Abstract
Bakgrunn
Nåværende behandling av pasienter diagnostisert med prostatakreft (PCA) er svært effektive; imidlertid, tumorresidiv med Kastrere resistent prostatakreft (CRPC) og etterfølgende metastasering fører til dårlig overlevelse utfall, noe som tyder på at det er et akutt behov for nye mekanistisk forståelse av tumorresidiv, noe som vil være avgjørende for å utforme nye behandlingsformer. Tilbakefall og metastasering av PCa er tett knyttet til biologi av prostata kreft stamceller eller kreftfrem initiere celler som minner om oppkjøpet av epithelial til Mesenchymale Transition (EMT) fenotype. Økende bevis tyder på at EMT-type celler deler mange biologiske egenskaper med kreft stamceller lignende celler.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien fant vi at PCA celler med EMT fenotype vises stem- som cellefunksjoner preget av økt uttrykk av Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B og /eller Notch1, i samsvar med forbedret klonogene og sfære (prostasphere) dannende evne og tumorigenecity hos mus, som ble assosiert med redusert uttrykk av MIR-200 og /eller la-7 familien. Tilbakeføring av EMT ved re-uttrykk for MIR-200 hemmet prostasphere dannende evne EMT-type celler og redusert uttrykk for Notch1 og Lin28B. Nedregulering av Lin28B økte la-7 uttrykk, som var i samsvar med undertrykt selvfornyelse evne.
Konklusjon /Betydning
Disse resultatene tyder på at Mir-200 spilte en sentral rolle i å knytte karakteristikker av kreft stamceller lignende celler med EMT-lignende celle signaturer ved PCA. Selektiv eliminering av kreft stilk-lignende celler ved å reversere EMT fenotype til Mesenchymale-epithelial Transition (MET) fenotype ved hjelp av nye midler ville være anvendbare for forhindring av tumor tilbakefall særlig ved å eliminere de celler som er «Root årsak» for tumorutvikling og tilbakefall
Citation. Kong D, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Wang Z, Sethi S, et al. (2010) Epitelial å Mesenchymale overgangen er Mekanistisk Knyttet Stem Cell signaturer i prostata kreft celler. PLoS ONE 5 (8): e12445. doi: 10,1371 /journal.pone.0012445
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 28 juni 2010; Godkjent: 06.08.2010; Publisert: 27 august 2010
Copyright: © 2010 Kong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra National Cancer Institute, National Institutes of Health (NIH) (5R01CA083695-08 til FHS) (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Emerging bevis tyder på at de fleste solide tumorer inkludert prostatakreft (PCA) kan oppstå fra kreft stamceller [1]. De kreft stamceller er celler i en svulst som har evnen til selvfornyelse og tumor-initiering kapasitet, og differensiere til de heterogene linjer av kreftceller som utgjør en tumormasse. Disse tumor-initiering celler kan tilveiebringe et reservoar for celler som forårsaker tumor tilbakefall etter behandling. Wang et al. har vist at opprinnelsen til PCA-celler er fra de differensierte luminale epitel-stamceller [2]. Det er imidlertid en større grad av fenotypisk heterogenitet av celler i PCa, spesielt i løpet av metastaser. Metastaser ofte omfatter sjeldne celler som er fenotypisk udifferensiert [3], som tyder på at metastaser-initierende celler ikke kan være det eneste celler som er avledet fra androgen-reseptor-positive celler luminal. Selv om opprinnelsen av PCA-celler må ikke helt klarlagt, et antall monterings bevis tyder på at tumor initiere celler eller kreft stamceller spiller en kritisk rolle i progresjon og gjentakelse av PCa til kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) og dens etterfølgende metastasering.
Nyere studier har indikert at somatiske celler kan omprogrammeres til pluripotente embryonale stamceller lignende celler ved co-uttrykk for pluripotency stamcellemarkører som Oct4, Sox2, Nanog og Lin28 [4], [5], som øker muligheten som kombinerte uttrykk for stamcelle-forbundet faktorer og spesielle onkogener kan også indusere en udifferensiert tilstand i kreftceller. Interessant, cellelinjer avledet fra humane PCA-prøven viste epitelisk fenotype. Imidlertid immortalisering av disse celler ved hTERT viste ekspresjon av pluripotency stamcelle markører, inkludert Oct4, Nonag, og Sox2 [6], som kan være assosiert med sykdomsprogresjon fordi over-ekspresjon av Oct4, Sox2, Nanog og c-myc har blitt funnet i dårlig differensierte svulster [7]. Jeter et al. har vist at knock-down av Nanog i PCA cellene betydelig redusert langsiktig klonogene vekst og hemmet tumorvekst [8]. Oct4 har også vist seg å spille en viktig rolle i progresjonen av PCa [9].
Epithelial til mesenchymale overgang (EMT) er en viktig prosess for morfogenese under embryonal utvikling, men mer nylig har det også vært implisert i omdannelsen av tidlig stadium svulster inn i invasive maligne [10]. Progresjon av et karsinomer mot malignitet er forbundet med tap av epitelial differensiering, og ved å slå mot mesenchymale fenotype, som er ledsaget av øket celle motilitet og invasjon. Nylige studier har vist at EMT spiller en avgjørende rolle ikke bare i tumormetastase, men også i tumorresidiv som antas å være tett forbundet med biologien til kreft stilk-lignende celler eller kreft-initiering celler [11] – [13]. Imidlertid er mekanismene som EMT celler som genererer stammelignende celler gjenstår å bli belyst. MicroRNAs (mirnas) dukker opp som master-regulatorer av celledifferensiering og involvert i oppkjøpet av EMT fenotype under tumorprogresjon [14]. To evolusjonære konservert familier, MIR-200 og la-7 har vist seg å regulere differensieringsprosesser under utvikling. Interessant, har nyere studier også vist at MIR-200 familien ikke bare kunne regulere prosesser av EMT ved å målrette E-box bindende protein ZEB1 og ZEB2 [15], men ble også assosiert med stilk-lignende celle signaturer ved å regulere uttrykket av Bmi1 [ ,,,0],16], [17]. La-7 familien mirnas har vist seg å virke som en tumor suppressor gjennom målretting Ras, høy mobilitet gruppe A2 (HMGA2) og c-myc, og redusert la-7 ekspresjon har vært knyttet til økt tumordannelse og dårlig prognose pasient. Enda viktigere, La-7 familiemedlemmer regulere den selvfornyelse av brystkreftceller [18], som er forbundet med stamcelle fenotype. Nyere studier har også dokumentert at lin28B kunne hindre akkumulering av modne la-7 [19], som i sin tur regulerer «stemness» ved å inhibere selvfornyelse, den cellulære egenskapene til kreft stilk-lignende celler assosiert med tumor tilbakefall. Gjentakelse av PCa antas å være sterkt forbundet med biologien til prostatakreft stamceller eller kreft-initiering celler [11], [20], [21], mens økende bevis har vist at celler med EMT indusert av ulike faktorer er rike kilde for kreft stilk-lignende celler [12], [13], [22], [23].
det er derfor viktig å identifisere hvilke faktorer kan indusere EMT, og hvordan de EMT cellene kan bli en ressurs for kreft stilk-lignende celler, noe som ytterligere understreker mekanistisk rolle slike faktorer mot utvikling av nye og målrettede behandlingsformer for CRPC. Studier har vist at blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) signalering bidrar til EMT [24], [25]. Nylig har vi og andre vist at PDGF-D kunne regulere kreft celle invasjon og angiogenese, som var i samsvar med oppkjøpet av EMT fenotype [26] – [30]. Interessant nok har økt ekspresjon av PDGF-D også blitt funnet i human PCa [31], som tyder på at PDGF-D kan spille en viktig rolle i progresjon av human PCa bidratt med EMT-fenotypisk eller kreft stamceller-lignende celler. I denne studien fant vi at PDGF-D over-uttrykker PC3 celler kjøpt EMT fenotype og felles stilk-lignende cellefunksjoner preget av økt uttrykk av stamcellemarkører som Notch1, Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B, som var i samsvar med forbedret klonogene, prostasphere dannende evne samt økt tumorigenicity hos mus. Samtidig, fant vi ARCaP
M celler med EMT fenotype delte også stilk-lignende celle signaturer preget av økt uttrykk av transkripsjonsfaktoren Notch1 og forbedret klonogene, prostasphere dannende evne sammenlignet med kontrollceller (ARCaP
E-celler) med epithelial fenotype. Disse EMT-type-celler viste også redusert ekspresjon av MIR-200 eller la-7, og reversering av EMT ved å tvinge ekspresjon av MIR-200 signifikant hemmet klonogene og prostasphere dannende evne, som var i overensstemmelse med inhiberingen av Notch1 og Lin28B uttrykk. Videre knock-down av Lin28B markant økt la-7 uttrykk, noe som tyder på at MIR-200 og la-7 kan fungere som et mål for forebygging av svulst tilbakefall og metastase ved PCA.
Resultater
klonogene evne ble økt i PC3 PDGF-D og ARCaP
M celler har EMT fenotype
resultatene fra Western blot analyse og celle morfologi samt våre publiserte data har vist at over-uttrykk for PDGF -D indusert EMT fenotype i PC3-celler [26], [28] (fig. 1 A), som var sammenfallende med høyere nivåer av PDGF-D i cellelysater og kondisjonert medium (CM) fra PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med Neo PC3 -celler (fig. S1A og S1B). ARCaP
M celler med mesenchymale morfologi, viste en økt uttrykk av mesenchymale markører og redusert uttrykk av epiteliale markører forhold til ARCaP
E celler med epitelial fenotype (Fig. 1B). For å avgjøre om celler med EMT fenotype kunne ha stilk-lignende celleegenskaper, utførte vi klonogene analysen. Vi fant at klonogene evnen øker betydelig hos PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo celler (Fig. 1C, venstre panel). Fig. 1C, panel rett, videre indikert at PC3 PDGF-D-celler viste en 11-dobling i koloni tall i forhold til PC3 Neo celler. ARCaP
M celler vises også en økt klonogene kapasitet viser 3 ganger økning i koloni tall sammenlignet med ARCaP
E celler (Fig. 1D). Myk-agar assay, også kjent som forankringsuavhengig vekst analysen ble utført. PC3 PDGF-D-celler viste dramatisk økning av klonogene potensiale sammenlignet med Neo PC3-celler (fig. 1E, venstre panel). Fig. 1E, panel rett, viste tydelig koloni tall generert fra PC3 Neo og PC3 PDGF-D celler per mikroskopiske feltet (40 X). Disse resultatene viste en økning i klonogene muligheten av EMT celler
(A) Fotografier av celler ble vist:. PC3 Neo-celler vist avrundet epitelial celleform og PC3 PDGF-D-celler utviste en fibroblastisk-type fenotype (venstre panel , opprinnelig forstørrelse 200 X). Western blot analyse viste at ekspresjonen av transkripsjons repressorer forbundet med EMT, samt mesenkymale samt epitel-markører i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler (panel høyre, passasje 10 til 20). (B) Den morfologi ARCaP
M og ARCaP
E-celler ble vist (venstre panel) .Western blot analyse indikerte økt ZEB1, vimentin og Notch1 uttrykk og redusert E-cadherin uttrykk i ARCaP
M celler sammenlignet med (høyre panel) ARCaP
E. (C) og (D) Fotografier av kolonier fra PC3 Neo og PC3 PDGF-D eller ARCaP
M og ARCaP
E ble vist (venstre panel). Kolonien tallene ble telt og dataene ble presentert som relative koloni antall PC3 Neo eller ARCaP
E designet som (høyre panel) 1. (E) Koloniene dyrket på soft agar ble fotografert (venstre panel, bar, 200 mikrometer). Kolonien tallene ble talt under et fasekontrastmikroskop. Data ble presentert som koloni tall per felt (høyre panel). **, P 0,01 sammenlignet med Neo eller ARCaP
E-celler (N: PC3 Neo celler, D: PC3 PDGF-D-celler, p10: passasje 10, E-cad: E-cadherin)
selvfornyelse kapasiteten ble økt med EMT celler
for ytterligere å avgjøre om celler med EMT fenotype kunne vise stilk-lignende cellekarakteristikker, vi testet sfære dannende (betegnet som prostasphere) evne til PC3 PDGF- D-celler sammenlignet med Neo PC3 samt ARCaP
M-celler sammenlignet med ARCaP
E-celler når dyrket i suspensjonskulturer, som er et
in vitro
mål på stilk-lignende cellekarakteristikker. Vi fant at PC3 PDGF-D-celler viste signifikant øket evne til å danne prostaspheres forhold til PC3 Neo-celler (fig. 2A og 2B). De prostaspheres fra PC3 Neo var mindre enn 100 pm i diameter etter 6 dager, mens 40% av de prostaspheres fra PC3 PDGF-D-celler var 100-200 um, 20% av prostaspheres fra PC3 PDGF-D-celler var større enn 200 um (fig. 2C). For ytterligere å bekrefte om prostaspheres er avkommet av individuelle celler i stedet for aggregater av flere celler, ble prostaspheres (P1) oppsamlet, og cellene ble sådd ut i en celle pr brønn i 96-brønns plate med ultra-lav vedlegg. Etter 12 dager, fant vi at én til to nye prostaspheres ble samlet inn én PC3 PDGF-D-celler, mens bare 20% enkeltceller av PC3 Neo generert nye prostaspheres (P2, Fig. 2D). ARCaP
M celler også utstilt en økt prostasphere dannende kapasitet (Fig. 2E og 2F), noe som tyder på at celler med EMT fenotype har ervervet økt selvfornyelse kapasitet. Basert på disse resultatene, ble ytterligere mekanistiske eksperimenter fokusert hjelp PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo celler og sammenlignet med ARCaP
M og ARCaP
E celler uansett hvor berettiget.
(A) Prostaspheres fra PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler ble fotografert og vist (bar, 100 mikrometer). (B) Et antall prostaspheres ble tellet under mikroskop. (C) Prostaspheres ble fotografert og størrelsen på prostaspheres i diameter ble målt ved hjelp av programvare bildeanalyseprogram Scion Bilde. (D) prostaspheres (P1) ble samlet opp og på nytt platet ved en tetthet på en celle pr brønn i 96-brønns plate med ultra-lav vedlegg. Etter 12 dagers inkubering, ble antallet prostaspheres (P2) tellet under et fasekontrastmikroskop. (E) Antallet prostaspheres fra ARCaP
E og ARCaP
M celler ble tellet under mikroskop. (F) Prostaspheres fra ARCaP
E og ARCaP
M celler ble fotografert og vist (bar, 100 mikrometer). **, P 0,01 sammenlignet med Neo eller ARCaP
E celler. (Neo: PC3 Neo celler, PDGF-D: PC3 PDGF-D-celler)
Gene uttrykk profilering av stamcellemarkører i celler med EMT fenotype
for å finne gener som regulerer og opprettholde stamcelleforskningen fenotype av PC3 PDGF-D-celler har EMT signaturer, utførte vi microarray for å bestemme genuttrykk profilering av PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo celler. Vi fant at PC3 PDGF-D-celler viste dramatiske endringer i ekspresjon av gener assosiert med EMT-fenotypen (Tabell S1). Interessant, transkripsjonsfaktorer Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B, som er kjent for å være tilstrekkelig til å omprogrammere mus eller humane somatiske celler til udifferensierte, pluripotente stamceller, ble funnet å være signifikant øket i PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med Neo PC3-celler. Samtidig, nedstrøms målene for disse transkripsjonsfaktorer som Zic2, Zic3, Sall2 og Sall4 var også signifikant oppregulert (tabell S2). For ytterligere å bekrefte resultatene fra mikromatrise genekspresjon analyser, vi har gjennomført sanntids RT-PCR og Western blot-analyse av utvalgte gener. Resultatene fra sanntids RT-PCR viste to til tusen ganger økning i mRNA-nivåer av disse transkripsjonsfaktorer og deres nedstrøms mål i PC3 PDGF-D-celler (fig. 3A). Western blot-analyse viste også at protein uttrykk for Sox2, Nanog, Stat3, Lin28B og Oct4 var signifikant høyere i PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med Neo-PC3-celler fra passasjen 10 til passasjen 20 (fig. 3B).
(A) ekspresjon av gener på mRNA-nivåer for Oct4, Nanog, Sox familie gener og Lin28B i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler ble bestemt ved hjelp av sanntids RT-PCR. (B) Resultatene fra Western blot viste at uttrykk for Oct4 Sox2, Nanog, Stat3 og Lin28B ble betydelig økt i PC3 PDGF-D-celler. (C) Sanntid RT-PCR ble anvendt for å kvantifisere mRNA-ekspresjon av EED, EZH2 og Suz12a. Relative mRNA-nivåer ble normalisert til GAPDH. (D) Resultatene av Western blot viste at ekspresjonen av EZH2 var signifikant økt i PC3 PDGF-D-celler. (E) De mRNA-nivåene av Notch signale faktorer i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler ble bestemt ved hjelp av sanntids RT-PCR. (F) Resultatene fra Western blot viste at uttrykk for Notch og Notch ligander ble betydelig økt i PC3 PDGF-D-celler. GAPDH ble brukt for protein lasting kontroll. (N: PC3 Neo celler, D: PC3 PDGF-D-celler, P10: passasje 10).
Polycomb gruppe proteiner er kjent for å være involvert i reguleringen av genet undertrykkelse gjennom kromatin modifikasjoner, som er essensiell for opprettholdelsen av de embryonale og voksne stamceller [32], [33]. Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) inneholder Suz12, EZH2, miljømessige dimensjon og RbAp underenheter og funksjoner i embryonale og voksne stamceller til å undertrykke utviklings gener som fortrinnsvis aktiveres under differensiering. Videre har flere studier vist at PRC2 målgener er co-okkupert av stamcelle regulatorer som Oct4, Sox2 og Nanog [34]. Under dataanalyse av våre microarray data, har vi funnet at nivåene av EZH2 og Suz12a mRNA ble økt i PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo celler (tabell S2), som ble ytterligere bekreftet av real time RT-PCR (Fig. 3C). I tillegg proteinnivåer EZH2 var signifikant oppregulert i PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo-celler (fig. 3D), og disse resultater klart tyder på at EMT-type karakteristikker av PC3 PDGF-D-celler er i overensstemmelse med den signaturer av stamceller eller kreft stamceller-lignende celler.
Notch signalering har vist seg å spille en viktig rolle i pluripotency og selvfornyelse kapasitet på både embryonale og voksne stamceller [35], [36]. Resultatene fra våre microarray data viste at mRNA nivåer av Notch, Notch ligander, delta-aktig, Jagged samt Notch nedstrøms mål som Hes og Hey var signifikant høyere i PC3 PDGF-D-celler i forhold til PC3 Neo celler (tabell S2) . Sanntid RT-PCR viste 2-350 ganger økning i mRNA-nivåer av signalerings Notch-gener (fig. 3E), noe som ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse, som vist i fig. 3F. Likeledes har vi også funnet betydelig økt nivå av Notch1 uttrykk i ARCaP
M celler sammenlignet med ARCaP
E celler (Fig. 1B, panel til høyre).
MiR-200B og MIR-200c uttrykk knyttet kreft stamcelle signaturer med EMT fenotype
i våre tidligere studier, fant vi betydelig nedregulering av MIR-200 familie i PC3 PDGF-D-celler med EMT fenotype [28], som var i tråd med vår miRNA microarray data (tabell S3). For å avdekke om uttrykk for MIR-200-familien er forbundet med stamcelle signaturer, ble PC3 PDGF-D-celler transfektert med MIR-200A, MIR-200b og MIR-200c. Vi fant at transfeksjon av MIR-200B og MIR-200c indusert reversering av EMT til MET fenotype (fig. 4A). Enda viktigere, re-uttrykk for MIR-200B og MIR-200c vesentlig hemmet prostasphere dannende evne PC3 PDGF-D-celler (fig. 4B). Videre, størrelsen av prostaspheres ble også redusert i PC3 PDGF-D-celler transfektert med MIR-200B og MIR-200c sammenlignet med transfeksjon med styre miRNA (fig. S2A og S2B). Imidlertid transfeksjon av PC3 PDGF-D-celler med MIR-200a hadde ingen virkning på prostasphere-dannende evne, men økte størrelsen på prostaspheres sammenlignet med kontrollen (Fig. 4B Fig. S2A og S2B fig.). Disse resultatene tyder på at Mir-200B og MIR-200c men ikke MIR-200a hemmet selvfornyelse av PC3 PDGF-D-celler ved å kontrollere mål genekspresjon av MIR-200B og MIR-200c. Dermed vurderte vi uttrykket av de antatte målene for MIR-200B og MIR-200c som Notch1, Bmi1 og lin28B i PC3 PDGF-D-celler transfektert med MIR-200 familie fordi MIR-200B og MIR-200c har tre eller en antatt bindingsseter i 3’UTR av Lin28B, Bmi1 mRNA (fig. S3) og Notch1 mRNA. Mir-200B og MIR-200c transfeksjon dramatisk redusert uttrykk for Notch1 og lin28B, men hadde ingen effekt på uttrykk for Bmi1 (fig. 4C). Ekspresjon av ZEB1 ble funnet å bli nedregulert ved tvungen ekspresjon av MIR-200B og MIR-200c (fig. 4C), som var i overensstemmelse med reversering av EMT fenotype (Fig 4A). Vi fant også at Mir-200c uttrykk ble undertrykt i ARCaP
M celler sammenlignet med ARCaP
E-celler (fig. 4D). Videre gjen uttrykk for MIR-200c i ARCaP
M celler ved transfeksjon med pre-MIR-200C forløpere markert redusert prostasphere dannende kapasitet sammenlignet med transfeksjon med kontroll miRNA (Fig. 4E). Disse resultatene var i samsvar med nedregulering av Notch1 ekspresjon og reversering av EMT fenotype som kjennetegnes ved øket ekspresjon av E-cadherin og redusert ekspresjon av ZEB1 samt cellulære morfologi endring i ARCaP
M-celler transfektert med pre-MIR-200c forløpere (fig. 4F og 4G fig.).
PC3 PDGF-D-celler ble transfektert med pre-MIR-200. 3 dager etter transfeksjon, ble cellene splittet og transfektert gjentatte ganger med pre-MIR-200 hver 3-4 dag i 14 dager. (A) Fotografier av celler er vist: transfeksjon av PC3 PDGF-D celler med pre-MIR-200 for 14 dager, MIR-200b og MIR-200c reverseres EMT celler til MET celle morfologi. (B) Cellene ble samlet opp for generering av prostaspheres etter 14 dagers transfeksjon med pre-MIR-200. MiR-200B og MIR-200c redusert antall prostaspheres. (C) Western blot viser at Notch1, Lin28B og ZEB1 uttrykk ble nedregulert i PC3 PDGF-D-celler transfektert med MIR-200B og MIR-200c. (D) Nivået på MIR-200c betydelig redusert i ARCaP
M ved hjelp av real time RT-PCR. (E) Transfeksjon av pre-MIR-200c etter 6 dager reduserte prostasphere dannende evne i ARCaP
M celler (Bar: 100 mikrometer). (F) Western blot viste at gjen uttrykk for MIR-200c ved transfeksjon av pre-MIR-200c økte E-cadherin uttrykk og undertrykt uttrykk for ZEB1 og Notch1 i ARCaP
M celler, som i samsvar med endring fra mesenchymale til epitelcelle morfologi (G). *, P 0,05 sammenlignet med kontroll; **, P 0,01 sammenlignet med kontroll. (Con: kontroll, 200a: pre-MIR-200a, 200b: pre-MIR-200b, 200c: pre-MIR-200c, E-cad: E-cadherin)
Down-regulering. av Notch1 av MIR-200 var delvis ansvarlig for hemming av colonogenic og prostasphere dannende evne PC3 PDGF-D-celler
Mir-200B og MIR-200c har ett bindingsseter i 3’UTR av Notch1 (fig. 5A). For å avgjøre om Notch1 er direkte mål av MIR-200B og MIR-200c, analyserte vi aktiviteten til 3 «UTR av Notch1 i PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler transfektert med 3’UTR av Notch1 luciferase plasmid samt PC3 PDGF -D celler kotransfektert med 3’UTR av Notch1 luciferase plasmid og MIR-200b eller MIR-200c. Vi fant at aktiviteten til 3’UTR av Notch1 luciferase ble betydelig økt i PC3 PDGF-D-celler sammenlignet med PC3 Neo celler på grunn av lavere nivåer av MIR-200B og MIR-200c i PC3 PDGF-D-celler. Videre gjen uttrykk for MIR-200b eller MIR-200c reduseres dramatisk aktiviteten 3’UTR av Notch1 luciferase i PC3 PDGF-D-celler, mens re-uttrykk for MIR-200a med en base av frø sekvens forskjellig fra MIR-200b og MIR-200c hadde ingen effekt på aktiviteten til 3’UTR av Notch1 luciferase (fig. 5B). Disse resultatene tyder på at MIR-200B og MIR-200c regulere Notch1 uttrykk ved å binde seg til 3’UTR av Notch1 mRNA. For å avgjøre om Notch1 spilt en viktig rolle i å opprettholde stamcellene, behandlet vi PC3 PDGF-D-celler med DAPT, en γ-sekretase inhibitor som hemmer aktiveringen av Notch. Full lengde Notch1 er vanligvis meget lav på grunn av dens spaltning av mange enzymer i disse cellene; men vi fant at uttrykket av full lengde Notch1 var litt mer i γ-sekretase behandlede celler. Vi fant også at DAPT betydelig redusert klonogene evne PC3 PDGF-D-celler (Fig. 5C, øvre panel), som var konsistent med Western blot data som viser at DAPT behandling inhiberte aktiv form av Notch1 (fig. 5C, nedre panel). Videre transfeksjon av Notch1 siRNA dramatisk undertrykt den prostasphere dannende evne PC3 PDGF-D-celler (fig. 5D og 5E), som var konsistent med nedregulering av Notch1 protein ekspresjon (fig. 5F). Disse resultatene tyder på at Mir-200 mediert nedregulering av Notch1 var delvis ansvarlig for selvfornyelse kapasitet og colonogenic vekst av EMT-lignende celler med stamcelle funksjoner.
(A) konservert, spådde bindingssteder for frø sekvenser av MIR-200B og mir-200c i 3’UTR av Notch1 mRNA. (B) MiR-200B og MIR-200c hemmet Notch1 3’UTR luciferase aktivitet. **, P 0,01 sammenlignet med Neo kontrollceller; #, S 0,01 sammenlignet med PDGF-D-kontrollceller. (C) DAPT behandling, en γ-sekretase inhibitor, redusert klonogene evne i PC3 PDGF-D-celler (øvre panel) .Western blot som viser at DAPT behandling reduserte aktiv form av Notch1 på doseavhengig måte (nedre panel). (D) og (E) som viser at transfeksjon av Notch1 siRNA etter 9 dager undertrykte den prostasphere dannende kapasitet i PC3 PDGF-D-celler (Bar: 100 um), som er forenlig med nedregulering av ekspresjon Notch1 (F). **, P 0,01 sammenlignet med kontroll. (Neo: PC3 Neo celler, PDGF-D: PC3 PDGF-D-celler, Con: kontroll, 200a: pre-MIR-200a, 200b: pre-MIR-200b, 200C: pre-MIR-200c)
Lin28B hemmet produksjonen av la-7, regulerer selvfornyelse ved å kontrollere uttrykket av Sox2, Nanog og Oct4
Våre resultater presentert ovenfor viste at MIR-200B og MIR-200c hemmet lin28B uttrykk (fig. 4C), som er kjent for å bindes til primær la-7 og pre-la-7 RNA og inhiberer akkumulering av modne la-7 miRNA [19]. Resultatene fra våre miRNA microarray data viste at alle medlemmene av la-7 familie ble betydelig redusert i PC3 PDGF-D-celler (tabell S3). Disse resultatene ble bekreftet av sanntids-RT-PCR-analyse (Fig. 6A). Knock-down av Lin28B av siRNA sterkt økt modne la-7 uttrykk (Fig 6B.); tyder lin28B regulert moden la-7 uttrykk i PC3 PDGF-D-celler. Det er velkjent at la-7 familien spiller en avgjørende rolle i å regulere selvfornyelse i embryonale stamceller og brystcancer stilk-lignende celler [18], [37]. For å avgjøre om la-7 kunne kontrollere selvfornyelse av PC3 PDGF-D-celler, utførte vi sfæren dannende analysen. Re-uttrykk av utvalgte la-7 familie som la-7a, la-7b, la-7d eller kombinasjon av la-7a, la-7b og la 7d markert hemmet prostasphere dannende evne (Fig. 6C og 6D) og samtidig redusert størrelsen på prostaspheres (fig. 6C, S4A og S4B). Siden Lin28B hindrer opphopning av modent la-7 ved å binde seg til pre-la-7 RNA og derved blokkere behandling av pre-la-7 RNA, PC3 PDGF-D-celler med høy grad av Lin28B ble ko-transfektert med pre-brev 7 og Lin28B siRNA. Vi har funnet at prostasphere tall fra celler ko-transfektert med pre-la-7 og Lin28B siRNA var mindre enn den for transfeksjon med pre-la-7 alene (figur 6D.); imidlertid, bortsett fra la-7d, var det ingen forskjell i prostasphere størrelse mellom pre-la-7 alene og ko-transfeksjon med pre-la-7 og Lin28B siRNA (fig. 6C, S4A og S4B). Disse resultatene var i samsvar med data fra Western blot-analyse viser at re-ekspresjon av la-7 inhiberte signifikant Sox2 og Nanog ekspresjon i PC3 PDGF-D-celler ved transfeksjon av pre-la-7a, pre-la-7b eller ko- transfeksjon av pre-la-7a, pre-la-7b eller pre-la-7d med Lin28B siRNA. Transfeksjon av pre-la-7d alene var i stand til å hemme ekspresjon av Lin28B og Oct4 men hadde marginal effekt på Sox2 og Nanog uttrykket (fig. 6E).
(A) Nivåene for la-7 familien PC3 Neo og PC3 PDGF-D-celler ble bestemt ved hjelp av real time RT-PCR. (B) Sanntid RT-PCR ble anvendt for å kvantifisere ekspresjon av la-7 i PC3 PDGF-D-celler transfektert med Lin28B siRNA i 3 dager. (C) Mikrofotografier viser prostaspheres generert fra PC3 PDGF-D-celler transfektert med pre-la-7 eller kombinasjon av pre-la-7 og Lin28B siRNA 14 dager etter transfeksjon (bar: 100 mikrometer). (D) Cellene ble oppsamlet for prostasphere dannende analyse etter 14 dagers transfeksjon. La-7a, la-7b, la-7d og kombinasjon av Let-7a, la-7b, la-7d samt co-transfeksjon med la-7 og Lin28B siRNA redusert antall prostaspheres. (E) Resultatene av Western blot viste ekspresjon av Lin28B, Sox2, Nanog, og Oct4 i PC3 PDGF-D-celler transfektert med pre-la-7 eller ko-transfektert med pre-la-7 og Lin28B siRNA etter 9 dagers transfeksjon. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll; **, P 0,01 sammenlignet med kontroll. (Con: kontroll, en: pre-la-7a, abd: kombinasjon av pre-la-7a, pre-la-7a, pre-la-7d, al: kombinasjon av pre-la-7a og Lin28B siRNA, Lin28B- si: Lin28B siRNA, Neo: PC3 Neo celler, PDGF-D:. PC3 PDGF-D-celler)
Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B var nødvendig for selvfornyelse av PC3 PDGF-D-celler
Vi har vist at la-syv familie regulert selvfornyelse og hemmet Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B uttrykk i PC3 PDGF-D celler med EMT fenotype. For å kunne vurdere den mekanistiske koblingen av disse molekylene (Sox2, Nanog, OCT4 og Lin28B) med selvfornyelse kapasitet på PC3 PDGF-D-celler, vi slått ned uttrykket av Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B av siRNA transfeksjon hjelp Sox2 , Nanog, Oct4 og Lin28B spesifikke siRNA. Vi fant ut at knock-down av Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B betydelig undertrykt prostasphere dannende evne (fig. 7A). Videre PC3 PDGF-D-celler transfektert med Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B siRNA viste signifikant økt antall prostaspheres i mindre størrelse (30-50 mm) sammenlignet transfektert med kontroll siRNA samtidig med redusert antall prostaspheres med 50 pm i diameter (fig. 7B). Disse resultatene var i samsvar med protein expression resultater som er vist i fig. 7C, noe som tyder på at Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B er nødvendig for selvfornyelse av PC3 PDGF-D-celler.
(A) Enkeltcellesuspensjoner av PC3 PDGF-D transfektert med Sox2, Nanog, Oct4 og Lin28B siRNA og inkubert i 24 timer ble sådd ut på ultralave adherente brønner i 6-brønn plate med 2000 celler /brønn. Etter 3 dager ble antall prostaspheres tellet under mikroskop. (C).
