Abstract
Bakgrunn
G-protein-koblede reseptorer (GPCR) er førsteklasses kandidater for romanen kreft forebygging og behandlingsstrategier. Vi søkte på forskjellig uttrykt GPCRs i node positive mage karsinomer.
metodikk /hovedfunnene
Differensial uttrykk for GPCRs i tre node positiv mot tre node negative tarm typen mage karsinom ble analysert ved genet matrise teknologi. Den kandidat gener CXCL12 og dens reseptor CXCR4 ble validert ved real-time revers-transkripsjon polymerase chain reaction i et uavhengig sett med 37 mage karsinom. Oversettelse ble studert ved immunhistokjemi i 347 gastriske karsinomer ved hjelp av microarray, så vel som i 61 samsvarende lymfeknutemetastaser. Protein uttrykket ble korrelert med clinicopathological pasientkarakteristika og overlevelse. 52 GPCRs og GPCR-relaterte gener var opp- eller nedregulert i node positiv magekreft, inkludert CXCL12. Differensiell ekspresjon av CXCL12 ble bekreftet ved RT-PCR og korrelert med lokal tumorvekst. CXCL12 immunopositivity var negativt assosiert med fjernmetastaser og tumor klasse. Kun 17% av mage karsinom viste CXCR4 immunopositive tumorceller, som ble assosiert med høyere lokal tumorutbredelse. 29% av mage karsinom viste CXCR4 positiv tumor microvessels. Vaskulær CXCR4 uttrykk var signifikant assosiert med høyere lokal tumorutbredelse samt høyere UICC-etapper. Når uttrykker begge, CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor microvessels disse svulstene også ble svært signifikant assosiert med høyere T- og UICC-etapper. Tre lymfeknutemetastaser avslørt vaskulær CXCR4 uttrykk mens kreftceller helt manglet CXCR4 i alle tilfeller. Uttrykket av CXCL12 og CXCR4 hadde ingen innvirkning på pasientens overlevelse.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater underbygger betydningen av GPCR på biologi mage karsinomer og gi bevis for at CXCL12-CXCR4 veien kan være en roman lovende antiangiogen mål for behandling av mage karsinom
Citation. Ingold B, Simon E, Ungethüm U, Kuban RJ, Müller BM, Lupp A, et al. (2010) Vaskulær CXCR4 uttrykk – en roman Antiangiogen Target i magekreft? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10,1371 /journal.pone.0010087
Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 22 september 2009; Godkjent: 16 mars 2010; Publisert: 08.04.2010
Copyright: © 2010 Ingold et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd av Berliner Krebshilfe (Berlin Canceraid). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformene i verden, ranking fjerde i samlet frekvens og regnskap for over 650.000 dødsfall årlig [1]. Dødeligheten av magekreft er bare utmerket seg ved lungekreft. Tidlig magekreft fører ofte ingen spesifikke symptomer. Mangelen på tidlige symptomer forsinker diagnose. Derfor 80-90% av vestlige pasienter med magekreft stede med avanserte svulster når lokale eller fjernmetastaser hadde allerede oppstått [1]. Lymfeknute status, spesielt forholdet mellom metastase-positiv /negativ metastase lymfeknuter, er den sterkeste prognostisk faktor av magekreft [2]. Den 5-års overlevelse for pasienter med 1-6 lymfeknutemetastaser er 44% og endte med bare 11% hos pasienter med mer enn 15 positive lymfeknuter. Delvis eller total gastrektomi, kombinert med adjuvant radioterapi og /eller kjemoterapi, som angitt, løfter fullstendig helbredelse kun i pasienter med tidlig fase sykdom. I metastatisk sykdom, i dag brukes radioterapeutiske og kjemoterapeutiske regimer har dårlig effekt og behandlingsresistente sykdomsprogresjon fører til død innen få måneder [3]. Til dags dato finnes det ingen spesifikk prediktiv markør som HER2 i brystkreft, EGFR i ikke-småcellet lungekreft eller K-RAS i tykktarmskreft, noe som muliggjør en mer individualisert terapeutisk strategi. Derfor er nye molekylære målrettede terapeutiske tilnærminger nødvendig.
G-protein-koblede reseptorer (GPCR) representerer den klart største familien av celleoverflatemolekyler, som stafett signaler via GTP-bindende protein (G-protein ) -klargjort andre messenger kaskader inn i cellen [4]. GPCR er regulert av mange agonister, men alle har en karakteristisk kjerne bestående av syv transmembrane α-helikser, noe som er knyttet sammen gjennom tre intra- og ekstracellulære tre sløyfer. Disse reseptorene kontrollere viktige fysiologiske funksjoner, inkludert neurotransmission, hormon og enzym utgivelse fra endokrine og eksokrine kjertler, immunresponser, muskel sammentrekning og blodtrykk regulering for å nevne noen [4].
Ondartede celler ofte kapre normale fysiologiske funksjoner av GPCR for å overleve, spre seg autonomt og unngå immunsystemet. Videre GPCRs spille en sentral rolle i tumorindusert angiogenese og kreft metastasering. Mange faste tumorer er avhengig av GPCR for å fremkalle en angiogen reaksjon, enten ved å virke på endoteliale eller stromale komponenter direkte eller ved regulering av frigjøring eller aktiviteten av andre angiogene mediatorer så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) eller basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) av stromal og immunceller [5]. Kreftceller manipulere GPCRs å tiltrekke endotelceller og føre dem til å invadere tumormassen, og dermed danne nye skip for å gi næringsstoff og oksygen. Mange kreftformer metastasere til spesifikke organer, hva som ofte er forårsaket av den avvikende ekspresjon av GPCR i kreftceller – spesielt kjemokinreseptorer – Samtidig med utgivelsen av kjemokiner fra de sekundære organer [6]
medikamentavgivelse, tumoravbildning. og biomarkører forutsi malignitet er anvendelser av GPCRs å markere: Radio-merkede peptider som binder til GPCR kan ha brede søknader om kreftdiagnose og behandling [7]. Ligander som binder GPCRs har også blitt konjugert til cytotoksiske midler spesifikt mot ondartede celler som overuttrykker disse reseptorene, derfor redusere bivirkninger [8]. Videre GPCR kan være verdifulle biomarkører for kreftdiagnose som påvist ved studier i prostatakreft [9].
Derfor vi forsøkte å (i) vurdere forskjellig uttrykt GPCRs i nodal negativ versus nodal positiv tarm typen magekreft etter Genechip matrise teknikk. (Ii) transkripsjon av kandidat gener ble validert av real-time revers-transkripsjon polymerase chain reaction (real-time RT-PCR). Vi evaluerte oversettelsen og histoanatomical fordeling av kjemokin CXCL12 og dens tilsvarende kjemokinreseptor CXCR4 i en stor serie av 347 gastrisk karsinom prøver immunohistokjemisk ved hjelp av vev microarray-teknologi samt i 61 samsvarende lymfeknutemetastaser på konvensjonelle bakker (iii). Vi korrelert de translasjonsforskning uttrykk mønstre med et rikelig sett clinicopathological pasientkarakteristika, inkludert pasient overlevelse (iv).
Resultater
Differensial genuttrykk i node negative og lymfeknutepositiv magekreft vev
Først studerte vi den differensielle ekspresjonen av mRNA i en serie av seks tarm typen magekreftpasienter (3 med og uten 3 lymfeknutemetastaser) ved hjelp av GeneChip® human Genome U133 Plus 2,0 Array fra Affymetrix som detekterer 47.000 transkripter og varianter samt 38 500 godt karakteriserte menneskelige gener. mRNA ble ekstrahert og transkribert bare fra vevsprøver hentet fra de primære svulster. Totalt 115 transkriptene ble funnet å være opp- og 219 for å bli nedregulert i knutepunkt positiv magekreft, sammenlignet med node negative mage kreft (tabell S1). Neste vi søkte på forskjellig uttrykt GPCR. Vi identifiserte 52 GPCRs og GPCR-relaterte gener, som var opp- eller nedregulert med en fold endring faktor på . 1.5 (tabell S2)
I silico
analyse
Vi søkte
Entrez
data base av «
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
» for oppføringer av GPCRs og GPCR-ligander og deres antatte rolle i tumorbiologi . Betydningen av angiotensin II type 1-reseptor i magekreft ble tidligere bekreftet av vår egen gruppe [10]. Flere studier hadde vist at ekspresjonen av Duffy blodtype kjemokinreseptor (DARC) korrelert inverst med utbredelsen og prognose av prostatakreft [11] – [13]. I dyremodell av brystkreft ekspresjonen av EDG2 korrelert med forekomsten av lungemetastaser [14]. FPRs megle effekten av annexin en på cellemotilitet og invasjon, som er viktig for metastatisk potensial av kreftceller [15]. LGR5 ble nylig vist å være en stamcelle markør for celler i tynntarmen og tykktarmen og stilk-cellespesifikk tap av APC resulterer i progressivt økende neoplasier [16]. Sammen er disse dataene gi bevis på at vår tilnærming identifisert GPCRs og GPCR-ligander som kan være involvert i magekreft biologi. Angå kjemokinreseptorer og chemokiner, ble uttrykket av kjemokiner CCL2 og CXCL12 økt i nodal positiv magekreft i forhold til nodal negative tilfeller (tilleggsbord S2). Siden CXCL12-CXCR4 aksen spiller en fremtredende rolle i tumorgenesen, fremme angiogenese og migrering av kreftceller til metastaser [17] – [19], valgte vi CXCL12 og dens reseptor CXCR4 for videre analyser
transkripsjon av. CXCL12 og CXCR4 i magekreft
differensial uttrykk for CXCL12- og CXCR4-mRNA ble validert ved real-time RT-PCR i et uavhengig sett med 37 intestinal typen magekreft prøver. Vi sammenlignet med ikke-neoplastiske mucosa med den primære tumor, så vel som primære tumorer i noden negativ med primære tumorer i node positive cancere.
CXCL12 ekspresjon ble betydelig økt i gastrisk karsinom, sammenlignet med ikke-neoplastiske mucosa (p = 0,033 ). Bekrefte tabelldata, CXCL12 uttrykk var også oppregulert i nodal positiv magekreft sammenlignet med nodal negative saker. Men denne forskjellen ikke statistisk signifikant (p = 0,132; figur 1a). Når det gjelder lokal tumorvekst, var det ingen signifikant forskjell i CXCL12 ekspresjon i PT1 /T2 stadium tumor mot PT3 /T4 tumorer. Men interessant CXCL12 uttrykk viste en signifikant sammenheng i PT1 /pT2a versus pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; figur 1b)
boksplott som viser total fordeling av CXCL12 i (a) nodal negativ i forhold til knute positiv gastrisk. Kreftsvulster og i (b) pt1 /T2a versus pT2b /T3 /T4 mage karsinom. Samlet fordeling av CXCR4 i (c) knute negativ i forhold til node gode gastriske karsinomer og (d) PT1 /T2a versus pT2b /T3 /T4 gastriske karsinomer. Box grenser:
th 25 og 75
th persentiler; heltrukken linje: median; værhår:. 10
th og 90
th persentiler
Det var verken en forskjell på CXCR4 uttrykk i magekarsinom versus ikke-neoplastisk vev (p = 0,229) og heller ikke i nodal negativ versus nodal positiv gastrisk karsinom (p = 0,22; figur 1c). Sammenligning CXCR4 uttrykk med den lokale tumor grad CXCR4-mRNA nivåer økt med lokal tumorvekst. (P = 0,079; figur 1d)
Oversettelse av CXCL12 i magekreft, korrelasjon med clinicopathological parametere og overlevelse analyser
oversettelse og histoanatomical distribusjon av CXCL12 ble senere studert ved immunhistokjemi i 347 magekarsinom prøver. I 291 tilfeller CXCL12 immunoreaktivitets var assessable. Svulstceller uttrykt CXCL12 i 244 av 291 (84%) prøver. En sterk cytoplasmisk og membran immunologisk reaksjon ble observert i 143 (49%) saker og en svak farging i 101 (35%). 47 svulster (16%) manglet CXCL12-immunoreaktivitets. Alle tumorprøver viste en tydelig CXCL12 positivitet av de vaskulære endotelceller, som tjente som en intern positiv kontroll (figur 2a-c). De statistiske analyser viste en signifikant korrelasjon mellom ekspresjonen av CXCL12 i tumorceller og fjerne metastaser (p = 0,043), så vel som tumor grad (p = 0,0064). Alle andre clinicopathological parametere viste ingen sammenheng med CXCL12 uttrykk i tumorceller (tabell 1). Ved fordeling av kullet i to grupper, dvs. tarm type og diffus typen gastrisk karsinom, ble det ikke funnet korrelasjon mellom CXCL12 uttrykk og en hvilken som helst clinicopathological parameter for hver gruppe (data ikke vist). Den CXCL12 uttrykk i tumorceller hadde ingen innvirkning på pasientens overlevelse (hele gruppen: p = 0,830; intestinal typen carcinoma: p = 0,766; diffuse typen carcinoma: p = 0,817)
magekarsinom prøver avsløre sterk (en. ) og svak (b) CXCL12 immunoreaktivitets. Bare noen få tilfeller var CXCL12 negative (c). Legg merke til positiv CXCL12 farging av blodkar (pil). Magekarsinom prøver som viser en klar cytoplasma og membran CXCR4 immunoreaktivitets var sparsom (d). Noen prøver viste en svak (e) CXCR4 farging mens de fleste av tumorene manglet CXCR4 uttrykket (f). Leukocytter tjente som intern positiv kontroll (piler). Skala: a-f: 50 pm
Oversettelse av CXCR4 i magekreft, korrelasjon med clinicopathological parametere og overlevelse analyserer
Oversettelse av CXCR4 ble også studert ved immunhistokjemi.. Immunreaktiviteten i tumorceller var vurderbar i 293 tumorprøver, hvorav bare 6 (2%) viste en utvetydig membranøs farging (kategori 2+; figur 2d). De fleste av CXCR4 positiv vevsprøver bare avdekket en svak cytoplasma CXCR4 immunoreaktivitets (kategori 1+, 44 tilfeller, 15%, figur 2e). Nuclear CXCR4 immunoreaktivitets ble ikke observert i alle fall, og hvilken som helst celle type. En samlet på 83% (243 til 293) av de gastriske karsinomer var immunonegative for CXCR4, de fleste av dem viser ledsagende CXCR4 positive leukocytter som en intern positiv kontroll (figur 2f). Interessant, som tidligere observert i kolorektale karsinomer, 86 av 293 gastriske karsinomer (29%) viste CXCR4 positive mikrokar i svulsten stroma med en sterk CXCR4 immunoreaktivitet av endoteliale celler (figur 3a). Den vaskulære naturen av disse delikate strukturene ble bekreftet av en CD34 farging (figur 3b).
magekarsinom prøver som viser sterk vaskulær CXCR4 immunoreaktivitets eller mangler CXCR4 uttrykket (a, c), angitt med piler. Vaskulære strukturer ble bekreftet av en CD34 farging (b, d). Skala: a-d: 50 mikrometer
Når korrelere CXCR4 uttrykk i tumorceller med ulike clinicopathological parametre ble CXCR4 uttrykk signifikant assosiert med høyere lokal tumorutbredelse (T-status; p = 0,030).. Det ble imidlertid ingen flere sammenslutninger av tumor CXCR4 uttrykk og andre clinicopathological variabler funnet (tabell 2). Når du analyserer undergruppen av tarm typen mage karsinom, ble ingen assosiasjoner funnet med noen clinicopathological parameter (data ikke vist).
Deretter studerte vi sammenhengen mellom CXCR4 uttrykk i endotelceller (vaskulær CXCR4 uttrykk, vCXCR4 ) av tumor microvessels og ulike clinicopathological parametere. Interessant, ekspresjonen av CXCR4 i microvessels korrelerte svært signifikant med den lokale tumorvekst (T-kategori; p = 0,0001) så vel som med den UICC-tumorstadium (p = 0,0059). Selv i de undergruppene av intestinal type og diffuse typen magekreft, ble vCXCR4 uttrykk signifikant assosiert med lokal tumorutbredelse (intestinal Type: p = 0,004; diffuse typen: p = 0,030) og UICC-tumorstadium (intestinal Type: p = 0,020) . Videre vCXCR4 ekspresjon var signifikant assosiert med pasientens alder (p = 0,0148) på hele gruppen (tabell 3).
overlevelsesanalyse viste at CXCR4-ekspresjon i tumorceller av gastrisk karsinom så vel som i tumor microvessels hadde ingen innvirkning på overlevelse
Samtidig CXCL12 /vCXCR4 uttrykk i magekreft
Siden CXCL12-CXCR4 aksen har vist seg å være involvert i tumorprogresjon [17] -. [19], vi undersøkt sammenhengen av samtidig uttrykk for CXCL12 og vCXCR4 med clinicopathological parametere. Faktisk ble CXCL12-vCXCR4 positive tumorer assosiert med høyere lokal tumorutbredelse (p = 0,0014) og høyere UICC stadier (p = 0,017). Men det hadde ingen innvirkning på pasientens overlevelse, selv i de undergruppene av tarm og diffuse typen magekreft.
Expression mønster av CXCL12 og CXCR4 i matchende lymfeknutemetastaser
De CXCL12-CXCR4 aksen har blitt rapportert å være involvert i metastatisk prosesser i ulike kreft enheter. Derfor undersøkte vi CXCL12 og CXCR4 immunoreaktivitets i en undergruppe av 61 treff lymfeknutemetastaser. Den CXCL12 uttrykksmønster var tilgjengelig for 46 metastaser. Overall, 4 lymfeknutemetastaser var CXCL12 negative som deres tilsvarende primærtumor. 40 lymfeknutemetastaser viste en klar CXCL12 positivitet i henhold til den primære tumor. Den fargeintensitet var svært heterogen viser sterkt positive tumorceller som grenser til svakt farget tumorcelleklynger. Men to metastaser avslørte CXCL12 immunoreaktivitets selv om ingen CXCL12 uttrykk har blitt oppdaget i den primære svulsten.
CXCR4 immunoreaktivitets ble undersøkt i 54 lymfeknutemetastaser. Interessant, ingen av dem viste noen CXCR4 uttrykk. Selv de tumorer (n = 6), viser en svak CXCR4 positivitet i den primære tumor, manglet CXCR4 uttrykk i de tilsvarende lymfeknutemetastaser. Men alle lymfeknutemetastaser åpenbart klart CXCR4 positive lymfocytter, som fungerte som intern positiv kontroll. Interessant, i tre tilfeller intratumoural CXCR4 positive microvessels var synlig.
Diskusjoner
G-protein-koblede reseptorer representerer den største familien av trans reseptorer. Fem prosent av alle menneskelige gener koden for mer enn 800 forskjellige GPCRs og ca 80 forskjellige ligander ble identifisert til nå [20]. GPCR er de vanligste farmakologiske mål i medisin, det vil si nesten 30% av alle legemidler er rettet mot GPCR. Bevis er økende som GPCRs kan også være lovende mål for kreftbehandling. I denne studie forsøkte vi å finne GPCR som er differensielt uttrykt i node positive gastriske cancere, og følgelig kan anses som fremtidige mål for magekreft behandling. Vi fant 52 GPCRs og GPCR-relaterte gener som er opp- eller nedregulert i node positiv primær magekreft vev sammenlignet med node negativ kreft. Flere av GPCR ble tidligere vist å være involvert i tumorbiologi, slik som AT1R, EDG2, DARC, og FPR1 [10], [11], [14], [15]. Mest interessant, vår liste også inkludert LGR5 [16], som nylig ble vist seg å være en stamcelle markør i tynntarmen og tykktarmen. Videre spesifikke tap av Apc i LGR5-positive celler resulterer i gradvis økende neoplasier. Dermed
i silico
validering av våre data støtter hypotesen om at GPCR er involvert i tumorbiologi av magekreft.
Våre påfølgende valideringsstudier ved hjelp av en gruppe uavhengige pasienter viste at GPCR- ligand CXCL12 uttrykkes i tumorceller til flertallet av gastriske karsinomer. Videre er CXCL12 uttrykk negativt assosiert med fjernmetastaser og tumor klasse. Det motsatte, bare 17% av mage karsinom viste CXCR4 immunopositive tumorceller, som ble assosiert med høyere lokal tumorutbredelse. Interessant, omtrent en tredjedel av gastriske karsinomer viste CXCR4 positiv tumor mikrokar. Vaskulær CXCR4 uttrykk var signifikant assosiert med høyere lokal tumorutbredelse samt høyere UICC-etapper. Når uttrykker begge, CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor microvessels disse svulstene også var signifikant assosiert med høyere T- og UICC-etapper, støtte rolle CXCL12-CXCR4 akse i neoangiogenesis av magekreft.
blant GPCR, kjemokinet systemet bidrar vesentlig til tumorprogresjon ved modulasjon av den lokale betennelsesreaksjon, tumorcelle-proliferasjon, migrering og overlevelse så vel som neoangiogenesis [4]. Kjemokinreseptoren CXCR4 innledningsvis ble funnet å regulere homing av lymfocytter i betennelse og representerer en co-reseptor for humant immunsviktvirus (HIV) [21]. Fysiologisk er CXCL12-CXCR4 akse som er involvert i overføringen av embryonale celler i sentralnervesystemet, benmarg og hjerte [22], [23]. Det spiller en avgjørende rolle i metastatiske prosesser som vist for brystkreft [24], [25], eggstokk [26] og prostata kreft [27] og CXCL12 er sterkt uttrykt i organer som er hyppige områder av fjernmetastaser som lunge, lever og lymfe noder [28]. I magekreft, data om CXCL12-CXCR4 veien er sparsom [29]. Det finnes bevis på at CXCR4 uttrykker gastriske karsinomer større sannsynlighet for å utvikle en peritoneal spredning av tumoren, og ondartet ascites inneholder høye konsentrasjoner av CXCL12 [30].
Sammenligning av våre genet matrisedata med dem som ble oppnådd ved RT-PCR og immunhistokjemi, var det interessant å merke seg at den differensielle ekspresjonen av CXCL12 i knutepunkt positiv gastrisk karsinom ble bekreftet på den transkripsjonelle men ikke på det translasjonelle nivå. Her immunhistokjemisk påvisning av CXCL12 i tumorceller korrelert bare med fjernmetastaser og svulst klasse, men ikke med nodal spredning. Imidlertid, CXCL12 ble funnet ikke bare i tumorceller, men også i endotel og stromale celler [31], og generell ekspresjon i hele vevet rommet er vanskeligere å vurdere ved immunohistokjemi. Det motsatte, våre transkripsjonelle studier anvendes vevshomogenater som integrerer alle CXCL12 uttrykkende celler av tumorvevet. Ikke desto mindre må det tas i betraktning at gentranskripsjon ikke alltid korrelerer med mRNA oversettelse, og at tumor biologiske effekten av CXCL12 kan også være avhengig av nærværet og histoanatomical fordeling av CXCR4. Til støtte for denne påstanden, var vi i stand til å vise at samtidig uttrykk for CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor microvessels korrelerte med lokal tumorvekst og UICC-tumor stadium.
Det ble rapportert at svulst CXCR4 positivitet betydelig korrelerer med utviklingen av peritoneal karsinomatose [30]. Videre sterk CXCR4 uttrykk ble signifikant assosiert med lymfeknutemetastaser, høyere UICC stadier og en redusert 5-års overlevelse [32]. Våre resultater ser ut til å avvike fra disse tidligere studier. Ved vurdering av CXCR4 immunoreaktivitets i tumorceller, ble en lav uttrykk hastighet observert. Kun 17% av tumorprøver viste en stort sett svak CXCR4 immunoreaktivitets. Videre alle 61 matchende lymfeknutemetastaser manglet CXCR4 uttrykk. Det fargemønster kan forklare hvorfor for eksempel tarm typen gastriske karsinomer, CXCR4 ekspresjon bare var signifikant assosiert med det lokale tumorvekst (T-category), men ikke med andre clinicopathological faktorer som tidligere beskrevet. Vi brukte en grundig karakterisert CXCR4 antistoff med en høyere spesifisitet enn kommersielt tilgjengelige antistoffer som vist ved Fisher og medarbeidere [33]. Denne forskjellen i spesifisitet kan tjene for forskjellige fargemønstre. For eksempel ble en kjernefysisk CXCR4 uttrykk, som ble rapportert å være assosiert med lymfeknutemetastaser i kolorektal kreft, ikke sett i serien [34]. Videre har vi aldri oppdaget CXCR4 positivitet i stromale celler som beskrevet i en studie av Saigusa og kolleger [35]. For å klargjøre, hvis CXCR4-CXCL12 vei til slutt bidrar til generasjon av metastaser i magekreft, spesielt lymfeknutemetastaser, skal videre studier er nødvendig.
Om lag en tredjedel av de undersøkte mage karsinom viste CXCR4 positiv tumour- rundt microvessels . Tumor celler krever tilstrekkelig tilførsel av oksygen og næringsstoffer for å opprettholde overlevelse. Selv med genetiske avvik som dysregulate vekst og overlevelse av individuelle celler, kan svulster ikke større enn 1-2 mm
3 uten vaskularisering og hypoksi-indusert celledød inntreffer. Det har vist seg at CXCR4 uttrykkes av endoteliale celler og stimulering av CXCR4 ved CXCL12 har en proangiogenic effekt [36]. Videre er CXCR4 en hypoksi induserbar gen, regulert av den hypoksi-indusert faktor 1α (HIF1α). Når oksygen er mangelvare som i raskt voksende svulster, HIF1α forsterker uttrykket CXCR4 [37]. Den økte ekspresjon av CXCR4 i endoteliale celler observert i vårt tumor kollektive kan være en del av en integrert hypoksisk reaksjon av den voksende tumor som gjør det mulig for generering av nye blodkar. I vår studie gruppe, vaskulær CXCR4 ekspresjon korrelerte signifikant med graden av lokal tumorvekst. I 8% av T1 /pT2a svulster (4 av 52), og i 34% av T2b /T3 /pt4 svulster (81 av 239) CXCR4 positive microvessels var synlig. T2b /T3 /T4-trinns mage karsinom mer sannsynlig havn en hypoksisk mikromiljøet enn T1 /T2a stadium svulster og dermed kan indusere CXCR4 genekspresjon og angiogenese. Påvisning av CXCR4 positive mikrokar i store lymfeknutemetastaser ( 9 mm i diameter) bekreftet disse observasjoner. Videre har vi tidligere har vist sammenlignbare resultater i kolorektal karsinom [38]. I tillegg, som vist i glioblastoma multiforme [39], tumorprøver avslørende begge, CXCL12 positive tumorceller og CXCR4 positive microvessels var sterkt signifikant assosiert med høy lokal tumorutbredelse og høye UICC trinn, noe som ytterligere støtter betydningen av en funksjonell CXCL12-CXCR4 akse i magekreft biologi
Oppsummert viser vi at GPCR er forskjellig uttrykt i magekreft vev og kan bidra til tumorbiologi. tumorer uttrykker begge, CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor rundt microvessels, viser en svært signifikant sammenheng med lokal tumorvekst og UICC stadier. Disse resultatene, sammen med våre tidligere data om tykktarmskreft, bygge rolle CXCL12-CXCR4 akse i tumor-neoangiogenesis i gastrointestinale svulster. Den CXCL12-CXCR4 veien kan være roman lovende antiangiogen mål for behandling av mage karsinom.
Materialer og metoder
Tumorprøver
Vevsprøver av magekreft ble oppnådd kirurgisk på Charité universitetssykehus Berlin (1995-2008). Dypfryst vev av 6 tilfeller av tarm typen magekreft ble brukt for Genechip analyse (nodal negative: 3 pasienter; nodal positive: 3 pasienter, kvinne-mann-ratio: 01:02). En uavhengig serie sammenkoblede kreft og tumor tilstøtende normalt vev fra 37 intestinal typen mage karsinom ble undersøkt ved real-time RT-PCR (nodal negativ: 12 pasienter; nodal positive: 25 pasienter, kvinne-mann-ratio: ~1:1 for detaljerte pasientkarakteristika se tabell S3). For immunhistokjemiske analyser, ble en pasient kohort av 347 påfølgende pasienter med magekreft undersøkes, bestående av 194 intestinal type og 122 diffuse typen karsinomer i henhold til Laurén klassifisering. 31 prøvene viste andre histologiske undergrupper (dvs. mucinous, rørformede, udifferensiert). Kort fortalt kohorten besto av 220 menn og 127 kvinner. Gjennomsnittsalderen til pasientene ved diagnosetidspunktet var 64 år. Survival data var tilgjengelig fra 196 av disse pasientene. Oppfølgingsdata for de andre pasientene manglet fordi disse pasientene ikke var bosatt i nærheten av sykehuset, og ble ikke fulgt opp. Ut av 196 pasienter, 124 døde under oppfølging. Median oppfølging for de pasientene fortsatt i live ved endepunktet for analysen var 33 måneder. Av 61 pasienter, vev av matchende lymfeknutemetastaser var tilgjengelig (27 intestinal type 26 diffuse typen, 8 andre histologiske subtyper). Kun pasienter med histologisk bekreftet magekreft og tilstrekkelig vev tilgjengelig ble inkludert. Pasienter med neoadjuvantly behandlet magekreft eller andre kjente maligniteter ble ekskludert fra studien. Dette prosjektet ble godkjent av den lokale etikkutvalg (ref. Nummer EA1 /06/2004).
Genechip analyse
Total RNA ble isolert med fenol-kloroform bruker Mirvana ™ miRNA Isolation Kit ( Ambion, Austin, USA). Kontaminerende DNA ble fjernet ved DNase-behandling (Turbo DNAfree kit; Ambion, Austin, USA) ved 37 ° C i 30 minutter. Vi brukte GeneChip® Human Genome U133 Plus 2,0 matriser (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll for å analysere mRNA-ekspresjonsnivåer. Affymetrix GeneChip® kjøreprogramvare (GCOS 1.4) automatiserer kontroll av GeneChip® lufthåndtering stasjoner og GeneChip® Scanner 3000.
Bioinformatikk
Rådata ble analysert med Affymetrix Genechip Operating programvare (GCOS 1,4) . Påvisning p-verdi på en transkripsjon bestemmer deteksjon samtalen, som indikerer om det registreres pålitelig transkripsjon (p 0,05, finnes) eller ikke funnet (fraværende). For å aktivere sammenligningen mellom chips dataene ble skalert til et globalt intensitet 500. Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) og GeneSpring programvarepakke 7,2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) ble brukt til å gjennomsnittlige resultater fra ulike prøver og utføre statistisk analyse for å sammenligne mellom magekreft med (N1) og uten (N0) lymfeknutemetastaser. Dataene i seks matriser ble normalisert for å ta hensyn til variasjon i hybridisering til probe-par og andre hybridiseringsbetingelser gjenstander. Normaliseringen består av følgende tre trinn: først, datatransformasjon (sett målinger mindre enn 300,0 til 300,0); andre, per chip (normal hver brikke til den 50. persentil av målingene tatt fra at chip); og for det tredje pr gen (normalisere hvert gen til medianen av målingene for det genet). Flippen endringen ble beregnet for hvert gen som det aritmetiske gjennomsnittet av de normaliserte uttrykk verdier av N1 dividert med det aritmetiske gjennomsnittet av de normaliserte uttrykk verdier av N0. Rådata fra microarray eksperimenter ble lastet opp til Gene Expression Omnibus Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc acc=GSE17187).
Real-time revers transkriptase polymerase chain reaction
For cDNA syntese, 2 mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av Omniscript RT Kit (Qiagen). Genet spesifikke primere ble designet av den BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berlin, Tyskland). Primersekvensene var som følger: CXCR4 5 «CAG CAG GTA GCA AAG TGA CG, 3» CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 «CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3’CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG;
