Abstract
Interleukin-23 (IL-23) er en konvensjonell proinflammatorisk cytokin som spiller en rolle i tumor progresjon ved å fremkalle betennelse i svulsten mikromiljøet. Imidlertid er rollen til IL-23 i skjoldbruskkjertelen migrering og invasjon er fortsatt uklar. I den foreliggende undersøkelse, observerte vi at behandling med IL-23, induserte migrering og invasjon i humane cancerceller i skjoldbruskkjertelen. Ytterligere data viser at
SOCS4
regulerer negativt IL-23-mediert migrasjon og invasjon. Ved å undersøke mekanismene som er involvert i IL-23 mediert migrering og invasjon, observerte vi at MIR-25 fremmer migrering og invasjon av skjoldbruskkjertel kreftceller ved direkte binding til det 3′-UTR av
SOCS4
som fører til hemming av
SOCS4
. I tillegg har vi også vist at IL-23 øker MIR-25 uttrykk nivåer, og overexpressed MIR-25 er involvert i IL-23-assosiert
SOCS4
hemming og celle migrasjon og invasjon. Sammen våre data tyder på at IL-23 induserer migrasjon og invasjon i skjoldbruskkjertelen kreftceller ved å formidle Mir-25 /
SOCS4
signalveien
Citation. Mei Z, Chen S, Chen C Xiao B, Li F, Wang Y, et al. (2015) Interleukin-23 Forenkler skjoldbrusk kreft celle migrasjon og invasjon ved å hemme
SOCS4
Expression via mikroRNA-25. PLoS ONE 10 (10): e0139456. doi: 10,1371 /journal.pone.0139456
Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, KINA
mottatt: 19 juni 2015; Godkjent: 12 september 2015; Publisert: 05.10.2015
Copyright: © 2015 Mei et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No.81372880); Independent forskningsprosjekt fra Wuhan University (No. 2042014kf0184, NO 2042014kf0119.); doktorgradsprogrammet of Higher Education Research Fund (nr 20130141120093, nr 20110141110062); Foundation Natural Science of Hubei-provinsen (No.2012FFA045). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid kreft er en vanlig type endocrine malignitet som har vist en rask økning i verdensomspennende forekomst i løpet av de siste tiårene [1]. Til tross for forbedringer i terapeutiske strategier, noen pasienter er vanskelige å behandle og utvikle invasjon og metastase [2]. Derfor er det viktig å identifisere de molekylære mekanismer som ligger under tyreoideacancer invasjon og metastase. Nye rapporter viser at betennelse er en sterk pådriver for kreftutvikling og malignitet i mange former for kreft [3,4]. Betennelse synes å være en viktig mediator for utvikling av kreft og gir kreftcellene en gjestmikro [5]. Interleukin-23 (IL-23), et heterodimerisk type 1 cytokin som består av IL-12 /P40-subenheten og den spesifikke p19 subenheten, hører til den interleukin-6 superfamilien [6]. Tidligere studier har vist at IL-23 er forbundet med karsinogenese samt betennelse. Høye nivåer av IL-23 ble funnet i menneskelige leverkreft, tykktarmskreft, plateepitel karsinom, og spiserørskreft [7-10]. Tyder på at IL-23 overekspresjon kan indusere metastaser i kolorektal, lunge, og oral cancer [7-10].
undertrykkere av cytokin signalering (SOCS) er viktige negative tilbakemeldinger regulatorer av cytokin signale [11]. De farlige stoffene proteiner er en familie på 8 proteiner (SOCS1-7 og et cytokin-induserbar SH2-holdig protein eller CIS). Hver SOCS protein inneholder en sentral SH2-domene som samhandler med fosforylerte tyrosinene [12]. Socs proteiner har nylig blitt undersøkt for sin rolle i utviklingen av ulike kreftformer [13-18]. Men lite er kjent om rollen SOCS4 i karsinom, og deres mulige innvirkning på tumorvekst og malignitet.
microRNAs (mirnas) er en art av små ikke-kodende enkeltrådet RNA som spiller en viktig rolle i utviklingen av forskjellige kreftformer ved å binde den 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av målrettede gener [19]. Avvikende miRNA uttrykket har også vært hyppig rapportert i en rekke svulster [20]. I de senere årene har flere bevis punkt til en rolle for mirnas i tumorcellebiologiske prosesser, herunder celleproliferasjon, differensiering, migrering og invasjon [21]. MikroRNA-25 tilhører MIR-106b-25 klynge som inkluderer MIR-106b, MIR-93, og MIR-25. MikroRNA-25 er blitt rapportert å være avvikende overuttrykt i mange tumorer, slik som eggstokk-kreft, lungekreft, magekreft, tykktarmskreft og [22-26]. Selv om uttrykket av MIR-25 i ulike svulstene har blitt beskrevet, en klar rolle for MIR-25 i skjoldbruskkjertelen carcinoma er fortsatt uklart.
I denne studien, viser vi at IL-23 fremmer skjoldbrusk kreft celle migrasjon og invasjon . Vi viser videre at IL-23 regulerer migrasjon og invasjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller via en MIR-25 /SOCS4 signalveien.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
All deltakerne ga skriftlig informert samtykke til å delta i studien. Studien ble gjennomført i henhold til prinsippene i Helsinkideklarasjonen og godkjent av Institutional Review Board av Remin Hospital of Wuhan University, i tråd med sine retningslinjer for beskyttelse av mennesker.
Prøver og saker
Thyroid vev var samlet på Remin Hospital of Wuhan University fra februar 2010 til februar 2014. Vevsprøver ble kuttet i to deler, en ble anmeldt av to dyktige patologer å verifisere histologisk diagnose, den andre umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen, og lagret i flytende nitrogen inntil RNA-ekstraksjon. Ingen av pasientene hadde fått noen preoperativ behandling. Svulster ble iscenesatt i henhold til den amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) patologisk tumor node-metastaser (TNM) classiication. Karakteristikken av pasienter er beskrevet i S1 og S2 bord.
Cell kultur
Menneskelig skjoldbrusk kreft cellelinjer K1 (papillær) og WRO (follikulær) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco BRL), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin sulfat. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Alle disse cellelinjene ble opprinnelig kjøpt fra cellen bank av den kinesiske Academy of Science, Shanghai
Reagenser
Rekombinant humant IL-23 (rhIL-23) ble kjøpt fra R . D Systems ( Minneapolis, MN). Monoklonale antistoffer (ABS) mot menneske SOCS4 og GAPDH ble kjøpt fra Sigma (St Louis, MO). Kjemisk syntetisert miRNA etterligner og miRNA-hemmere ble kjøpt fra Ambion (Austin, Texas, USA). TRIzol, Lipfectamine-2000, Enzyme MIX ble kjøpt fra Invitrogen (Basel, Sveits).
Kvantitativ Real Time PCR
Kvantitativ Real Time PCR-analyse ble utført for å bestemme modne miRNA og mRNA nivåer. For kvantitativ modne microRNAs påvisning ble totalt mirnas isolert ved hjelp av en Mirvana miRNA isolasjon kit (Ambion), i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA (2 mikrogram) ble reversetranscribed med Bulge-Loop modent miRNA-spesifikke revers transkripsjon primere (ambion) og Moloney murine leukemia virus revers transkriptase (Promega). Kvantitativ Real-time PCR-basert kvantifisering av miRNAs ble utført ved hjelp av miRNA analyse sett (Ambion), i henhold til produsentens instruksjoner. Nivåene av mirnas ble normalisert til de av den interne kontrollen U6 snRNA. For å oppdage cellulære mRNA, ble totalt RNA isolert ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Basel, Sveits). Cellular RNA prøver ble revers-transkribert ved hjelp av tilfeldige primere. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en LightCycler 480 (Roche) og SYBR Grønn system (Applied Biosystems). GAPDH ble amplifisert som en intern kontroll. Anvendte primerene denne undersøkelse er oppført i Tabell S3 og SYBR grønne produkter verifisert ved sekvensering.
Transwell assay
Cell migrering og invasjon assay ble utført som beskrevet tidligere [27]. I korte trekk ble celler behandlet med enten 50 ng /ml rhIL-23 eller BSA-buffer for kontroll beskrevet tid og dosering og observeres deretter. Gjennomsnittlig antall trekkende og invaderende celler ble uttrykt som en prosent i forhold til kontrollgruppen, ble betegnet som 100%.
lukking av sår assay
A sår ble innført på de sammenflytende monolag celler ved hjelp en mikropipette tips. Bildene ble tatt ved 40 X forstørrelse ved hjelp av fasekontrastmikroskopi umiddelbart etter såret snitt og på utvalgte tidspunkter. Sårheling ble målt ved å beregne pikseltetthet i såret området av Cella programvare (Olympus Biosystem Gmb, Hamburg, Tyskland) og uttrykt som prosentandel for sårheling av tredoble områder ± SD.
MTT analyse
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay ble brukt i evaluering av celler proliferasjon. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved 5 x 10
3 celler /brønn. Tjuefire timer senere ble MTT analyse utført. Til slutt ble den optiske tetthet ved 570 nm bestemt ved å bruke ELISA-plateavleser (modell 550, Bio-Rad). Minst tre uavhengige eksperimenter ble sikret.
Transfeksjon og luciferase reporter assay
Cellene ble sådd ut på 24-brønners eller 6-brønners skåler, avhengig av forsøket, og ble dyrket til sammenløpet når omtrent 80-90% ved tidspunktet for transfeksjon. -Celler ble transfektert ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til protokollen gitt av produsenten. En Renilla luciferase reporter vektor PRL-TK ble brukt som intern kontroll. Luciferase-analyser ble utført med et dobbelt-spesifikt luciferse assay kit (Promega, Madison, WI). Ildflue luciferase-aktivitet ble normalisert på basis av Renilla luciferase-aktivitet. Alle rapportør analyser ble gjentatt minst tre ganger. Viste data var gjennomsnittsverdier ± SD fra en representant eksperiment.
RNA interferens
SOCS4 shRNA og irrelevant shRNA kontroll (shRNA-kontroll) ble kjøpt fra GenePharma (GenePharma, Shanghai) og utarbeidet av ligation av de tilsvarende par av oligonukleotider til PGPU6 /GFP /Neo. Målsekvensen kan bli funnet i S4 tabell.
Western blot-analyse
Whole-cellelysater ble fremstilt ved å lysere cellene med PBS pH 7,4 inneholdende 0,01% Triton X-100, 0,01% EDTA, og 10% proteasehemmer cocktail (Roche, Applied Science). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-analyse (Bio-Rad). Polypeptidene fra cellelysatene ble separert på SDS 12% polyakrylamidgeler tverrbundet med N, N -methylenebisacylamide, og overføres elektrisk til nitrocellulosemembraner (Millipore, Billerica, Massachusetts). Ikke-spesifikk binding ble blokkert med 5% melk i PBST før tilsetning av primære antistoffer brukt i denne studien. Pepperrot peroksidase-koblet anti-kanin og anti-muse-antistoffer (Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt som sekundære antistoffer. Protein nivåer ble kvantifisert ved å skanne blotter på en Gel Doc EZ imager (Bio-Rad) og analyse med nummer én 1D bildeanalyse programvare 4.4.0 (Bio-Rad)
Statistisk analyse
Statistisk analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5-programvaren (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Parametriske og metriske data ble analysert ved hjelp av en to-tailed t-test og Mann-Whitney U test hhv. En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. eller gjennomsnitt ± SEM
Resultater
IL-23 fremmer migrasjon og invasjon av skjoldbrusk kreft celler
Vi ønsket å teste effekten av IL-23 på cellen spredning av thyroid kreft celler for å observere om celleproliferasjon forstyrrer migrering og invasjon kapasitet av cellene. MTT-analysen viste at spredning av K1-celler og WRO celler ble nesten ikke påvirket av noen dose av IL-23 (fig S1). Vi neste undersøkt om IL-23 kan påvirke migrasjon og invasjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller. Forbedret bevegelse og invasjon av K1-celler ble detektert i nærvær av 50 og 100 ng /ml IL-23 (figur 1A og 1B). Tilsvarende økte migrering og invasjon ble også påvist så tidlig som 48 timer (h) etter behandling med 50 ng /ml IL-23-protein (figur 1C og 1D). Vi har også vist at IL-23 økte migrering og invasjon av WRO celler i en dose- og tidsavhengig måte (fig S2). I tillegg sårheling analysen viser også at IL-23 økte migrering av K1-celler (figur 1E og 1F). Til sammen bekrefter disse resultatene den dose- og tidsavhengige promigratory og proinvasive effekt av IL-23.
(A) K1-celler ble behandlet med rhIL-23 i 48 timer ved de angitte konsentrasjoner, fulgt av dyrkning i et transwellsystem i 24 timer. (B) Cell invasjons assay-eksperimenter ble utført med K1-celler som ble behandlet som i (A). (C) K1-celler ble behandlet med en konsentrasjon på 50 ng /ml rhIL-23 for å få de angitte tidspunkter, etterfulgt av dyrkning i et transwellsystem i 24 timer. (D) Forsøkene ble utført som i (C) for den celle invasjon analysen. (E) K1-celler ble behandlet med rhIL-23 i 48 timer ved de angitte konsentrasjoner, fulgt av innføring av et sår. Cellemigrering inn i såret ble målt ved 24 timer. (F) K1-celler ble behandlet med en konsentrasjon på 50 ng /ml rhIL-23 for å få de angitte tidspunkter, etterfulgt av innføring av et sår. Cellemigrering inn i såret ble målt ved 24 timer. Lukking av sår ble målt ved å beregne pikseltetthet i sårområdet, og uttrykt som prosentandel av sårlukking av triplikate områder ± standardavvik i transwell migrasjon, invasjon og sårtilheling assay blir dataene uttrykt som en prosent av kontrollen. Data representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).
IL-23 induserer migrasjon og invasjon av skjoldbrusk kreft celler gjennom
SOCS4
for å identifisere rollen til IL-23 i uttrykket av SOCS4, ble K1-celler stimulert med IL-23-protein i 24 timer ved en konsentrasjon på 50 ng /ml. De undertrykkere av cytokin signalering (
SOCS4
) mRNA og protein ble oppdaget av real-time PCR og Western blot, henholdsvis. Resultatene viste at IL-23 trykt
SOCS4
mRNA og protein uttrykk i K1-celler (figur 2A). Lignende resultater ble også oppnådd i Wroclaw cellelinje (figur 2B). For å avgjøre om SOCS4 deltar i IL-23-mediert migrasjon og invasjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller, bygget vi fire menneske SOCS4 spesifikke kort hårnål RNA (shRNA). Real-time PCR resultater viste at # 2 shRNA plasmider kunne markert hemme uttrykket av SOCS4 i K1 celler, mens de andre shRNA plasmider hadde liten effekt på uttrykk for SOCS4 (Fig 2C). SOCS4 protein nivåer viste en lignende trend som bestemmes av Western blot (Fig 2D). I celle migrasjon eksperimenter, overekspresjon av
SOCS4
hemmet IL-23-indusert migrasjon i K1-celler (figur 2E). Motsatt, knockdown av
SOCS4
uttrykk forbedret IL-23-indusert migrasjon i K1-celler (figur 2F). Graden av induksjon ble korrelert med effektiviteten av
SOCS4
knockdown etter hvert shRNA plasmid (Fig 2F). Lignende resultater ble oppnådd med Transwell invasjonsforsøk (figur 2G og 2H). Siden SOCS4 negativt regulerer migrasjon, neste analyserte vi rollen SOCS4 i cellen spredning av skjoldbruskkjertelen kreftceller. Resultater fra MTT analysen indikerte at spredning av K1 celler ble neppe påvirket av uttrykk for SOCS4. I tillegg, overekspresjon eller knockdown av SOCS4 og behandling med IL-23 kunne ikke påvirke celleformering av thyroid kreft celler (S3) Fig. Disse resultater antyder at aktivering av IL-23-regulert migrering og invasjon kan kreve SOCS4.
(A) K1-celler ble behandlet med 50 ng /ml rhIL-23 i 48 timer.
SOCS4
RNA-nivåer ble kvantifisert ved QRT-PCR (venstre panel) og proteinnivåer SOCS4 ble oppdaget av western blot (høyre panel). (B) Forsøk med WRO celler ble utført som i A. (C, D) K1-celler ble transfektert med forskjellig
SOCS4
shRNA (shRNA # 1, shRNA # 2, # 3 og shRNA shRNA # 4) eller shCtrl som uekte. Etter 48 timer,
SOCS4
mRNA nivåer ble målt ved QRT-PCR (C) og western blot (D). (E) K1-celler ble transfektert med de angitte plasmid, deretter behandlet med rhIL-23 (50 ng /ml) i 48 timer og tillates å migrere mot serum i 24 timer (øvre panel). Proteinnivåer av SOCS4 ble påvist ved Western blot (nedre panel). (F) Cellene ble transfektert med indikerte shRNA-SOCS4 og eksperimentene ble utført som i (E). (G, H) Celleinvasjons assay-eksperimenter ble utført under lignende betingelser som beskrevet i (E) og (F). I sanntids-RT-PCR-forsøk ble kontrollen betegnet som 1. Alle forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger med lignende resultater. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).
mikroRNA-25 nedregulerer
SOCS4
uttrykk ved direkte rettet mot sin 3′-UTR
for å analysere mirnas som kan målrette 3′-UTR av
SOCS4
, vi brukte 3 online databaser, TargetScanHuman, miRDB, og miRWalk2.0, for å søke etter potensielle kandidater. Fjorten av de vanligste potensielle mirnas ble funnet i de 3 databaser. For å bestemme effekten av de forut mirnas på uttrykk for
SOCS4
,
SOCS4
3′-UTR ble klonet inn en ildflue luciferase reporter plasmid. Luciferaseaktiviteten analyser indikerte at 6 mirnas hemmet SOCS4 luciferase aktivitet under 50% sammenlignet med MIR-Ctrl (S4A fig). Vi neste undersøkt hvilke mirnas ble aktivert av IL-23-indusert migrasjon og invasjon. K1-celler ble behandlet med IL-23-proteinet ved 50 ng /ml i 48 timer. Resultater fra real-time PCR viste at blant de mirnas som kunne dempe
SOCS4
luciferase aktivitet, uttrykk for MIR-25 ble betydelig indusert (S4B figur).
Fra våre data vi en hypotese om at MIR-25 kan spille en rolle i den IL-23 /SOCS4 signalveien. Vi deretter undersøkt om Mir-25 regulerer
SOCS4
uttrykk ved post-transcriptional målretting av sin 3′-UTR. En tydelig mutasjon ble generert i 3′-UTR av
SOCS4
spådd frø-samsvarende områder for å teste samspillet mellom MIR-25 og
SOCS4
3′-UTR (fig 3A). Transient transfeksjon av K1-celler med villtype (WT)
SOCS4
3′-UTR og MIR-25 ligner, fører til en betydelig reduksjon i reporter aktivitet sammenlignet med den for MIR-kontroll (Fig 3B ). Dette fenomenet ble avbrutt når de samme cellelinjer ble transfektert med
SOCS4
3′-UTR-mutanter (figur 3B). Mir-25 inhibitor (MIR-25-Inh) stimulert betydelig luciferase aktiviteten i WT
SOCS4
3′-UTR, uten noen effekt på Mut
SOCS4
3′-UTR i K1 celler (figur 3C). MikroRNA-25 overekspresjon i K1 celler undertrykte betydelig både mRNA og proteinnivåer SOCS4 (figur 3D). Omvendt, MIR-25 inhibitor-mediert knockdown av endogen MIR-25 økte
SOCS4
mRNA og protein uttrykk i K1-celler (figur 3E). For å avgjøre om MIR-25-mediert nedregulering av
SOCS4
uttrykk er en vanlig funksjon i skjoldbruskkjertelen kreftceller, ble lignende eksperimenter utført i WRO celler (fig 3F og 3G). Sammen disse resultatene tyder på at SOCS4 er et mål på MIR-25 i K1 celler og WRO celler.
(A) sekvenser av MIR-25 bindingssteder innenfor den menneskelige
SOCS4
3 « UTR og skjematiske reporter konstruksjoner. I dette panelet, representerer WT reporteren konstruksjoner som inneholder hele 3’UTR sekvenser av
SOCS4
.
SOCS4
-MUT representerer reporter konstruksjoner som inneholder muterte nukleotider. (B, C) K1 celler ble ko-transfektert med enten WT eller MUT
SOCS4
3’UTR reporter plasmider og enten MIR-25 etterligne (B) eller MIR-25-hemmer (C). Luciferase-aktivitet ble målt etter 48 timer ved hjelp av en dobbel-luciferase-assay kit og normalisert til Renilla luciferase. (D) K1-celler ble transfektert med MIR-25 etterligne eller kontroller i 48 timer.
SOCS4
mRNA (venstre panel) og protein (panel til høyre) ble oppdaget av henholdsvis QRT-PCR og Western blot,. (E) Celler ble transfektert med MIR-25-inhibitor eller kontroll, og eksperimentene ble utført som i D. (F, G) WRO celler ble anvendt, og forsøk ble utført som i D og E. Alle forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger med lignende resultater. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).
mikroRNA-25 fremmer bevegelighet av skjoldbruskkjertelen kreftceller ved å målrette
SOCS4
Siden Mir-25 kan undertrykke
SOCS4
uttrykk av sekvens-spesifikk binding til sin 3′-UTR, hypotese vi at Mir-25 kan påvirke migrasjon og invasjon av skjoldbrusk kreft via SOCS4. For å teste hypotesen, K1-celler ble ko-transfektert med
SOCS4
uttrykk vektor (eller tom vektor) og Mir-25 etterligner (eller MIR-Ctrl). Transwell migrasjon analyser viser at Mir-25 fremmer migrasjon av K1 celler og cellemigrasjon indusert av MIR-25 reverseres av
SOCS4
overekspresjon (fig 4A). I tillegg observerte vi at knockdown av
SOCS4
kan betydelig forbedre effekten av MIR-25 på celle migrasjon (fig 4B). Lignende resultater ble oppnådd i invasjonen analyser og sårtilheling analysen (fig 4C-4F). Virkningen av MIR-25 /SOCS4 signalveien på migrering av thyroid kreft celler ble ytterligere evaluert ved bruk av MIR-25-inhibitor. Som vist i figur 4G, MIR-25-inhibitor inhiberer signifikant migrering av K1-celler. I tillegg MIR-25-inhibitor og
SOCS4
ekspresjonsvektor synergistisk å inhibere migreringen av K1-celler (figur 4G). Motsatt, høye nivåer av migrasjon var tilstede i K1 cellene når
SOCS4
ble slått ned av shRNA-SOCS4 # 2 (Fig 4H). Lignende resultater ble også oppnådd i invasjons analyser og sårtilheling assay (fig 4I-4L). Disse resultatene tyder på at hemming av
SOCS4
uttrykk er ansvarlig for evnen til MIR-25 for å fremme celle invasjon og migrasjon.
(A, B) K1 celler ble ko-transfektert med angitt MIR-RNA mimic og plasmid (A) eller shRNA (B) i 48 timer og tillates å migrere mot serum i 24 timer. (C, D) Cell invasjons assay-eksperimenter ble utført med de samme betingelser som i A og B. (E, F) Sårtilheling analyse eksperimenter ble utført med de samme betingelser som i A og B. (G, H) Celler ble transfektert med MIR-25-inhibitor eller kontroll, og eksperimentene ble utført som i A og B. (i, J) Cell invasjons assay-eksperimenter ble utført med de samme betingelser som i G og H. (K, L) sårheling analyse eksperimenter ble utført med de samme betingelser som i G og H. Bar grafer representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).
IL-23 stimulerer speil 25 uttrykk i skjoldbruskkjertelen kreftceller
for å identifisere rollen som IL-23 i uttrykket av MIR-25, ble K1-celler stimulert med humant IL-23 protein ved forskjellige konsentrasjoner i 48 timer. MikroRNA-25 nivåer ble oppdaget av real-time PCR. Resultatene viser at MIR-25 nivåer blir oppregulert ved IL-23-protein i en doseavhengig måte (figur 5A). Konsekvent, K1-celler ble behandlet med IL-23-protein ved forskjellige tidspunkter, i en konsentrasjon på 50 ng /ml. Resultater fra real-time PCR-analyser viser at Mir-25 nivåer øke etter hvert som tiden øker (figur 5B). Rollen av IL-23 på MIR-25 ekspresjon ble bekreftet ved å gjenta eksperimentene som benyttet WRO celler (Fig 5C og 5D). Disse resultatene tyder på at IL-23 aktiverer MIR-25-ekspresjon.
mikroRNA-25 nivåer ble kvantifisert ved sanntids-PCR og eksperimentene ble utført som beskrevet i figur 1. De ekspresjonsnivåer ble normalisert til U6 snRNA. Data representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05)
mikroRNA-25 spiller en viktig rolle i IL-23-mediert
SOCS4.
hemming og celle migrasjon og invasjon
for å definere rollen MIR-25 i nedregulering av IL-23-mediert
SOCS4
uttrykk, K1-celler ble transfektert med enten MIR-25 etterligner eller MIR-Ctrl og behandlet med eller uten IL-23-protein i 48 timer. Resultater fra real-time PCR og Western blot analyser viser at transfeksjon med MIR-25 ligner øker IL-23-mediert hemming av
SOCS4
mRNA og protein uttrykk (Fig 6A). I motsetning til høye nivåer av
SOCS4
mRNA og protein som er til stede i K1-celler, når ekspresjonen av MIR-25 inhiberes ved MIR-25-inhibitor (figur 6B). Vi har også undersøkt om Mir-25 er involvert i IL-23-mediert skjoldbruskkjertelkreft cellelinje motilitet. Ved hjelp av Transwell migrasjon og invasjon analyser, viste vi at Mir-25 overekspresjon stimulerer IL-23-mediert aktivering av migrasjon og invasjon (Fig 6C og 6D), og knockdown av MIR-25 uttrykk hemmer IL-23-mediert aktivering av migrasjon og invasjon (fig 6E og 6F). Lignende resultater ble også oppnådd i sårheling assay (fig 6G og 6H) .Taken sammen tyder disse data på at MIR-25 er en nøkkelkomponent er involvert i IL-23-formidlet thyroid kreft cellemigrering og invasjon gjennom inhibering av
SOCS4
uttrykk.
(A) K1-celler ble transfektert med de angitte plasmid, deretter behandlet med rhIL-23 (50 ng /ml) i 48 timer. SOCS4 mRNA (venstre panel) og protein (panel til høyre) ble oppdaget av henholdsvis QRT-PCR og Western blot,. (B) Celler ble transfektert med MIR-25-inhibitor eller kontroll, og forsøkene ble utført som i A. (C, D) K1-celler ble transfektert med MIR-25 etterligne (C) eller inhibitor (D) og kontroller, deretter behandles med rhIL-23 (50 ng /ml) i 48 timer og tillates å migrere mot serum i 24 timer. (E, F) Cell invasjons assay-eksperimenter ble utført med de samme betingelser som i C og D. (G, H) sårheling analyse eksperimenter ble utført med de samme betingelser som i C og D. Samtlige forsøk ble gjentatt minst tre ganger med samme resultat. Søylediagrammer representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05)
Uttrykket av IL-23, MIR-25 og
SOCS4
i skjoldbrusk kreftvev
for å validere rollen som IL-23, MIR-25 og
SOCS4
i skjoldbruskkjertelkreft, uttrykket av IL-23, MIR-25 og SOCS4 ble analysert i 35 par av klinisk PTC, 26 par av klinisk FTC, og 22 normale skjoldbrusk prøver. Som vist i s5a-S5C figur, uttrykk for
SOCS4
var lavere og uttrykket nivået av IL-23 og MIR-25 var høyere i PTC og FTC eksemplarer enn normal skjoldbrusk prøver. I tillegg ble høye nivåer av IL-23 korrelert med høye nivåer av MIR-25 (fig S5D). Interessant, lave nivåer av
SOCS4
uttrykk ble korrelert med høye nivåer av IL-23 og MIR-25 uttrykk i PTC og FTC prøver (S5E og S5F Fig). Disse observasjonene tyder sterkt på at endringer av IL-23, MIR-25 og SOCS4 uttrykk kan være involvert i skjoldbruskkjertelkreft progresjon.
Diskusjoner
I denne studien har vi definert en roman signalveien innblandet i kontroll av kreft i skjoldbruskcellemigrering og invasjon. Først viste vi at IL-23 oppregulert MIR-25 uttrykk samt downregulated
SOCS4
uttrykk i skjoldbruskkjertelkreft celle migrasjon og invasjon. Videre viste vi også at Mir-25 fremmer skjoldbrusk kreft celle migrasjon og invasjon ved å målrette SOCS4. Endelig våre data tyder på at MIR-25 er involvert i IL-23-forbundet
SOCS4
ekspresjon og cellemigrering og invasjon.
tumorcellemigrering og invasjon er en meget komplisert prosess hvori kreft cellene spres fra den primære tumor, overleve i sirkulasjon, og vokse på fjerne steder i kroppen [28]. Hver prosess er bestemt av migrering og invasjon evne av tumorcellene og den lokale tumormikromiljøet som gir et gunstig miljø for tumorceller til å overleve og metastasere [29]. Nyere undersøkelser har demonstrert at høy ekspresjon av nivåer av IL-23, som kan påvises i mikromiljøet, kan bidra til å lette tumormetastase. For eksempel, fremmer IL-23 leverkreft metastase av NF-kB-oppregulert MMP9 uttrykk [9]. IL-23 er høyt uttrykt i metastase-assosierte astrocytter, og IL-23 induserer utviklingen av melanom hjernemetastaser [8]. IL-23 spiller en sentral rolle i utviklingen av spiserørskreft via en epitelial-mesenchymale overgang [7]. IL-23 kan forbedre spredning og invasjonen av kolorektal karsinom celler [10]. Imidlertid er rollen til IL-23 i skjoldbruskkjertelkreft cellemigrering og invasjon fortsatt ukjent. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser de direkte effektene av IL-23 på migrasjon og invasjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller. Interessant, en fersk studie har vist at IL-23 regulerer spredning av lungekreft celler [30]. Likevel, i motsetning til lungekreft celler, vi fant ikke bevis for å støtte at IL-23 induserer spredning av skjoldbruskkjertelen kreftceller (S1 Fig). Vi spekulerer i at det kan være noen iboende forskjeller mellom skjoldbruskkjertelkreft og lungekreft. På den annen side, IL-23 fremmer migrering og invasjon av thyroid kreft celler.
For tiden er det to rapporter antydet den potensielle rolle SOCS4 i kreft. En studie brukte en dobbel kombinasjon rekke analyse for å bevise at SOCS4 er en roman magekreft suppressor genet [31]. Den andre studien sammenlignet uttrykk forskjeller
SOCS1-7
mellom brystkreft vev og bakgrunn brystvev [32]. Høy uttrykk for
SOCS4
er signifikant assosiert med en tidligere svulst scenen og en bedre klinisk resultat i menneskelig brystkreft [32]. I denne studien ble det observert at nivåene av SOCS4 er redusert i IL-23-indusert migrering og invasjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller (figur 2). Behandling med IL-23 gir reduserte uttrykk nivåer av
SOCS4
i skjoldbruskkjertelen kreftceller (fig 2). Gjennom overekspresjon og knockdown eksperimenter, viser vi at
SOCS4
regulerer negativt IL-23-indusert migrasjon og invasjon (fig 2). Nylig har flere studier vist bevis for at SOCS familien har en sterk svulst undertrykke rolle i flere typer faste og hematologiske tumorer [32,33].
