Abstract
β, β-Dimethylacrylshikonin, en av de aktive komponentene i roten ekstrakter av Lithospermum erythrorhizon, besitter antitumor aktivitet. I denne studien, har vi diskutert de molekylære mekanismer for β, β-dimethylacrylshikonin i apoptose av SGC-7901-celler. β, β-Dimethylacrylshikonin redusert cellelevedyktighet SGC-7901-celler i en dose- og tidsavhengig måte og indusert celle-apoptose. β, β-Dimethylacrylshikonin behandling i SGC-7901-celler nedregulert ekspresjon av XIAP, CIAP-2 og Bcl-2 og opp-regulert ekspresjon av Bak og Bax og forårsaket tap av mitokondriemembranpotensialet og frigjøring av cytokrom c . I tillegg β, β-dimethylacrylshikonin behandling førte til aktivering av kaspaser-9, 8 og 3, og spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), som ble opphevet ved forbehandling med pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK . β, β-Dimethylacrylshikonin indusert fosforylering av ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) i SGC-7901 celler. U0126, en spesifikk MEK-inhibitor, blokkerte ERK-aktivering ved β, β-dimethylacrylshikonin og avskaffet β, β-dimethylacrylshikonin indusert apoptose. Våre resultater viser at β, β-dimethylacrylshikonin hemmet veksten av magekreft SGC-7901 celler ved å fremkalle ERK signalveien, og gitt en ledetråd for preklinisk og klinisk evaluering av β, β-dimethylacrylshikonin for magekreft terapi.
Citation: Shen XJ, Wang HB, Ma XQ, Chen JH (2012) β, β-Dimethylacrylshikonin induserer Mitokondrier Dependent apoptose gjennom ERK Pathway i human magekreft SGC-7901 Cells. PLoS ONE syv (7): e41773. doi: 10,1371 /journal.pone.0041773
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 1 mars 2012; Godkjent: 25 juni 2012; Publisert: 27.07.2012
Copyright: © Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation Zhejiang i Kina til X-QM (LY12H28005), og vitenskapen grunnlaget for Zhejiang kinesiske Medical University til H-BW (2011ZY05). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de aggressive maligne tumorer, men med utviklingen av radioterapi, kjemoterapi og bioterapi, alvorlige bivirkninger er uunngåelig [1], og derfor mer effektive antitumormedikamenter med færre bivirkninger for behandling av magekreft er nødvendig.
Lithospermum erythrorhizon er en viktig kinesisk urt. Det har noen aktive komponenter: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (Fig. 1a) og Shikonin [2]. I tradisjonell kinesisk medisin, oppviser det flere biologiske funksjoner, inkludert anti-mikrobielle, anti-inflammatorisk, anti-tumor, immunregulering og anti-HIV-egenskapene [3] – [6]. Anti-tumoreffekten til shikonin og dets derivater ble først påvist av sin aktivitet mot tumorvekst hos murine Sarcoma-180 [7]. Shikonin utstillinger effekt ikke bare ved å drepe tumorceller direkte, men også ved inhibering av tumor angiogenese [8]. Undersøkelser viste at shikonin indusert apoptose i humane maligne melanom, blærekreft, livmorhalskreft, lungekreft og leverkreft, og så videre [9] – [13]. Men det har mindre bivirkninger og mer beskyttende effekt på humane normale celler [14], [15]. Hsu PC et al, viste at shikonin ført til celle apoptose ved oppregulering av p27, p53, Bax og nedregulering av Bcl-2 og Bcl-xL i human kolorektal karsinom COLO 205-celler [16]. Den tumorinvasjon hemmet ved shikonin i enkelte kreftceller kan gjennom nedregulering av NF-kB-mediert MMP-9 uttrykk [17]. Shikonin induserer også apoptose via ROS produksjon i leverkreft [12]. Singh F et al har også funnet at Shikonin reduserte fosforylerte nivåer av EGFR, ERK og protein-tyrosin-kinaser og økte intracellulære nivåer av apoptose-relaterte proteiner, noe som forårsaket epidermoid-karsinom-celler til å gjennomgå apoptose [18].
(A) den kjemiske strukturen til β, β-dimethylacrylshikonin (MW. 370,4). (B) Effekten av β, β-dimethylacrylshikonin på cellelevedyktigheten inhibering av SGC-7901-celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av β, β-dimethylacrylshikonin for 24 timer og 48 timer. Den relaterte cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-assay. Levedyktigheten til kontrollgruppen (0,1% DMSO) ble satt til 100%. Data representerer gjennomsnittet ± SD erholdt fra tre uavhengige eksperimenter. * Indikert p 0,05 sammenlignet med kontroll gruppe henholdsvis
Nyere bevis har vist at β, β-dimethylacrylshikonin hadde signifikant anti-tumor virkning på leverkreft ved aktivering av kaspase-3 [19].. Imidlertid har en slik virkning av β, β-dimethylacrylshikonin på humane magecancerceller ikke blitt rapportert, og de molekylære mekanismer er fortsatt ikke godt forstått. Derfor, i denne studien, vil vi diskutere effekten av β, β-dimethylacrylshikonin på human magekreft celle SGC-7901 og tilhørende signal å bedre forstå mekanismen av β, β-dimethylacrylshikonin på magekreft.
materialer og metoder
materialer og reagenser
SGC-7901 celler ble kjøpt fra Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection (Shanghai, Kina). β, β-Dimethylacrylshikonin ble kjøpt fra Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan). MTT og DAPI ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California, USA). U0126 ble kjøpt fra Cell Signaling (Boston, MA, USA). Pan-caspase inhibitor (Z-VAD-FMK) ble kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Shanghai, Kina). Antistoff for cytokrom c ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mot ERK, fosfor-ERK, Bcl-2, BCL-XL, XIAP, CIAP-2, survivn, Bax, Bak, kløyvde caspase-9, kløyvde caspase-3, kløyvde PARP og β-aktin ble kjøpt fra Cell Signaling ( Boston, MA, USA). FITC-Annexin V Apoptose Detection Kit ble kjøpt fra Becton Dickinson (San Diego, CA, USA).
Cell kultur og celleproliferasjonsanalyse
SGC-7901-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Utah), og holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Da celler ble sådd i en 96-brønners skål til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10
3 celler /brønn og inkubert i RPMI 1640-medium inneholdende 10% FCS i 24 timer, etter dette, ble cellene behandlet med den angitte konsentrasjon av β, β-dimethylacrylshikonin i 24 timer og 48 timer. Mediet ble fjernet og friskt medium ble tilsatt til hver brønn sammen med 20 ul av MTT-løsning (5 mg /ml). Etter 4 timers inkubering ble 150 ul DMSO tilsatt til hver brønn. Platene ble avlest ved bølgelengde på 570 nm ved hjelp Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Scientific, USA). Fire reduplicate brønner ble anvendt for hver behandling, og eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
morfologiske endringer
SGC-7901-celler ble plassert i en brønn i en seks-brønns plate. Etter 24 timers cellekultur, ble de behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin for de angitte tidsperioder. Den cellulære morfologi ble observert ved hjelp av en invertert mikroskopi. (Modell IX70, Olympus, Tokyo, Japan)
DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindole) farging
SGC-7901 celler ble plassert i en brønn i en seks-brønns plate. Etter 24 timers cellekultur, ble de behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin for de angitte tidsperioder, og deretter ble cellene fiksert i kald aceton i 30 min, og inkubert med DAPI (1 mg /ml) i 30 min. De apoptotiske kjerner karakterisert som intenst farget ble oppdaget ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. (Modell IX71, Olympus, Tokyo, Japan)
Annexin V /PI-analyser for apoptose
For Annexin V /PI analyser, celler ble farget med AnnexinV-FITC og PI, og evaluert for apoptose ved flowcytometri henhold til mannufacturer protokoll (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). I korthet, en x 10
5 celler ble vasket to ganger med PBS, og farget med 5 mL av AnnexinV-FITC og 5 ul av PI i 500 ul bindingsbuffer i 15 min ved romtemperatur i mørke. De apoptotiske celler ble bestemt ved bruk av BD FACS Diva programvare (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Annexin V-farging tjener som et mål for fosfatidylserin eksternalisering og cellene som er annexin V
+ /PI
-. Representere begynnelsen av apoptotiske celler
Måling av mitokondriemembranpotensialet
Cells ( 5 x 10
5 celler /ml) ble behandlet med eller uten β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) i 24 timer og farget med JC-1 (BD MitoScreen JC-1 Kit, Becton Dickinson, USA) for 15 minutter ved 37 ° C. Mitokondriemembranpotensialet ble detektert ved strømningscytometri (FACSCanto II, Becton Dickinson, USA).
Western Bloting analyse
Cellene ble behandlet med den angitte konsentrasjon av β, β-dimethylacrylshikonin for den angitte tid i RPMI 1640 medium med 10% FCS. Cellene ble oppsamlet i iskald PBS, og celleekstrakter ble fremstilt i RIPA-buffer med proteinase inhibitor cocktail fra Calbiochem (San Diego, CA). Proteinkonsentrasjonene av cellelysatene ble bestemt og kokt med gel-ladningsbuffer i 10 minutter ved 100 ° C. Prøver inneholdende 30 ug totalt protein ble underkastet elektroforese på 10% SDS-polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membran (Millipore, Temecula, CA). Etter overføring, ble membranen blokkert i TBST (TBS inneholdende 0,1% Tween 20) inneholdende 5% skummet melk i 2 timer, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 ° C med passende primære antistoffer. Etter vasking tre ganger i TBST, ble membranene inkubert i 2 timer ved 37 ° C med 1:5000 pepperrotperoksydase-konjugert egnede sekundære antistoffer. Til slutt ble membranene visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (Immun-Star WesternC Kit, Bio-Rad, USA).
immunfluorescens farging
Immunofluorescene farging ble brukt til å analysere subcellulære fordeling av cytokrom c i SGC-7901-celler indusert av β, β-dimethylacrylshikonin. Celler dyrket på sterile glass coverlips ble fiksert i kald aceton i 10 min. Etter permeabilisert med 0,3% Triton X-100 i 20 minutter ved romtemperatur, ble cellene blokkert i 3% bovint serumalbumin i 30 min, og inkubert over natten ved 4 ° C med anti-cytokrom c-antistoff (1:30). Etter vasking tre ganger i PBS, ble SGC-7901-celler merket med Alexa Fluor 488-konjugert sekundært antistoff. DAPI ble deretter lagt for nukleær farging. Mikroskopisk analyse ble utført ved hjelp av et fluorescerende mikroskopi (modell IX71, Olympus, Tokyo, Japan).
Statistisk analyse
Data rapportert er gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av tre uavhengige forsøk. De ble evaluert ved en-veis analyse av varians (ANOVA). Signifikante forskjeller ble etablert på p. 0,05
Resultater
β, hemmer β-Dimethylacrylshikonin levedyktighet SGC-7901 celler
For å bestemme den cytotoksiske effekten av β, β-dimethylacrylshikonin på mage kreftceller. SGC-7901-celler ble behandlet med 2,5, 5, 7,5, 10 umol /L av β, β-dimethylacrylshikonin i 24 timer og 48 timer ble den redusert levedyktighet av celler behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin ble 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3,18%, 67,19 ± 1,82%, og 61,76 ± 0,18% ved 24 timer sammenlignet med kjøretøy-behandlede celler (fig. 1B). For den 48 h behandling, cellenes levedyktighet var 52,03 ± 9,45% 38,99 ± 1,43% 30,70 ± 1,58%, og 27,4 ± 0,31% (fig. 1B). Den halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) av β, β-dimethylacrylshikonin for SGC-7901 celler var 11,04 mM og 2,89 mikrometer på 24 timer og 48 timer hhv.
β induserer β-Dimethylacrylshikonin SGC -7901 celler apoptose
SGC-7901-celler ble først behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin, viste resultatene at cellene gikk merket morfologiske endringer ved behandling med 10 umol /L β, β-dimethylacrylshikonin sammenlignet med den ubehandlede kontroll for 24 timer. I nærvær av β, β-dimethylacrylshikonin, SGC-7901 celletallet redusert, og cellene ble rund opp og små i form, og løsne fra platen sammenlignet med den negative kontroll-gruppen (fig. 2A). β, β-dimethylacrylshikonin også indusert kjerne kondensasjon med intensiv DAPI flekker i forhold til den kjernefysiske av kontroll SGC-7901-celler etter 24 timer (fig. 2B).
(A) Celle morfologi ble detektert ved hjelp av en invertert mikroskop med 200 × forstørrelse. (B) DNA kondens (hvit pil) ble målt ved DAPI flekken og analysert under et fluorescerende mikroskop med 200 × forstørrelse. (C) Den apoptotiske status ble evaluert ved Annexin V-FITC bindingsanalysen. Den nedre høyre del (Annexin V-FITC
+ /PI
-) ble ansett som tidlig stadium av apoptotiske celler og høyre del (Annexin V-FITC
+ /PI
+) ble betraktet så sent stadium av apoptotiske celler. Den nedre venstre del (Annexin V-FITC
– /PI
-) ble betraktet som levedyktige celler og øvre venstre del (Annexin V-FITC
– /PI
+) ble ansett som nekrotisk celler.
for å avgjøre om cytotoxity av β, β-dimethylacrylshikonin involvert apoptose, vurderte vi apoptotisk effekt av β, β-dimethylacrylshikonin i SGC-7901 celler ved flowcytometri for Annexin V og propidiumjodid ( PI) farging. Prosentandelen av tidlige apoptotiske celler (Annexin V
+ /PI
-) var 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3% og 24,4% som respons på kjøretøyet, 2.5, 5, 7.5, og 10 umol /L β, β-dimethylacrylshikonin henholdsvis for (2c fig.) 24 timer. Interessant, sent apoptotiske celler (Annexin V
+ /PI
+) signifikant økt i SGC-7901 celler (29,7% med 7,5 mikromol /l og 33,6% med 10 mikromol /L β, β-dimethylacrylshikonin behandling ) (fig. 2C).
β induserer β-dimethylacrylshikonin mitokondrielle hendelser assosiert med apoptose i SGC-7901 celler
BCL-2 familien proteiner inkluderer pro-apoptotiske proteiner (Bax, Bak og bud) og anti-apoptotiske proteiner (BCL-2, BCL-XL, CIAP-2, XIAP og survivin). De kan aktivere eller hemme frigjøring av nedstrøms faktorer som fører til aktivering av kaspase-3 og PARP i utførelsen av apoptose [20]. For å detektere de apoptose-relaterte proteiner, pro-apoptotiske proteiner (Bax, Bak) og anti-apoptotiske proteiner (XIAP, CIAP-2, Bcl-2, Bcl-xL, Survivin) ble påvist ved Western blotting etter SGC-7901 cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av β, β-dimethylacrylshikonin (0, 2,5, 5, 7,5 og 10 pmol /L) i 24 timer. Resultatene indikerte at β, β-dimethylacrylshikonin redusere ekspresjonen av XIAP, CIAP-2, Bcl-2 (fig. 3A). Imidlertid er nedregulering av XIAP og Bcl-2 var mindre uttalt, mens den nedregulering av CIAP-2 var ganske dramatisk og doseavhengig. Det var ingen signifikant endring av BCL-xL og survivn i SGC-7901 celler. Enten β kan β-dimethylacrylshikonin modulere uttrykk for pro-apoptotiske proteiner (Bax, Bak) ble også undersøkt. Vi fant at β, β-dimethylacrylshikonin øket ekspresjon av Bak på en doseavhengig måte, men hadde liten effekt på Bax (figur 3B).
Western blot-analyse for anti-apoptotiske proteiner:. Bcl-2, Bcl-xL, CIAP-2, XIAP og survivin (A), og pro-apoptotiske proteiner: Bax, Bak (B), og spaltet PARP, spaltet caspase-9, spaltet caspase-8, spaltet caspase-3 (C) i fullcelle-ekstrakter etter at SGC-7901-celler ble behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin i 24 timer. Proteinnivåer av aktin ble også målt som kontroller. (D) Deteksjon av mitokondriemembranpotensialet ved strømningscytometri. SGC-7901-celler ble behandlet med eller uten β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) i 24 timer og ble farget med JC-1 i 15 minutter ved 37 ° C og underkastet flowcytometri. (E) SGC-7901 celler ble fiksert og merket for cytokrom c (grønn) og DNA (blå). (F) SGC-7901-celler ble behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin i nærvær eller fravær av Z-VAD-FMK (10 umol /l) i 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse ved bruk av antistoff mot spaltede caspase-3, spaltet PARP. Proteinnivåer av aktin ble også målt som kontroller. (G) SGC-7901-celler ble behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin i nærvær eller fravær av Z-VAD-FMK (10 umol /l) i 24 timer. Den apoptotiske status ble bestemt ved Annexin V-FITC bindingsanalysen. Den nedre høyre del (Annexin V-FITC
+ /PI
-) ble ansett som tidlig stadium av apoptotiske celler og høyre del (Annexin V-FITC
+ /PI
+) ble betraktet så sent stadium av apoptotiske celler. Den nedre venstre del (Annexin V-FITC
– /PI
-) ble betraktet som levedyktige celler og øvre venstre del (Annexin V-FITC
– /PI
+) ble ansett som nekrotisk celler.
caspase familie proteiner er viktige enzymer for å utføre apoptose. Blant kaspase familiemedlemmer, caspase-3 er en nøkkel bøddel for apoptose i pattedyrceller [21]. Det kan aktiveres ved døden reseptor-mediert ytre caspase-8 sti og mitokondriene avhengig-caspase-9 indre vei [22], [23]. For ytterligere å forstå den molekylære mekanisme av apoptose, ble SGC-7901-celler ble behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin og påvist ved Western blotting-analyse for ekspresjon endring av caspase-3, caspase-8 og caspase-9, Resultatene viste doseavhengig økning av spaltet caspase-3, caspase-8 spaltet og spaltet caspase-9 i β, β-dimethylacrylshikonin behandlede celler. PARP-spaltning, en annen velkjent egenskap av apoptose, ble også funnet i β, β-dimethylacrylshikonin behandlede celler (Fig. 3C). Mitokondriell dysfunksjon indusert apoptose som ofte er resultat av en reduksjon av mitokondriemembranpotensialet. Det har vist seg å være sentral i den apoptotiske reaksjonsvei. De SGC-7901-celler ble behandlet med eller uten β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) i 24 timer, viste resultatene mitokondrier membranpotensialet ble redusert fra 98,6% til 56,9% etter β, β-dimethylacrylshikonin ble behandlet til SGC- 7901-celler (fig. 3D). Vi undersøkte neste fordeling og subcellulære lokalisering av cytokrom c for å finne hvorvidt mitokondriene reaksjonsveien er involvert i β, β-dimethylacrylshikonin indusert apoptose. Etter SGC-7901-celler ble behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) i 24 timer, ble fordelingen av cytokrom c visualisert med et konfokalt lasers mikroskop, er β, β-dimethylacrylshikonin behandlede celler viste uskarpt morfologi (fig. 3E) i motsetning til den selvsagt klart utseende i kontrollcellene, hvilket indikerer at translokasjon av cytokrom c fra mitokondriene inn i cytoplasma i β, β-dimethylacrylshikonin behandlede celler.
for ytterligere å bestemme hvilken rolle caspaseaktivering i β, β-dimethylacrylshikonin- indusert apoptose, behandlet vi SGC-7901 celler med pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK (10 mikromol /l) før β, β-dimethylacrylshikonin behandling. Den pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK forbehandling redusert uttrykk for kløyvde caspase-3, kløyvde PARP og redusert β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose (fig 3F . G). Disse dataene viste at mitokondrie-mediert caspase kaskade pathway spiller en svært viktig rolle i β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose.
β induserer β-Dimethylacrylshikonin vedvarende ERK-aktivering i SGC-7901 celler
Det ble vist at MAPK signale involvert i flere hendelser av cellulære påkjenninger og stimuli indusert celle apoptose [24], [25]. Vi undersøkte derfor aktivering av ERK, JNK og p38 etter β, β-dimethylacrylshikonin behandling. Som vist på fig. 4A B, fosforyleringen nivåene av ERK og JNK ble tilsynelatende økning i respons til β, β-dimethylacrylshikonin behandling i 2 timer, og fosforyleringen nivåene oppviste en doseavhengig måte. Dessuten fosforyleringen nivåer av ERK siste tjuefire timer. Imidlertid ble det ikke observert noen signifikante endringer i fosforylering nivåer av p38 etter β, β-dimethylacrylshikonin behandling (fig. 4C). Disse resultatene antydet at vedvarende aktivering av ERK er involvert i β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose i SGC-7901-celler.
SGC-7901-celler ble behandlet med den angitte β, β-dimethylacrylshikonin konsentrasjon eller den indikerte intervall, var de totale cellulære ekstrakter fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivåer av fosforylerte former av ERK (A), JNK (B) og p38 (C). Membraner ble reprobed med antistoffer mot total ERK, JNK og p38 for normalisering.
Den ERK signalveien er involvert i β, β-dimethylacrylshikonin indusert apoptose i SGC-7901 celler
deretter undersøkt hvorvidt β, β-dimethylacrylshikonin-indusert vedvarende aktivering av ERK signalveien spiller en rolle i apoptose. Som vist på fig. 5A B, Western blot-analyse avslørte at U0126 (en spesifikk MEK-inhibitor) inhiberte vedvarende ERK-aktivering og spaltning av caspase-3, PARP i β, β-dimethylacrylshikonin behandling mens den pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK hadde ingen virkning på β, β-dimethylacrylshikonin-indusert aktivering av ERK (fig. 5D). Dessuten U0126 redusert β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose i SGC-7901 celler (fig. 5C). Disse resultatene viste at β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose i SGC-7901-celler blir mediert av vedvarende aktivering av ERK signalveien.
(A) SGC-7901-celler ble forbehandlet eller ikke forbehandlet med U0126 ( 10 umol /l) og deretter tilsatt DMSO (kjøretøy) eller β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) i 2 timer, henholdsvis 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivået av fosforylert ERK. Proteinnivåer av totalt ERK ble også måle som kontroller. (B) SGC-7901-celler ble forbehandlet eller ikke forbehandlet med U0126 (10 umol /l) og deretter tilsatt DMSO (kjøretøy) eller β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) i 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse ved bruk av antistoff mot spaltede caspase-3, spaltet PARP. Proteinnivåer av aktin ble også målt som kontroller. (C) SGC-7901-celler ble behandlet med β, β-dimethylacrylshikonin i nærvær eller fravær av U0126 (10 umol /l) i 24 timer. Den apoptotiske status ble bestemt ved Annexin V-FITC bindingsanalysen. Den nedre høyre del (Annexin V-FITC
+ /PI
-) ble ansett som tidlig stadium av apoptotiske celler og høyre del (Annexin V-FITC
+ /PI
+) ble betraktet så sent stadium av apoptotiske celler. Den nedre venstre del (Annexin V-FITC
– /PI
-) ble betraktet som levedyktige celler og øvre venstre del (Annexin V-FITC
– /PI
+) ble ansett som nekrotisk celler. (D) SGC-7901-celler ble forbehandlet med eller uten Z-VAD-FMK (10 umol /l) ble inkubert ytterligere med β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) i 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivået av fosforylert ERK. Protein nivåer av ERK ble også målt som kontroller.
Diskusjoner
shikonin derivater er de aktive komponentene isolert fra kinesisk urte Lithospermum erythrorhizon [5]. Disse forbindelser er lovende legemiddelkandidater som de har blitt rapportert å ha flere kreft effekter in vivo og in vitro [5], [26]. Blant de komponenter av Lithospermum erythrorhizon, β, har β-Dimethylaerylshikonin viktig antitumoreffekter sammenlignet med andre aktive ingredienser [27]. Når det gjelder anti-kreft-aktivitet, ble shikonin-gjengitt celle apoptose gjennom aktivering av kaspase-avhengige reaksjonsveien som finnes i mange ondartede svulster. I denne studien undersøkte vi effekten av β, β-dimethylacrylshikonin på menneskelige magekreft SGC-7901 celler. Våre resultater viste at behandling av SGC-7901-celler med β viste β-dimethylacrylshikonin en signifikant cytotoksisk effekt overfor SGC-7901-celler i en dose- og tidsavhengig måte, og β, ble β-dimethylacrylshikonin indusert apoptose i SGC-7901-celler gjenspeiles av en økt tidlig apoptotiske celler (Annexin V
+ /PI
-). og sent apoptotiske celler (Annexin V
+ /PI
+)
forholdet mellom anti- og pro-apoptotiske proteinekspresjon, slik som Bcl-2 /Bax, er avgjørende for induksjon av apoptose, og den bestemmer i hvilken grad cellene å gjennomgå apoptose [28]. Mitokondrier spiller en viktig rolle i signaloverføring av apoptose [29]. Den translocalization av apoptotiske proteiner fra cytosol til mitokondriene fører til frigjøring av cytokrom c og andre mitokondrier-avledet aktivator av caspaser ved en reduksjon i mitokondriemembranpotensialet [30], [31]. Shikonin har blitt rapportert å indusere apoptose via mitokondriene reaksjonsveien i HepG2 celler [32]. I denne studien, viste vi at β, β-dimethylacrylshikonin nedregulert uttrykk for XIAP, CIAP-2 og Bcl-2 og oppregulert uttrykk for Bak og Bax, og forårsaket tap av mitokondriemembranen potensial og frigjøring av cytokrom c i SGC-7901 celler, i samsvar med mitokondrier avhengig apoptose. Observasjonen av β, β-dimethylacrylshikonin mediert aktivering av kaspase-9, caspase-3, og etterfølgende spaltning av PARP, i tillegg til det resultat at den pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK redusert β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose i SGC-7901 celler, noe som tyder på at mitokondrie-mediert caspase kaskade pathway spiller en nøkkelrolle i β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose. Tatt sammen, våre resultater indikerte at β, β-dimethylacrylshikonin regulerer uttrykket nivåer av apoptose-relaterte proteiner, bevirker cytokrom c frigjøring og trig-caspase-avhengig celle-apoptotisk død.
mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) regulerer diverse cellulære programmer, inkludert embryogenesis, spredning, differensiering og apoptose [33]. MAPK-familie proteiner er sammensatt av tre proteinkinaser: ERK1 /2 (ekstracellulære signalregulerte kinaser 1 og 2), JNK (c-Jun N-terminal kinase) og p38 [34], [35]. Generelt fører forbigående ERK-aktivering til celleproliferasjon, men vedvarende aktivering av ERK er assoctiated med differensiering [36]. Emerging bevis antyder at aktivering av ERK bidrar til apoptose. Jeong et al. viste at kaempferol forårsaket kreftcelle for å gjennomgå apoptose gjennom en ERK-avhengig reaksjonsvei [21], [37], [38]. Nylig har det blitt rapportert at icaritin induserer veksthemming og apoptose i humane PSMCs via ERK-signalveien [39]. Li et al. demonstrerte at aktivering av RAF /MEK /ERK-signalveien spiller en avgjørende rolle i kalsium-indusert apoptose av epitelceller linse [40]. Her fant vi også at vedvarende aktivering av ERK er involvert i β, β-dimethylacrylshikonin-indusert veksthemming og apoptose i SGC-7901 celler. U0126, en spesifikk inhibitor av MEK (MAPK /ERK-kinase), effektivt blokkert β, β-dimethylacrylshikonin-indusert ERK-aktivering og svekkede β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose, noe som tyder de pro-apoptotiske virkninger av β, β-dimethylacrylshikonin i SGC-7901-celler blir mediert av vedvarende aktivering av ERK1 /to signalveien.
som konklusjon, har vi funnet at β, β-dimethylacrylshikonin hemmet cellevekst og induserte apoptose i SGC-7901-celler. Vi studerte også de underliggende mekanismene som er involvert i β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose. Våre resultater viste at β, involverer β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose i reduksjon av XIAP, CIAP-2 og Bcl-2-protein ekspresjon og induksjon av Bak og Bax proteinekspresjon, og forårsaket tap av mitokondriemembranpotensialet og frigjøring av cytokrom c i SGC-7901 celler. Våre resultater viste også at β, β-dimethylacrylshikonin indusert apoptose involverer aktiveringen av caspase-3, caspase-8 og caspase-9 og spaltningen av PARP. Dessuten ERK signalveien også deltatt i β, β-dimethylacrylshikonin-indusert apoptose. Våre resultater indikerer at β, β-dimethylacrylshikonin kunne utvikles som en potensiell kreft middel mot human magekreft.
Takk
Vi vil takke H-BW for deres tekniske assistanse, og vi takker også X -QM og J-HC for nyttige kommentarer til denne artikkelen.
