull og jod spalting ble valgt etter resultatene av våre tidligere simuleringer og
in vitro
studier [37]. Disse studiene viste at den maksimale spektrale forskjellen mellom gull og jod for polykromatisk røntgenkilder forekom ved en driftsspenning på 40 og 80 kVp. Verdier for koeffisientene i følsomhet matrisen ved hvert energi (CT
I, 40, CT
I, 80, CT
Au, 40, og CT
Au, 80) ble bestemt empirisk ved anvendelse av en kalibrering fantom som tidligere beskrevet [14]. For fantom kalibreringen, ble CT demping av ampuller av kjent gull og jod konsentrasjon målt ved 40 og 80 kVp, og koeffisientene for følsomhet matrise ble bestemt ved å tilpasse den kjente gull og konsentrasjoner jod til den målte CT dempningen ved hjelp av en lineær minste kvadraters regresjon på hvert energinivå. De utledede verdier for CT
I, 40, CT
I, 80, CT
Au, 40, og CT
Au, 80 anvendt i denne studien var 28,7, 42,6, 88,5, og 58,8 HU /mg /ml, respektivt. Etter nedbryting, ble vokslene med negative konsentrasjoner av begge materialer satt til null. Lydelementer med en negativ konsentrasjon av ett materiale, og en positiv konsentrasjon av det andre materiale som ble projisert på det positive underrom av konsentrasjon.
In vitro
validering av denne nedbrytning metode med både digitale og fysiske fantomer har vært vist i vårt tidligere arbeid [14]. Disse valideringsstudier viste evne til denne dekomponering metode for å måle gull og jod konsentrasjonene både når de er uavhengige av hverandre, og når de er til stede i det samme voksel.
Image Analysis
CT bildene ble analysert ved hjelp Avizo (FEI Visualisering Sciences Group, Burlington, MA). Regioner korresponderende til blodet (ventrikulære hulrom og store fartøy), og milten ble automatisk segmentert ved hjelp av 80 kVp datasettet, mens områder svarende til lever og nyrer ble halvautomatisk, segmentert ved hjelp av de samme datasettet. Hver segmentert region inkluderte hele organet, men utelukket store blodkar i orgelet. Tumorer ble segmentert halvautomatisk ved hjelp av gull kartet fra dual-energi spaltning. Røff regioner ble trukket manuelt utenfor grensene av svulsten, og disse regionene ble terskel å velge bare de lydelementer som inneholdt en gull konsentrasjon mellom 0,25 mg /ml og 3 mg /ml. Disse terskelverdier ble valgt for å utelukke normal lunge parenchyma, store blodkar, og ben fra de segmenterte tumorer. I alt 27 lungesvulster i 5 mus ble identifisert og segmentert i hver av de tre DE mikro-CT-skanning.
Følger segmentering, gull og jod konsentrasjonene ble målt i hver segmentert region av interesse ved å beregne gjennomsnittlig verdien av gull og jod kart over hele regionen av interesse. Fordi begge nanopartikler er lange halveringskontrastmidler, de forblir nesten helt innenfor blodkar umiddelbart etter injeksjon. Den fraksjonelle blodvolum (FBV) av hvert organ kan derfor anslås ved måling av gull eller jodkonsentrasjon i orgelet umiddelbart etter nanopartikkel injeksjon. Vi beregnet FBV på dag 1 ved hjelp av AuNPs og igjen på dag 3 ved hjelp av Lip-I. FBV ble beregnet ved hjelp av følgende ligninger: hvor C
Au, er day1 den gjennomsnittlige gullkonsentrasjonen i et vev umiddelbart etter gull injeksjon på dag 1, C
Au, blod, er day1 den gjennomsnittlige gullkonsentrasjonen i den segmenterte blod på dag 1, C
i, er day3 gjennomsnittskonsentrasjonen jod i et vev umiddelbart etter at Lip-i injeksjon, og C
i, blod, er day3 den gjennomsnittlige jod konsentrasjonen målt i den segmenterte blod på dag tre. FBV ble beregnet for hver enkelt segmentert tumor, milt, lever, nyre og ved begge tidspunkter. Denne beregnede FBV er et estimat av det vaskulære tettheten i vev, og var korrelert med mikrovaskulær tetthet beregnes ved å analysere bilder av histologiske vevssnitt, som beskrevet nedenfor.
Etter fastsettelse av FBV i hvert vev er konsentrasjonen av gull akkumulert i løpet av hvert vev ble beregnet. På grunn av sin lange blodhalveringstid, over halvparten av de injiserte kontrastmidlet forble i blodet på dag 3. Derfor vevet gull konsentrasjon målt i gull kart CT omfatter både gull som ekstravasert inn i vevet, og gull som forblir intravaskulær i vevet. Den FBV beregnede ovenfor kan brukes for å trekke den intravaskulære gullkonsentrasjonen i henhold til de følgende ligninger: hvor C
Au, er Akkum den akkumulerte (ekstravaskulære) gull-konsentrasjonen i en vev, C
Au, er tot total gull konsentrasjonen i et vev beregnet fra gull kartet CT på dag 3, C
Au, er iv konsentrasjonen av gull i et vev som forblir intravaskulær, og C
Au, er blod konsentrasjonen av gull i bulk blodet beregnet ut fra gull kartet CT på dag 3. Disse ligningene ble anvendt for å beregne den akkumulerte gull innenfor hver tumor og organ. For den eneste kontrastmiddel metoden, FBV fra CT scan 1 og gull konsentrasjoner fra CT scan 2 ble brukt i disse beregningene. For de to kontrastmiddel metoden, FBV og gull konsentrasjonene var både fra CT scan 3. For validering, ble disse samlet gull konsentrasjoner i forhold til konsentrasjoner av gull i hvert organ målt ved ICP-OES.
valideringsstudier
Tissue behandling.
prøver av blod, lungesvulster, og andre organer (nyre, lever, milt) ble ekstrahert fra alle mus for analyse. Blod ble trukket fra mus etter den første CT scan fra ansikts blodåre. En terminal blodprøvetaking og organhandelen ble utført etter den tredje CT scan. Hver mus ble satt under dyp anestesi ved en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital. Anestesi ble verifisert av tå klype. Bukhulen ble åpnet og blod ble trukket sakte fra den nedre vena cava mens hjertet ble fortsatt slo. 0,5-1,0 ml blod ble tatt fra hver mus, hvoretter den nedre vena cava, og aorta ble kuttet og det gjenværende blod ble tillatt å renne inn i bukhulen. Luftrøret ble deretter kanylert med en 20-gauge nål, gjennom hvilken en 01:01 blanding av cryoembedding medium (OCT) og 30% sukrose ble injisert inn i lungene for å fylle opp luft for senere vev snitting. Etter inflasjon med innstøpningsmediet, ble lungene fjernet fra musen og enten umiddelbart dissekert for lungesvulster eller innebygd i oktober og frosset på tørris. Lungesvulster som trekkes ut fra dissekerte Lungene ble dyppet i PBS i 5 minutter for å skylle bort gjenværende blod og deretter frosset ved -80 ° C i ICP-OES-analyse. Etter ekstraksjon lunge, ble lever, milt og nyrer av hver mus høstet og kuttet i to. Den første halvdelen av hvert organ ble umiddelbart integrert i oktober på tørris for seksjonering. Den andre halvdelen ble dyppet i PBS i 5 minutter og frosset ved -80 ° C i ICP-OES-analyse. Alle vev ble holdt frosset ved -80 ° C inntil de er klare for videre behandling.
Histologi.
8-um frosne tumorsnitt ble immunfarget for endotelial cellemarkør CD31. Før farging Snittene ble fiksert med 4% para-formaldehyd, vasket med PBS og blokkert med 10% FBS i PBS i en time. Snittene ble deretter inkubert med det primære antistoff (rotte-anti-mus CD31, BD Pharmingen) fortynnet 1:250 i blokkeringsbuffer i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket tre ganger med PBS i 10 minutter for å fjerne ubundet primært antistoff, hvoretter det sekundære antistoff (Alexa Fluor488-konjugert esel-anti-rotte-IgG, Invitrogen) fortynnet 1:500 i blokkeringsbuffer ble tilsatt og inkubert i 1 time i mørket. Kjerner ble kontra med DAPI. Noen få 8-um snitt ble også anvendt for hematoksylin og eosin (H & Co. E) farging. For H & Co. E-farging, ble prøver ble farget med hematoksylin, renset med vann og etanol, farget med eosin Y, deretter skylt med etanol og xylen og montert for mikroskopi
immunostained seksjonene ble fotografert ved hjelp av et Zeiss Axiovert 135 invertert.
