Abstract
Den proteolytiske aktiviteten til Furin ansvarlig for å behandle full lengde Notch-en (P300) spiller en avgjørende rolle i Notch signalering. Amplituden og varigheten av Notch aktivitet kan reguleres på forskjellige punkter i den bane, men det har ikke vært noen rapport angående regulering av Notch-1-Furin interaksjon, til tross for dens betydning. I denne studien fant vi at Notch-en-Furin interaksjon er regulert av ikke-reseptor tyrosin kinase, c-Src. c-Src og Notch-en er fysisk tilknyttet, og denne foreningen er ansvarlig for Notch-en behandling og aktivisering. Vi har også funnet at vekstfaktor TGF-α, en EGFR-ligand, og PDGF-BB, et PDGFR ligand, indusere Notch-1-Furin interaksjoner mediert av c-Src. Våre resultater støtter tre nye og provoserende konklusjoner: (1) Sammenhengen mellom Notch-en og Furin er en godt regulert prosess; (2) Ekstracellulær vekstfaktorsignaler regulere denne interaksjonen, som blir mediert av c-Src; (3) Det er krysstale mellom plasma vekstfaktor reseptor-c-Src og Notch veier. Ko-lokalisering av Notch-1 og c-Src ble bekreftet i xenograft tumorvev og i vev av bukspyttkjertelcancerpasienter. Våre funn har implikasjoner for den mekanismen som de Notch og vekstfaktor reseptor-c-Src signalveier regulerer kreftutvikling og kreft celle vekst
Citation. Ma YC, Shi C, Zhang YN, Wang LG, Liu H Jia HT, et al. (2012) tyrosinkinase-c-Src formidler Direkte Growth Factor-Induced Notch-en og Furin Samhandling og Notch-en aktivering i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (3): e33414. doi: 10,1371 /journal.pone.0033414
Redaktør: Laszlo Buday, ungarske Academy of Sciences, Ungarn
mottatt: 03.11.2011; Godkjent: 08.02.2012; Publisert: 30 mars 2012
Copyright: © 2012 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra National Natural Science Foundation of China (30873033 til YXZ) og Major State Basic Research Development Program (2009CB521800 og 2010CB529400 til YXZ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. FHS nå fungerer som redaktør for PLoS ONE. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen har den verste prognosen fra alle de store kreftformer og er fortsatt den fjerde vanligste årsaken kreftrelaterte dødsfall i USA og over hele verden [1]. Dette kan være på grunn av det faktum at ingen effektive metoder for tidlig diagnose er for tiden tilgjengelig, så vel som mangelen på effektive terapier. Det har blitt rapportert at den Notch signaleringsnett er ofte deregulert i humane ondartede sykdommer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, med opp-regulert ekspresjon av Notch-reseptorer og deres ligander [2]. Hakk signalering er involvert i celle-proliferasjon og apoptose, som påvirker utvikling og funksjon av mange organer.
hakk
gener koder for proteiner som kan aktiveres ved interaksjon med en familie av ligander [3] . Notch-1 er tilstede på celleoverflaten som et heterodimert molekyl (P120 /P200), mens den forløper protein (p300) sannsynligvis ikke når celleoverflaten og blir spaltet i P120 og P200 i trans-Golgi-nettet (TGN) etter furin (S1 spaltning) [4], [5]. Ligand binding induserer sekvensiell spalting av Notch-reseptorer, første spalting av det ekstracellulære domenet (ECD) av ADAM (en disintegrinproteinet og metalloprotease) proteinase TACE (S2 spaltning), og deretter av det transmembrane domenet av en γ-sekretase-enzym-kompleks (S3 spaltning), å frigjøre det intracellulære domenet (NiCd) [3], [6]. Denne sistnevnte deretter translocates til kjernen, hvor den knyttes til det DNA-bindende protein CSL (CBF1 /RBPJ-κ) for å regulere transkripsjon av flere effecter gener, inkludert medlemmer av HES /HEI familie [7]. Nylig, Lake m.fl. igjen vist en sammenheng mellom tap av spalting av Furin og tap av
in vivo
funksjon av Notch reseptoren, støtter forestillingen om at S1 cleavage er en
in vivo
mekanisme kontrollerende Notch-en signale [8]. Således, den proteolytiske aktiviteten er ansvarlig for P300 behandling spiller en avgjørende rolle i Notch-en signalering som den bestemmer strukturen av reseptoren. Det er imidlertid ikke klart om spalting av Notch av Furin er en stokastisk, eller tett regulere prosessen.
Vi skjermet flere kinase hemmere og fant at Src kinase hemmere hemmet Notch-en og Furin bindende. c-Src er et Mr 60.000 ikke-reseptor-tyrosin-kinase-produktet fra proto-onkogen c-Src, og den cellulære homolog av Rous sarcomavirus formerer protein, v-Src [10] (Ishizawar og Parsons, 2004). Oppsamling av bevis impliserer Src som en viktig determinant for tumorgenese, invasjon og metastase [9]. c-Src er overuttrykt i over 70% av pankreas karsinom-cellelinjer, og Src kinase-aktivitet er ofte forhøyet [10]. Dermed Src og Notch-en er viktige proteiner som påvirker bukspyttkjertelkreft cellevekst, invasjon og metastasering. I denne studien, vi har oppdaget direkte interaksjon mellom disse proteinene. Vi fant også at samspillet mellom Notch-en og Furin er ikke stokastisk, men heller godt regulert, ettersom c-Src binder til Notch-en og stimulerer Notch-en og Furin samhandling. Vi fant at binding av EGFR og PDGFR av sine ligander også stimulert Notch-en-Furin interaksjon, noe som indikerer at ekstracellulære vekstfaktor-signaler kan direkte regulere Notch-en aktivering i trans-Golgi-apparatet.
Resultater
1. Effekter av Src-hemmere på Furin-indusert Notch-en cleavage
For å undersøke hvilke kinase eller kinase familien er involvert i reguleringen av Furin-indusert Notch-en cleavage, ble flere kinase hemmere testet. Prolifererende BxPC-3 og VVS-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av PP2 eller SU6656, og ekstraktene ble underkastet elektroforese og blottet for deteksjon av Notch-1. Src kinase inhibitor PP2 redusert spalting av full lengde Notch-en mer enn to ganger. Etter forbehandling med PP2 i 20 minutter, 120 kD spaltningsproduktene av Notch-en minsket og i full lengde Notch-1-proteinet øket (figur 1A). Vi har også gitt en lettere eksponering av en tilsvarende Western blot i den nedre platen i figur 1A for å vise reduksjonen av det 120 kD spaltningsprodukt mer tydelig. PP2-indusert hemming av full lengde Notch-en cleavage ut til å være doseavhengig (data ikke vist).
(A) Src-hemmere PP2 og SU6656 induserer hemming av full-lengde Notch-en behandling av Furin i VVS bukspyttkjertelen kreftceller. HPAC celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS. Celler ble behandlet med 10 pM av PP2 eller SU6656 i 60 min. Western blot ble utført med anti-Notch-1-antistoff. Nedre felt, en reduksjon i Notch-1 /P120 ble vist i en lettere eksponering fra en tilsvarende Western blot. Notch-1 p300, FL full lengde Notch proteiner; Notch-en P120, kløyvde Notch proteiner. (B) Den EGFR ligand TGF-α induserer full-lengde Notch-en spaltning, som reduseres med c-Src-inhibitor PP2 i begge HPAC og BxPC3 bukspyttkjertelcancerceller. Celler ble serum-starvated i 48 timer, behandlet med 10 uM PP2 i 60 minutter, og deretter behandlet med 7 nM TGF-α i 20 min. Western blot ble utført med anti-Notch-1, fosfo-c-Src, c-Src og p-aktin-antistoffer. p-c-Src, fosfor-c-Src.
Selv om det er sant at PP2 selektivt hemmer Src kinaser, ved høyere konsentrasjoner, er PP2 også kjent for å inhibitor EGFR. Vi har utført dose-respons-forsøk og funnet at PP2 hemmer c-Src med en IC50 på 4 uM i HPAC celler (figur S1), men 10 uM PP2 bare hemmet EGFR-aktiviteten med 45%, noe som indikerer PP2 hemmer EGFR-aktivitet med en IC50 mer enn 10 uM i cellekultursystem (figur S2). Som 10 mm PP2 hemmet c-Src aktivitet med 77%, virker det PP2 hemmer Notch-en cleavage hovedsakelig gjennom c-Src, men ikke gjennom EGFR, selv om vi ikke kan utelukke possibilty at den direkte hemming av EGFR litt bidra til PP2 -indusert nedregulering av Notch-1-spaltningssetet. SU6656, som tilhører en annen strukturell klasse av Src-kinase-inhibitorer hadde en lignende virkning på Notch-1-spaltningssetet som PP2 (figur 1A).
Vi testet også hvorvidt vekstfaktor-indusert c-Src-aktivitet påvirker hakk en aktivering. Prolifererende HPAC og BxPC-3-celler ble sådd ut på standard vekstmedium i 24 timer og overført til serumfritt DMEM i 48 timer for å tillate reseptorer for å ekvilibrere på celleoverflaten. De ble deretter behandlet i 60 minutter med PP2 før stimulering med 7 nmol /L TGF-α. Etter 20 minutter ble hel-cellelysater fremstilt, og ekstraktene ble underkastet elektroforese og blottet for å detektere Notch-1, s-c-Src, og β-aktin. Figur 1B viser markert aktivering av c-Src i TGF-alfa-behandlede celler. Forbehandling av cellene med 10 uM PP2 i 60 minutter resulterte i nærheten av fullstendig inhibering av c-Src-fosforylering i alle cellelinjene som ble testet (figur 1B). I VVS og BxPC3 celler eksponert for TGF-α spalting av Notch-en økt ca to og tre ganger, henholdsvis, og disse økningene ble også hemmet av forbehandling med PP2 (figur 1B).
2. TGF-a øker CSL binding til Hes-en promoter
Etter påfølgende spalting av Furin, TACE og γ-sekretase, Notch-en NICD frigjøres fra plasmamembranen og transportert til kjernen hvor den knyttes til det DNA-bindende protein CSL (CBF1 /RBPJ-κ) og induserer transkripsjon av flere effektor gener, inkludert HMS-en. For å teste om TGF-α induserer binding av CSL til Hes-en promoter vi utført CHIP analyser. Før TGF-α behandling, ble en liten mengde av CSL CSL detektert på bindingssetet av Hes-1, og denne økte progressivt følgende TGF-α behandling i 30 og 60 min (figur 2A). For bedre å kvantifisere endringer i CSL binding til Hes-en promoter, utførte vi Q-PCR-analyser på chip prøvene. CSL binding til Hes-en igjen øket på 30 min og 60 min etter TGF-α behandling (figur 2B).
(A) CSL CHIP assay. HPAC celler ble dyrket i serumfritt medium i 48 timer, deretter behandlet med 7 nM TGF-α for 0, 30, 60 min. Kromatin prøver ble immunoutfelt med CSL antistoff, ble DNA ekstrahert og forsterkes ved hjelp av Hes-1 promoter primere for 35 sykluser av PCR. M, 100 bp DNA stigen. (B) Q-PCR-analyse chip DNA-prøver viser at TGF-α-indusert assosiasjon av CSL-en med den Hes-1-promoteren, noe som resulterer i omtrent 0,5, og 2- gangers økninger ved 30 min og 60 min tidspunkt hhv. Standardavvik er angitt (n = 3).
Vi har tidligere vist at overekspresjon NiCd øker kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og invasjonen [11]. I denne studien har vi gjort colonigenic analyse og fant at overekspresjon av aktive formen av Notch-en, Notch ekstracellulær trunkering (NEXT), betydelig økt HPAC celle kolonidannelse (Figur S3).
3. Effekter av c-Src-hemmere og vekstfaktorer på Notch-en og Furin samhandling
For å finne ut om c-Src påvirker Furin aktivitet, målte vi effekten av PP2 og SU6656 på Furin aktivitet i BxPC3 og VVS celler ved hjelp av en fluorescens-analyse. PP2 og SU6656 redusert bare Furin aktivitet med 30% (data ikke vist), som ikke kunne forklare 2-gangers reduksjon i Notch-1-spaltningssetet. Derfor tenkte vi at c-Src-hemmere kan påvirke samspillet mellom Notch-en og Furin. Vi behandlet celler med 10 mm PP2 eller SU6656 i 20 minutter og deretter utført immunoutfellingsstudier analyser for å se på sammenhengen mellom Furin og Notch-en. PP2 og SU6656 faktisk betydelig hemmet Furin-Notch-en binding (figur 3A). En kvantitativ densitometry for figur 3A er gitt i Figur S4. Ved en konsentrasjon på 10 mikrometer, PP2 og SU6656 redusert Furin-Notch-en forening med 53% og 43%, henholdsvis (figur S4).
(A) Src hemmer PP2 eller SU6656 hemmer Notch-en og Furin assosiasjon. HPAC celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS uten serum sult. Celler ble behandlet med 10 uM PP2 eller SU6656 i 60 min. Normal kanin-IgG ble anvendt som en negativ kontroll. En densitometry for figur 3A er gitt i Figur S4. (B) PDGF-BB induserer Furin og Notch-en interaksjon. Prolifererende HPAC celler ble serum-starvated i 48 timer, deretter behandlet med 20 ng /ml PDGF-BB i 20 min. Normal kanin-IgG ble anvendt som en negativ kontroll. (C) SU6656 hemmer PDGF-indusert Furin-Notch-en forening. Prolifererende HPAC celler ble serum-starvated i 48 timer, behandlet med SU6656 i 60 minutter, og deretter behandlet med 20 ng /ml PDGF i 20 min. SS, serum sult; PDGF, PDGF-BB; FBS, ble cellene dyrket i normalt medium, supplert med 10% FBS DMEM uten serum sult; Notch-1 P120, spaltes Notch proteiner; Notch-1 p300, FL Notch proteiner. (D) Den EGFR ligand TGF-α induserer Src-aktivering i Golgi. RFP-B4GLT1-transfekterte HPAC celler ble serum-starvated i 48 timer og deretter behandlet med 7 nM TGF-α. Cellene ble farget med anti-fosfor-Src (
grønn
) antistoffer til å visualisere samlokalisering av fosfor-Src (grønn) og RFP-taged TGN markør B4GALT1.
Bar, etter 10 mikrometer.
For å teste om vekstfaktor-indusert Src aktivitet påvirker Notch-en aktivering og Notch-en-Furin interaksjon, BxPC-3 og VVS cellene serum-sultet i 48 timer og deretter inkubert med 20 ng /ml PDGF-BB i 20 minutter. Resultatene i figur 3C avslører markert aktivering av c-Src i PDGF-BB-behandlede celler. I disse cellene ko-immunoutfelling av full-lengde Notch-1 med Furin øket mer enn 5 ganger (figur 3B). Den viktigste formen for Notch-1 assosiert med Furin var av full-lengde (figur 3B), i kontrast med Notch-en som samhandler med c-Src, som var overveiende P120 (Figur 4A). Behandling med 7 nmol /L TGF-α hadde en lignende virkning til PDGF-BB (data ikke vist).
(A) c-Src associatesd med Notch-1 i BxPC3 celler. Cellelysater ble immunoutfelt med anti-c-Src-antistoff, og immunoblotteding (IB) ble utført med anti-Notch-1 og anti-c-Src-antistoff. Normal kanin IgG ble anvendt som negative kontroller. (B) PP2 hemmer TGF-α indusert c-Src og Notch-en forening. Serum-starvated VVS-celler ble behandlet med 10 uM PP2 i 60 minutter, deretter behandlet med 7 nmol /L TGF-α i 20 min. Normale kanin IgG ble brukt som negative kontroller for IP. Celler dyrket i normalt medium (DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum) uten serum sult ble anvendt som positive kontroller. N, Normal medium. (C) SU6656 hemmer TGF-α-indusert c-Src og Notch-en forening. Notch-1 /P300, FL Notch proteiner.; Notch-1 /P120, kløyvde Notch proteiner. (D) forening av c-Src med Notch-en er avhengig av dets kinaseaktivitet. Villtype, Y416F, og Y527F smeltet sammen med en HA tag ble transient transfektert inn i HeLa celler. Hel-cellelysater ble deretter utarbeidet, immunopresipitert med anti-Notch-1-antistoffer, og immunoblottedting (IB) ble utført med anti-HA og anti-Notch-1-antistoffer. Normal kanin-IgG ble anvendt som en negativ kontroll.
Vi deretter testet effekten av c-Src-inhibitorer på PDGF-BB-indusert økning i Notch-1 og Furin binding. Forbehandling av celler med 10 pM PP2 eller SU6656 i 60 minutter resulterte i nesten fullstendig hemming av PDGF-BB-indusert økning i Notch-1 og Furin binding (figur 3C). Disse funnene tyder på at ekstracellulære vekstfaktor signaler mediert av c-Src indusere Notch-en og Furin bindende og aktivere Notch-en.
Det er godt akseptert at hele lengden Notch-en først cleavaged av Furin i TGN. Som vekstfaktor TGF-α og PDGF-BB induserer Notch-en-Furin interaksjon, spurte vi om vekstfaktor induserer c-Src aktivering i TGN. Vi transfektert VVS celler med RFP-taged B4GALT1 som TGN markør. Det ble vist at B4GALT1 er hovedsakelig lokalisert i den TGN, og til en viss grad, medial Golgi [12]. B4GALT1-transfekterte HPAC celler ble serum-starvated i 48 timer og 7 nM TGF-α ble tilsatt i 30 min. For å avgjøre om CSRC er aktivert i TGN, har vi sett på samlokalisering av fosfor-Src og B4GALT1 hjelp konfokalmikroskopi. Vi demonstrerte colocalization av RFP-taged B4GALT1 og fosfo-c-Src immunoreactivty i TGF-alfa-behandlede celler, men ikke i kontrollcellene (figur 3D). Resultatene indikerer at TGF-α induserer kunne fort c-Src aktivering i TGN.
4. c-Src knytter direkte med Notch-en
Vi spurte om c-Src kinase påvirker Notch-en aktivering direkte, eller virker indirekte gjennom andre effektorer. BxPC3 Cellene ble lysert og lysatet ble immunopresipitert med anti-c-Src-antistoff, og Notch-1 ble påvist ved Western blotting. Noen Notch-en, både full-lengde Notch-1 /P300 og Notch-1 /P120, var assosiert med c-Src (Figur 4A). Vi har også immunopresipitert Notch-1 og funnet betydelige mengder av c-Src i Notch-1 immunopresipitater (data ikke vist). Disse resultatene indikerer at c-Src fysisk forbinder med Notch-en.
Vi spurte om vekstfaktor-stimulerte c-Src aktivering kan føre til økt sammenslutning av c-Src og Notch-en. HPAC celler ble serum-sultet i 48 timer og deretter inkubert med 7 nmol /L TGF-α i 30 minutter. I celler behandlet med TGF-α, co-immunoprecipitation av både full-lengde Notch-en og Notch-1 /P120 med c-Src økt ca tre ganger, og ble hemmet av forbehandling med PP2 (figur 4B) eller SU6656 (Figur 4C ).
for å demonstrere at src kinase aktivitet er viktig for foreningen av c-src med Notch-en, genererte vi kinase døde og konstitutivt aktive src mutanter. Kinase aktivitet ble deaktivert av mutere den Y416 tyrosin nettstedet til fenylalanin (c-Src-Y416F), mens konstitutivt aktiv Src Y527F ble generert av mutere hemmende tyrosin 527 til fenylalanin. Vi har overuttrykt disse mutanter i HeLa-celler og vurderes evnen til de forskjellige c-Src-konstruksjoner for å assosiere med Notch-1. Notch-1 bundet til villtypen og konstitutive former av c-Src, men binding til kinasen døde mutant ble redusert mer enn tre ganger (figur 4D). Disse resultater viser at den kinase aktiviteten til c-Src er nødvendig for effektiv binding til Notch-1.
5. Samlokalisering av c-Src med Notch-en
in vivo
For å finne ut om c-Src og Notch-en co-Lokaliser
in vivo
, vi utførte farging . Colocalization av Notch-1 og c-Src immunreaktivitet kan ses fra gul fluorescens når bildene i Cy3-farget anti-Notch-1 og FITC-farget anti-c-Src immunoreaktiviteter ble slått sammen (figur 5A). Vi deretter testet for ko-lokalisering av HA-merket c-Src og endogen Notch-1. Vill-type HA-c-Src ble uttrykt i HeLa-celler. Confocal fluorescens mikroskopi avslørte samlokalisering av c-Src-HA og Notch-en (figur 5B), og uttrykk for FLAG-merket NEXT i HeLa-celler viste samlokalisering av NESTE-FLAG og c-Src (figur 5C).
(A) Intracellulær interaksjon av c-Src og Notch1. c-Src og Notch-en ble visualisert med en konfokalmikroskop.
Bar,
10 mikrometer. (B) Co-lokalisering av HA-merket c-Src og Notch-1. VVS celle ble transfektert med pcDNA3-c-Src-HA plasmid, og co-farget med anti-Notch-en (
rød
) og anti-HA (
grønn
) antistoffer til å visualisere endogen Notch-1 og HA-merket c-Src, respektivt.
Bar,
10 mikrometer. (C) Co-lokalisering av endogen c-Src og FLAG-merket Notch ekstracellulære trunkering (NEXT) fragment. VVS celle ble transfektert med pcDNA3-next-FLAG plasmid, co-farget med anti-c-Src (
rød
) og anti-FLAG (
grønn
) antistoffer for å visualisere endogen c-Src og FLAG-merket Notch-en NEXT fragment, hhv.
Bar,
10 mikrometer.
6. Protein domener som er involvert i c-Src-Notch-en bindende
c-Src består av SH3, SH2 og kinase domener som har evne til å binde forskjellige proteiner har blitt karakterisert. Vi har uttrykt en serie av c-Src-delesjonsmutanter i HeLa-celler for å identifisere regioner som er nødvendige for forbindelse med Notch-1 (figur 6A). Assosiasjon med Notch-1 ble redusert dersom kinase-domenet av c-Src ble slettet (figur 6B). I kontrast, gjorde sletting av SH3 eller SH2 domenet ikke markert påvirke tilknytning Notch-en (figur 6B). For å avgjøre om c-Src KD domenet er tilstrekkelig for interaksjon med Notch-en, utførte vi immunoprecipitation og Western blot analyser med en c-Src KD-HA fusjonsprotein i HeLa cellelysatene. Notch-1 bundet spesifikt til c-Src KD, men ikke til c-Src SH3-domenet, og bare svakt til SH2 domene (figur 6B). Således synes det KD domene er nødvendig og tilstrekkelig for c-Src interaksjon med Notch-1.
kinase domene av c-Src bindes til Notch-1. (A) Skjematisk representasjon av konstruksjonen av c-Src-delesjonskonstruksjonene. (B) Den KD domenet av c-Src binder til Notch-en
in vitro
. De angitte fragmenter av c-Src ble smeltet til en HA-koden og transient transfektert inn i HeLa celler. Hel-celle-lysatene ble så fremstilt, immunopresipitert med anti-HA-antistoffer, og immunoblotteding (IB) ble utført med anti-Notch-1 og anti-HA-antistoffer. Normal kanin-IgG ble anvendt som en negativ kontroll. (C) Co-immunoprecipitation av FLAG-merket Notch-en NEXT og HA-merket c-Src. (D) Skjematisk fremstilling av oppbygningen av Notch-1 sletting konstruksjoner. (E) Den ankyrin gjenta domene av Notch-1 bindes til c-Src. De angitte fragmenter av Notch-en ble fusjonert til en FLAG tag og transient transfektert inn i HeLa celler. Hel-cellelysater ble deretter utarbeidet, immunopresipitert med anti-FLAG antistoffer, og immunoblotteding (IB) ble utført med anti-FLAG og anti-c-Src antistoffer. Normal kanin-IgG ble anvendt som en negativ kontroll. (F) Notch-1 er tyrosin-fosforylert. Notch-1 ble immunopresipitert med anti-fosfo-tyrosin Ab 4G10. Hel-celle-lysater av HPAC ble fremstilt, og immunopresipitert med anti-fosfo-tyrosin (4G10), og anti-Notch-1-antistoffer, og immunoblotteding (IB) ble utført med anti-Notch-1. Normal kanin-IgG ble anvendt som en negativ kontroll. (G) Påvisning av tyrosinfosforylering med anti-Notch-1 immunpresipitatene. Øvre panel: Hel-cellelysater av VVS ble immunopresipitert med anti-IgG og anti-Notch-1-antistoffer. Immunopresipitatene ble utsatt for immunblotting-analyse med anti-fosfotyrosin-antistoff 4G10. Nedre felt, det samme blott ble strippet, og påvist med anti-Notch-1-antistoff. (H) Src-inhibitor SU6656 eller PP2 senker fosfo-tysosine-assosiert Notch-1. Hel-celle-lysater av HPAC ble immunopresipitert med anti-IgG og anti-fosfotyrosin-antistoff 4G10. Immunpresipitatene ble utsatt for immunblotting analyse med anti-Notch-en.
Vi har også co-transfektert FLAG-merket Notch-en NEXT og HA-merket c-Src i HeLa celler. Våre resultater viser at NEXT er forbundet med HA-merket c-Src (figur 6C).
Vårt funn at både full-lengde Notch-en (P300) og kløyvde Notch-en (P120) forbinder med c- src indikerte at Notch-1 intracellulært domene (NiCd) har en c-src-bindingssete. For å identifisere domene (r) av Notch-1 er ansvarlig for c-Src-binding, genererte vi delesjonskonstruksjoner av NiCd (figur 6D), og utført ko-immunoutfelling analyser med anti-FLAG tag og c-Src-spesifikke antistoffer. Resultatene viser at den ankyrin gjenta (ANK) -deletion mutant hadde en sterkt redusert bindingsaffinitet for c-Src, noe som tyder på at den ANK domenet av Notch-1 er ansvarlig for binding til c-Src (figur 6E). Derfor Notch-en og c-Src førsteamanuensis via ANK domenet Notch-1 og KD domene av c-Src.
For å teste om Notch-1 er fosforylert på tyrosin rester, immunopresipitert vi VVS cellelysater med anti-fosfo-tyrosin-antistoff 4G10, og detektert Notch-1 ved Western blotting. Noen Notch-1 /P120 var til stede i immunpresipitatet (figur 6F). Vi har også immunopresipitert VVS cellelysater med anti-Notch-1 antistoff og oppdaget tyrosin-fosforylering med 4G10 anti-fosfor-tyrosin antistoff. Både Notch-1 /P300 og Notch-1 /P120 ble fosforylert på tyrosin (figur 6G). Vi behandlet HPAC celler med 10 pM SU6656 eller PP2 i 30 minutter, og immunoutfelle cellelysatet med anti-fosfo-tyrosin-antistoff 4G10, så detektert fosfo-tyrosin-assosiert Notch-1 (figur 6 H). Vi fant ut at SU6656 eller PP2 markert redusert fosfor-tyrosin-forbundet Notch-1 (figur 6 H). Resultatene indikerte at Notch-1 er potensielt fosforylert av c-Src.
7. Samlokalisering av c-Src og Notch-en i xenograft bukspyttkjertelkreft modell
For å se om systemisk behandling med PP2 kan påvirke Notch-1-c-Src samhandling i xenografttumorer
in vivo
etablerte vi VVS menneskelige kreft i bukspyttkjertelen transplantater i nakne mus. Når HPAC grafts hadde utviklet seg til palpable tumorer (200 mg), ble PP2 gitt ved 4 mg /kg som s.c. injeksjoner for totalt 8 injeksjoner annenhver dag. PP2 behandling reduserte tumorvekst (
P
= 0,0007 i forhold til kjøretøy) sammenlignet med ubehandlede kontroller. (Figur 7A B)
(A) Effekter av PP2 på tumorvekst av HPAC kreft i bukspyttkjertelen xenografter i flankene av nakne mus. En representant bilde av en mus fra hver gruppe vises., Med svulster som ligger i flankene. (B) Redusert veksten av xenografter av HPAC bukspyttkjertelcancerceller i immundefekte mus på grunn av PP2 behandling. Tumorvolumene var 200-300 mm
3 ved begynnelsen av medikamenter behandling. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD av tumorvolumer. Forskjellen mellom DMSO og PP2 gruppene var statistisk signifikant (
P
0,01; n = 10). (C) Svulster ble resected og behandlet, og lysbildene ble farget med H E. (D) Immunhistokjemisk farging i VVS tumorxenotransplantater. Svulster ble resekterte og behandlet, og objektglassene ble farget med antistoffer til c-Src (rød), Notch-1 (grønn), og DAPI (blå). Lokalisering av c-Src og Notch-1, ble visualisert ved hjelp av en konfokal microscopye. co-Lokaliser vises
gul
i overlegget.
Bar,
10 mikrometer. (E) Andelen frekvens av rød-grønn ko-lokalisering i DMSO og PP2-behandlede tumor vev (antall celler med gul farge /totale antallet celler med blå farge i fig. 7D), ble målt med programvaren bilde- Pro Plus programvare.
Hematoxylin og eosin-farget deler av xenografttumorer er vist i figur 7C. Merk atom pyknosis og ødem sett i PP2-behandlede tumor. Farging av seriesnitt avslørte samlokalisering av c-Src og Notch-1 immunoreaktivitetene i xenograft svulstvev (øvre panel, figur 7D), noe som tyder på en positiv korrelasjon mellom c-Src og Notch-en aktivering i enkelte kreftceller. Behandling med PP2 betydelig redusert ko-lokalisering av Notch-1 og c-Src (figur 7D), frekvensen av rød-grønne ko-lokalisering var mye lavere enn i kontrollgruppen (6 ± 1,5 versus 15,4 ± 4,6%;
P
0,01, n = 10;. Figur 7E)
Diskusjoner
Selv om spalting av Notch-en på S1 nettstedet ved Furin er nødvendig for Notch-en aktiverings mekanismen styrende Notch-en-Furin foreningen var ikke klart. I den foreliggende studien demonstrerte vi at Notch-1-aktivering er regulert av en tyrosinkinase. Vi har også vist at c-Src er fysisk forbundet med Notch-1; c-Src interagerer med Notch-1 via dens KD domene, og det kinase-aktivitet er nødvendig for effektiv tilknytning av c-Src med Notch-1. Ekstracellulære vekstfaktorer synes å direkte regulere Notch-en cleavage på proteinnivå via c-Src.
Direkte krysstale mellom vekst reseptor-c-Src og Notch sti
Src-familie kinaser (SFKs) er ikke reseptorene kinaser overuttrykt i de fleste bukspyttkjertel kreft og er involvert i kreft progresjon og metastase [9]. Hemming av disse kinaser har vist lovende i prekliniske kreft modeller. Våre resultater tyder på at Notch-1 og c-Src-proteiner er fysisk tilknyttet og at denne assosiasjonen medierer Notch-1-bearbeiding og aktivering. Det har blitt rapportert at Notch-en er forbundet med serin /treonin-kinaser GSK3beta og CDK8 [13], [14]. Våre resultater indikerer at Notch-en er også regulert av en tyrosin kinase.
Notch-en er potensielt en nedstrøms effektor av EGFR /PDGFR i kreft i bukspyttkjertelen celler
EGFR signal påvirker mange aspekter av svulst biologi, inkludert spredning, invasjon, spredning og apoptose [15]. Aktivering av EGFR forbedrer tumorvekst, invasjon, og sprer seg; det hemmer også apoptose. Flertallet av bukspyttkjertel kreft overuttrykke EGFR, og dette har blitt korrelert med langt fremskreden sykdom ved presentasjon og redusert median overlevelsestid [16]. EGFR produserer sin virkning på ondartede celler via autokrine og parakrine sløyfer og har blitt vist å binde TGF-α og EGF. EGFR er så autofosforyleres og transphosphorylated på tyrosinrester, noe som resulterer i sin tilknytning til adapter og signalmolekyler, og som fører til aktivering av flere intracellulære signalkaskader, inkludert de som omfatter Src, AKT og ras /MAPK1 /2 [15].
PDGFR-α og PDGFR-β er strukturelt lignende reseptor-tyrosin-kinaser aktiveres ved hjelp av blodplate-avledet vekstfaktor [17]. PDGF induserer cellevekst, overlevelse [18] og transformasjon [19]. Aktivering av PDGFR i tumorer kan også skje gjennom autokrin eller parakrin stimulering som både tumor- og normale celler i stroma utskiller PDGF. Over-ekspresjon av PDGFR har blitt funnet i bukspyttkjertelkreft [20]. Som EGFR, PDGFR fører stimulering til aktivering av intracellulær signalisering, særlig av Src, AKT, og ras /MAPK1 /2.
Vi har tidligere observert at over-ekspresjon av Notch-1 intracellulært domene (NiCd) øker bukspyttkjertelkreft cellevekst, og banket ned Notch-1 inhiberer cellevekst [11]. I denne studien fant vi at overekspresjon av Notch-en øker koloni dannelsen av VVS bukspyttkjertelen kreftceller. Vi har vist ovenfor at aktivering av enten EGFR eller PDGFR stimulerer Notch-1-aktivering, som blir mediert av c-Src. Således spiller Notch-en aktiverings en viktig rolle i veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler, og i celleformering stimulert ved aktivering av EGFR eller PDGFR.
I en tidligere rapport har vi funnet at nedregulering av Notch-1 redusert celle invasjon, mens Notch-1 overekspresjon av cDNA-transfeksjon ført til økt tumorcelle-invasjon [11]. Vi har også funnet at nedregulering av Notch-en redusert NF-kB-DNA-bindende aktivitet og ekspresjonen av matriks-metalloproteinase-9 (MMP-9) og VEGF [21]. Således kan Notch-1 virker som en nedstrøms effektor av EGFR /PDGFR aliserte opp-regulering av MMP-9 og VEGF ekspresjon, og stimulerende celle invasjon og metastase. Kolonner, mener;
