Abstract
Bakgrunn
Over- ekspresjon av Aurora-kinaser fremmer tumorgenese av celler. Målet med denne studien var å fastslå prekliniske profil av en roman pan-Aurora kinase inhibitor, BPR1K653, som kandidat for anti-kreft terapi. Siden ekspresjonen av medikamentet efflukspumpen, MDR1, reduserer effekten av forskjellige kjemoterapeutiske forbindelser i humane cancere, denne studien også sikte på å fastslå om styrken av BPR1K653 kunne bli påvirket av ekspresjonen av MDR1 i kreftceller.
hovedfunnene
BPR1K653 hemmet spesielt aktiviteten av Aurora-A og Aurora-B kinase ved lave nano-molare konsentrasjoner
in vitro
. Anti-proliferativ aktivitet av BPR1K653 ble evaluert i forskjellige humane kreftcellelinjer. Resultater av klonogene analysen viste at BPR1K653 var potent i rettet mot en rekke kreftcellelinjer uavhengig av vev opprinnelse, p53 status, eller uttrykk for MDR1. På cellenivå, BPR1K653 indusert endo-replikasjon og påfølgende apoptose i begge MDR1-negative og MDR1-positive cancerceller. Viktigere, det viste potent aktivitet mot veksten av xenografttumorer av den humane cervikale karsinom KB og KB-avledet MDR1-positive KB-VIN10 celler i nakne mus. Endelig BPR1K653 også utstilt gunstige farmakokinetiske egenskaper hos rotter.
Konklusjoner og Betydning
BPR1K653 er en roman potent anti-kreft sammensatte, og sin styrke påvirkes ikke av uttrykket av flere resistent protein, MDR1, i kreftceller. Derfor er BPR1K653 en lovende anti-kreft forbindelse som har potensial for håndtering av ulike kreftformer, spesielt for pasienter med MDR1-relaterte legemiddelresistens etter lengre kjemoterapeutiske behandlinger
Citation. Cheung CHA, Lin WH, Hsu JT -A, time TC, Yeh TK, Ko S, et al. (2011) BPR1K653, en Novel Aurora Kinase Inhibitor, utstillinger potent anti-proliferativ aktivitet i MDR1 (P-gp170) -mediert multiresistente kreftceller. PLoS ONE 6 (8): e23485. doi: 10,1371 /journal.pone.0023485
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 13 juni 2011; Godkjent: 18 juli 2011; Publisert: 24 august 2011
Copyright: © 2011 Cheung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet med tilskudd fra National Science Council (NSC99-2323-B-400-006, NSC99-2323-B-400-007, NSC99-2120-M-006-005), Department of Health (DOH99-TD-C -111 til 004), og National Health Research Institutes (CA-099-PP-02), Taiwan Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mitose er et viktig steg i cellesyklusen som er tett regulert av mange proteiner. Unormal ekspresjon eller aktivering av disse regulatoriske proteiner kan føre til avvikende mitose, som fører til utvikling av kreft [1], [2]. På molekylært nivå, Aurora kinaser (Aurora-A, Aurora-B og Aurora-C) er serin /treonin kinaser som fungerer som viktige regulatorer av mitose. Under normale fysiologiske forhold, og de er avgjørende for spindelenheten, sentrosomen modning, kromosomsegregering og cytokinese [3], [4]. Under patologiske tilstander, er det blitt demonstrert at Aurora-kinaser er over-uttrykt i forskjellige humane kreftformer og også spilt en viktig rolle i prosessen med tumorgenese [5], [6], [7], [8]. For eksempel er Aurora-A kinase over-uttrykt i øvre gastrointestinale adenokarsinomer [6]. I tillegg har en sammenheng mellom Aurora-A uttrykk nivåer og tumorprogresjon er påvist hos pasienter med hode- og nakke plateepitelkarsinom [9]. På den annen side er Aurora-B kinase ofte over-uttrykt i primær NSCLC og maligne gliomer, glioblastomer spesielt [10], [11]. Siden over-ekspresjon av Aurora-A og Aurora-B er ofte forbundet med tumorgenese, har disse molekylene er målrettet for kreftterapi. Den første proof-of-concept pan-Aurora kinase inhibitor, VX-680 (MK-0457, Tozasertib), ble utviklet i 2004 av Vertex Pharmaceuticals (i samarbeid med Merck) med sikte på å målrette kreftceller. Denne spesifikke inhibitor har vist seg effektive i å målrette kreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo
, og har fått godkjennelse fra amerikanske Food and Drug Administration (FDA) for å gå inn kliniske studier [12 ], [13], [14]. Siden da har kontinuerlig arbeid er gjort av ulike farmasøytiske selskaper på jakt etter potensielle Aurora kinase hemmere som viser bedre terapeutisk profil og spesifisitet som sammenlignet med den første generasjonen hemmer, VX680 [15], [16], [17], [18] [19], [20], [21], [22], [23].
til tross for tidlige suksesser av utviklingen av ulike Aurora kinase hemmere, nyere studier viser at effekten av mange av disse utviklet og klinisk testede inhibitorer, inkludert VX680, PHA-739358 og AZD1152, kan bli påvirket av ekspresjon av multiresistens protein MDR1 (P-gp170) i kreftceller [24], [25]. Faktisk over-ekspresjon av MDR1 også griper inn i et bredt spekter av forskjellige kjemoterapeutiske midler [2], [26], [27], [28], [29]. For eksempler, reduserer uttrykk for det transmembran narkotika efflukspumpen, MDR1, følsomheten av kreftceller til paclitaxel, vinkristin (anti-mikrotubulidynamikk agenter), doxorubicin (DNA innføyningsmiddel), mitoksantron, VP-16 (topoisomerase II-hemmere) og imatinib (tyrosinkinase-inhibitor) [28], [30], [31], [32], [33], [34]. Derfor har det vært stor interesse for å identifisere nye anti-kreft-forbindelser som kan overvinne MDR1 messige motstand og også oppviser forbedrede farmakologiske profiler.
I denne studien ble en ny pan-Aurora-kinase-inhibitor med tittel BPR1K653 ble utviklet og sin potens mot ulike MDR1-negative og MDR1-positive cancerceller ble evaluert. Resultatene av denne studien viser at i motsetning til de ovennevnte kjemoterapeutika, er BPR1K653 effektivt i målretting både MDR1-negative og -positive kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre utstillinger BPR1K653 gunstige farmakokinetiske egenskaper
in vivo
.
Resultater
BPR1K653 er en potent og selektiv pan-Aurora kinase inhibitor
I vitro
kinase-inhiberingsanalysen viste at BPR1K653 (figur 1A) inhiberte aktiviteten til Aurora-A og -B-kinase med en IC
50 verdi på 124 nM og 45 nM, respektivt (figur 1B og tabell 1). Selektiviteten av BPR1K653 ble så evaluert mot forskjellige kinaser. BPR1K653 oppviste mindre styrke (dvs. IC
50 10 pM) til å inhibere aktiviteten av ALK, CHK1, cMET, EGFR, FLT3, VEGFR1 og VEGFR2 sammenlignet med Aurora-A og Aurora-B kinase (tabell 1). Den cellulære aktivitet av BPR1K653 ble også undersøkt. Aktivering av Aurora-A-kinase krever en auto-fosforylering på Thr288 rest, mens fosforylering av Thr232 rest er en viktig reguleringsmekanisme for Aurora-B-aktivering [35], [36]. Her, Western blot-analyse avslørte at mengden av fosfor-Aurora-A, -B og -C kinase til stede i HCT116 kreftceller behandlet med en pan-Aurora-kinase-inhibitor, VX680 (positiv kontroll), ble redusert på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 1C). Reduksjon av fosfor-Histone H3 (Ser10), et direkte substrat av Aurora-B-kinase, er mye brukt som en indikator for Aurora-kinase-hemning i celler. Her VX680 også redusert mengden av fosfor-Histone H3 (Ser10) som er tilstede i celler som forvente (figur 1C). I samsvar med disse funn BPR1K653 induserte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i fosfor Aurora-A, -B og -C kinase i HCT116-celler. HCT116-celler behandlet med BPR1K653 viste også en konsentrasjonsavhengig reduksjon i fosfor Histone H3 (figur 1C).
(A) Kjemisk struktur av anti-kreft forbindelse BPR1K653. (B) BPR1K653 hemmet aktiviteten til både Aurora-A og Aurora-B kinase som avslørt av
in vitro
kinase hemming analysen. (C) HCT116 kreftceller ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BPR1K653 og det kommersielt tilgjengelige pan-Aurora-kinase-inhibitor VX680, og ekspresjon av forskjellige proteiner ble analysert ved Western blotting. Tubulin ble brukt som intern kontroll.
BPR1K653 hemmer spredning av flere humane kreftcellelinjer uavhengig av deres vev opprinnelse og p53 status
For å avgjøre om BPR1K653 kunne hemme celleproliferasjon, et panel på 11 forskjellige cancercellelinjer ble behandlet med BPR1K653. For sammenligning, ble cellene også behandlet med to velkarakteriserte Aurora-kinase-inhibitorer, VX680, og PHA739358. Det har blitt vist at tap av p53-funksjon induserer multilegemiddelresistens i noen typer kreft [37]. Her, Resultatene av klonogene analysen avslørte at BPR1K653 var effektiv (dvs. IC
50 0,5 uM) mot forskjellige typer kreftceller, inkludert lunge- (A549), oral (Hone-1 og OECM-1) cervical (KB) , kolon (HT29), blære (NTUB1) og leukemi /lymfom (MV4-11 og IM9), uavhengig av deres p53 status (tabell 2). Dessuten ble styrken av BPR1K653 vist å være høyere enn for VX680 og PHA739358 i de fleste av de testede cancercellelinjer (tabell 2). IC
50 verdier av VX680 og PHA739358 i forskjellige cancercellelinjer (bortsett fra i OECM-1-celler) var 2-10 folder høyere enn de BPR1K653. IC
50-årene av VX680 og BPR1K653 var lik i OECM-1 celler. Tatt sammen, resultatene demonstrerte at BPR1K653 er i stand til å hemme proliferasjonen av forskjellige typer av kreftcelle uavhengig av deres opprinnelse og vev p53 status.
BPR1K653 er like potent ved inhibering av veksten av FLERE legemiddelresistens protein (MDR1) -expressing kreftceller
Det har vært mye vist at overekspresjon av MDR1 (P-gp, medikament efflukspumpen) induserer resistens til forskjellige kjemoterapeutiske midler. For å avgjøre om styrken av BPR1K653 oppheves av MDR1 uttrykk i kreftceller, tre multilegemiddelresistente MDR1-uttrykke kreftcellelinjer, KB-VIN10, KB-S15 og NTU0.017 [2], [38], [39], [ ,,,0],40], ble behandlet med BPR1K653. Som vist i tabell 3, IC
50 verdi av BPR1K653 til KB-VIN10 og KB-S15 var lik de av de paren MDR1-negative KB-celler. IC
50 av BPR1K653 til KB-VIN10, KB-S15 og KB var 14 nM, 11 nM og 12 nM. I tillegg IC
50 verdi av BPR1K653 til MDR1-uttrykk NTU0.017-celler var også lik den til foreldre MDR1-negative NTUB1-celler (tabell 3). Tidligere studier viser at Aurora kinase hemmere, VX680 og PHA739358, er substrater av MDR1 [24], [25]. Konsekvent, alle våre testede MDR1-uttrykke kreftcellelinjer viste kryss-resistente mot VX680 og PHA739358 (tabell 3). I tillegg var nivået av MDR1 ekspresjon korrelerte med nivået av VX680 /PHA-739358 motstand i KB-VIN10 og KB-S15 cancerceller (figur 2). For ytterligere å avgjøre om styrken av VX680 og PHA739358 i KB-VIN10, KB-S15 og NTU0.017 celler ble faktisk påvirket av uttrykk for MDR1, celler ble samtidig behandling med MDR1 modulator (negativ regulator), verapamil, og celle levedyktigheten ble bestemt. Her ble verapamil behandling (10 uM) vist seg å være i stand til å gjenopprette /øke følsomheten overfor både VX680 og PHA739358 i alle de testede MDR1-uttrykkende kreftceller (tabell 3). Imidlertid verapamil behandling kan ikke ytterligere å øke følsomheten til BPR1K653 i begge MDR-negative og MDR1-uttrykkende kreftceller (data ikke vist). På den annen side har det blitt vist at en KB avledet VP-16 resistent cancercellelinje, KB-7D, over-uttrykker en annen type av den ATP-avhengige multimedikament utstrømning protein, PPR1 [41]. Interessant, IC
50 verdi av BPR1K653 til KB-7D var også lik den til foreldre MRP1-negative KB-celler (tabell 3).
Totalt mRNA ble ekstrahert fra celler og RT-PCR ble utført for å påvise uttrykk av MDR1 i KB, KB-VIN10 og KB-S15 celler. GAPDH ble brukt som intern kontroll.
BPR1K653 induserer endo-replikasjon i begge MDR1-negative og -positive kreftceller
Videre forsøk ble utført for å bekrefte de ovennevnte funn som effektiviteten av BPR1K653 påvirkes ikke av MDR1 ekspresjon i celler. Hemming av Aurora-kinaser induserer endo-reduplication av celler, noe som indikerer ved dannelse av polyploidi [14]. Her resultatene av immunfluorescens mikroskopi og flowcytometrisk analyse viste tydelig at BPR1K653 indusert dannelse av polyploidi (populasjoner 4N) i KB celler (figur 3A og B, og figur S1 A). MDR1-uttrykke KB-VIN10 celler behandlet med de samme konsentrasjoner av BPR1K653 som hadde blitt brukt på KB celler også indusert dannelsen av polyploidi (figur 3A og C, og figur S1 A). I motsetning til dette, VX680 bare induserte dannelsen av polyploidi i KB-celler, men ikke i KB-VIN10 celler under de samme behandlingskonsentrasjon (figur 3A, B og C). Dannelse av den polyploidi populasjonen ble vist i KB-VIN10-celler ko-behandlet med 10 pM av MDR-inhibitor, verapamil, og VX680 (figur 3C). Disse resultatene er i samsvar med funnene i den ovennevnte klonogene analyse som uttrykk for MDR1 i kreftceller påvirker effektiviteten av VX680 men ikke fra BPR1K653.
(A, B og C) KB og KB-VIN10 celler ble behandlet med BPR1K653 og VX680 i 48 timer. (A) Nucleus ble farget blå med Hoechst fargestoff og mikrotubuli ble merket rødt med Alexa Fluor®-merket anti-tubulin antistoff. (B og C) Celler ble inkubert med propidiumjodid og deretter analysert ved flow-cytometri. (D og E) hone-1 celler ble behandlet med BPR1K653 i 48 timer. (D) Nucleus ble farget blå med Hoechst fargestoff. (E) Cellene ble inkubert med propidiumjodid og senere analysert ved flowcytometri.
For å avgjøre om BPR1K653 induserer også endo-replikering i andre enn KB og dens deriverte, HONE-1 celler ble kreftcellelinjer behandlet med BPR1K653 og cellulære innholdet ble analysert ved microcopy og flowcytometri. Både immunfluorescens mikroskopi og flowcytometrisk analyse viste klart at BPR1K653 fremmet dannelsen av polyploidi (populasjoner 4N). I Hone-1 celler i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 3D og E)
BPR1K653 reduserer Histone H3 fosforylering og cyklin B1-ekspresjon i både MDR1-negative og -positive kreftceller
Western blot-analyse ble utført for å bekrefte at effektiviteten av BPR1K653 ikke påvirkes av MDR1 ekspresjon i kreftceller. Histon H3 er et direkte substrat av Aurora-B-kinase, og endo-replikerende celler vanligvis vise reduksjon av ekspresjonen av cyclin B1. I dette eksperiment ble hemmingen av Histone H3 fosforylering og nedregulering av cyclin B1 ekspresjon er vist i både KB og KB-VIN10 celler behandlet med de samme konsentrasjoner, 12 (IC
50), 24 (2 x IC
50) og 36 nM (3 x IC
50) av BPR1K653 på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 4A og B). I samsvar med disse funnene, VX680 behandling (dvs. 170 nM og 255 nM) også hemmet fosforylering av Histone H3 og uttrykk for cyclin B1 i KB-celler (figur 4A). Men samme VX680 behandling kunne ikke fremkalle de ovennevnte molekylære endringer i MDR1-uttrykke KB-VIN10 celler. Verapamil behandling (10 uM) ble vist å gjenopprette følsomheten til VX680 i KB-VIN10-celler, som angitt ved en reduksjon i den Histone H3 fosforylering og cyklin B1 uttrykk (figur 4B).
(A) KB-celler ble behandlet med BPR1K653 og VX680 i 48 timer og ekspresjon av forskjellige proteiner ble bestemt ved Western blot-analyse. Relative bandet intensiteter ble vist. (B) KB-VIN10-celler ble behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 med /uten verapamil i 48 timer, og ekspresjon av forskjellige proteiner ble bestemt ved Western blot-analyse. Relative bandet intensiteter ble vist. (C) HONE-1-cellene ble behandlet med BPR1K653 i 48 timer, og ekspresjon av forskjellige proteiner ble bestemt ved Western blot-analyse. Actin ble brukt som intern kontroll.
For å avgjøre om BPR1K653 reduserer også Histone H3 fosforylering og cyclin B1 uttrykk i andre enn KB og dens deriverte, HONE-1 celler kreft cellelinjer ble behandlet med BPR1K653 og intracellulære proteiner ble analysert ved Western blotting. Western blot analyse viste tydelig at både fosforylering av Histone H3 og uttrykk for cyclin B1 ble redusert i BPR1K653 behandlet hone-1 celler (Figur 4C).
BPR1K653 induserer apoptose i både MDR1-negative og -positivt kreft celler
Tidligere studier viser at targeting Aurora kinaser induserer celle endo-replikasjon og påfølgende celle apoptose [14]. For å avgjøre om BPR1K653 er i stand til å indusere apoptose i begge MDR1-positive og -negative kreftceller, KB og KB-VIN10 celler ble behandlet med BPR1K653 og apoptotiske egenskaper ble analysert ved Annexin-V, real-time caspase-3 /-7 aktivitet bildebehandling og tunel analyser. Her ble både cytoplasmisk volum og størrelsen på kjernen økt i de BPR1K653-behandlede KB og KB-VIN10 celler, noe som indikerer at BPR1K653 indusert celle endo-replikasjon som forventet (fig 5A og C, og fig S1A). Translokasjon av den fosfatidylserin molekylet fra den indre paknings av cellemembranen til den ytre membran indikerer forekomsten av tidlig apoptose. Resultatene av Annexin V-analyse viste at BPR1K653 indusert translokasjon av fosfatidylserin molekylet i begge KB og KB-celler VIN10, som indikerer ved det grønne fluorescerende markør (figur 5A). BPR1K653 også indusert caspase-3 /-7-aktivitet og DNA-fragmentering i begge KB og KB-celler VIN10 under de samme behandlingsforhold (figur 5B, C, D, og fig S1A). I motsetning til dette, VX680 bare indusert translokasjon av fosfatidylserin molekylet, caspase-3 /-7-aktivitet og DNA-fragmentering i KB-celler og ikke i MDR1-uttrykkende KB-VIN10-celler (figur 5A, B, C og D). Videre spalting av PARP ble bare vist i MDR1-uttrykke KB-VIN10 celler behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 /verapamil (co-behandling), og ikke med VX680 alene, som avslørt av Western blot analyse (figur 5E).
(A, B og C) KB og KB-VIN10 celler ble sådd på 8-brønners kammerobjektglass over natten. (A) Celler ble behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 i 48 timer. Translokasjon av fosfatidylserin molekylet i cellene ble analysert ved Annexin-V-FLUOS analyse og cellene ble sett ved bruk av en UV-aktivert mikroskop. Generelt cellemorfologi ble visualisert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi. (B) Celler ble behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 i 60 timer og MagicRed ™ -DEVD sanntid Caspase-3 /-7 aktivitet kit (Immunokjemiske Technologies LLC) ble brukt til å påvise aktiveringen av caspase-3 /-7 i cellene som antydet med den røde fluorescens-emisjon. Nucleus ble kontra blåfarget av Hoechst 33342, og cellene ble vist i sanntid ved hjelp av en UV-aktivert invertert mikroskop. (C og D) Deteksjon av celler med DNA-fragmentering ved TUNEL assay. KB og KB-VIN10-celler ble behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 i 72 timer. DNA fragmentations ble analysert ved hjelp av TMR-rødt
In Situ
celledød Detection kit. Nucleus med DNA-fragmentering ble farget rødt. Nucleus ble kontra blåfarget av DAPI. Celler ble analysert ved hjelp av en UV-aktivert mikroskop. (C) Representative bildene ble vist. (D) Merkede celler ble tellet, og andelen av apoptotiske celler ble beregnet som følger: Total mengde av den røde fluorescens-merkede (DNA fragmentert) kjernen tilgjengelig ÷ totale mengde av den blå fluorescens-merkede kjernen tilgjengelig x 100. Forsøkene ble gjentatt to ganger. (E) BPR1K653 induserer spalting av PARP i KB-VIN10 kreftceller. KB-VIN10-celler ble behandlet med enten BPR1K653 (2 x IC
50 av KB) eller VX680 (2 x IC
50 av KB) med /uten verapamil i 72 timer. Spaltingen av PARP ble bestemt ved Western blot-analyse. Actin ble brukt som intern kontroll.
BPR1K653 også indusert apoptose i Hone-1 celler, som indikert av induksjon av caspae-3 /-7 aktivitet
in vitro plakater (Figur S1B).
BPR1K653 undertrykker vekst av både menneskelige MDR1-negative og -positivt kreft xenografter
in vivo
Selv om de ovennevnte resultatene viste at BPR1K653 viser potent anti-kreft effekten
in vitro
, eksperimenter ble utført for å bestemme hvorvidt BPR1K653 er også i stand til å inhibere aktiviteten til Aurora-kinaser og veksten av både MDR1-negativ /positiv tumorer
in vivo
. KB-celler ble dyrket som
s.c.
Svulster i nakne mus. Når veletablerte KB xenografter var følbar med tumor størrelse på ca 75 mm
3, mus ble randomisert inn i bilen kontroll- og behandlingsgrupper på fem dyr hver. Det behandlede mus fikk enten 15 mg /kg av BPR1K653 eller 30 mg /kg av VX680
i.p..
I 5 dager /uke for 2 sammenhengende uker. Resultatene av immuno-histokjemisk analyse av tumor vevssnittene viste at administrering av BPR1K653 redusert mengden av fosfor-Histone H3-positive celler som er tilstede i tumorvev sammenlignet med kontroll (10% vs 60%) (figur 6A). En reduksjon i hastigheten av tumorvekst i mus behandlet med enten BPR1K653 eller VX680 5 dager /uke i 2 etterfølgende uker, ble også observert. Det var en ~73% reduksjon i tumorvolum på dag 30 i de dyrene behandlet med BPR1K653 (P 0,05). I tillegg var det en ~68% reduksjon i tumorvolum på dag 30 i de dyrene behandlet med VX680 (P 0,05, figur 6B). BPR1K653 ble godt tolerert ved dose på 15 mg /kg uten noen tegn på toksisitet i KB-xenograft tumormodell som tap av kroppsvekten etter behandlingen var mindre enn 10% i behandlingsgruppen som i forhold til kontrollgruppen (figur 6C ). For å avgjøre om hemming av tumorvekst i BPR1K653-behandlede mus ble knyttet til økning av apoptotiske kreft cellepopulasjoner, ble svulster kirurgisk fjernet fra musene 12 dager etter behandling og vevssnitt ble analysert ved TUNEL analysen. Resultatene av TUNEL-analysen viste at mengden av apoptotiske celler i tumorvevet av BPR1K653-behandlede mus var signifikant høyere enn de i kontrollmusene (55% vs 7%) (figur 6D). Dette stemmer overens med resultatet av den ovennevnte
in vitro eksperiment som
BPR1K652 er i stand til å indusere apoptose kreftceller.
(A, B, C og D) Nakne mus som bærer humane cervikale karsinom KB xenotransplantater ble behandlet med kjøretøy kontroll (⧫), 30 mg /kg VX680 i 5 dager /uke i 2 uker (på dager 6-10 og 13-17, ▴) eller 15 mg /kg BPR0L075 5 dager /uke i 2 uker (på dager 6-10 og 13-17, •). (A) BPR1K653 behandling redusert mengden av fosfor-Histone H3 positive celler i tumor vev. Immuno-histokjemisk analyse av ekspresjonen av fosfor-Histone H3 i tumorvevet seksjonene 24 timer etter den andre BPR1K653 administrasjon. Nucleus var farget blå /lilla med hematoksylin og fosfor-Histone H3 ble merket i brun farge. Merkede celler ble tellet, og prosentandel av fosfor Histone H3-positive celler som er tilstede i tumorvev ble beregnet som følger: Total mengde av celler med brun farge merket ÷ Total mengde av celler som er tilgjengelig x 100. Eksperimentet ble gjentatt to ganger. En statistisk signifikant forskjell i mengden av fosfor-Histone H3-positive celler som er tilstede i tumorvev hos mus behandlet med kontroll versus BPR1K653 er angitt med «*». * P 0,05. (B) Måling av tumorvolumet. En statistisk signifikant forskjell i tumorstørrelse hos mus behandlet med kontroll versus BPR1K653 og VX680 er angitt med «*». * P 0,05. (C) Måling av dyrets vekt. (D) TUNEL analyse av tumorvev §§ 12 dager etter BPR1K653 behandling. Svulstvev seksjonene ble analysert av FITC
In Situ
Celledød deteksjon kit og fluorescerende mikroskopi. Vev behandlet med DNase ble anvendt som positiv kontroll. Grønn fluorescens-merket kjernen indikerer induksjonen av DNA-fragmentering. Eksperimentet ble gjentatt to ganger. Kvantitativ analyse ble vist. En statistisk signifikant forskjell i mengden av apoptotiske celler i tumorvev hos mus behandlet med kontroll versus BPR1K653 er angitt med «*». * P 0,05. (E og F) Nude mus med P-gp170 /MDR-uttrykke KB-VIN10 xenograft ble behandlet med kjøretøy kontroll (⧫), 30 mg /kg VX680 i 5 dager /uke i 3 uker (på dager 12-16, 19 -23 og 26-30, ▴) eller 15 mg /kg BPR0L075 5 dager /uke i 3 uker (på dag 12-16, 19-23 og 26-30, •). (E) Måling av tumorvolumet. En statistisk signifikant forskjell i tumorstørrelse hos mus behandlet med kontroll versus BPR1K653 og VX680 er angitt med «*». * P 0,05. (F) Måling av dyrets vekt. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tumorvolum (mm
3) ved hvert tidspunkt (n = 5; * P 0,05).
Spesielt er BPR1K653 også like effektiv mot MDR1- uttrykkende tumor xenograft som det er i dyrkede MDR1-uttrykkende celler. Her ble KB-VIN10 tumor xenograft brukes for å evaluere effekten av BPR1K653 mot MDR1-uttrykke svulst
in vivo
. På grunn av den langsomme voksende egenskapene til KB-VIN10, fikk den behandlede musene enten 15 mg /kg av BPR1K653 eller 30 mg /kg av VX680
ip
5 dager /uke i 3 sammenhengende uker i stedet for 2 uker som i KB-implantert mus. I forhold til kontrollmusene, veksten av KB-VIN10 tumor ble betydelig inhibert i mus behandlet med 15 mg /kg BPR1K653. Det var et ~ 50% reduksjon i tumorvolum på dag 42 i de dyrene behandlet med BPR1K653 (P 0,05). I motsetning til dette ble VX680 ikke oppviser signifikant tumorveksthemmende virkning på mus transplantert med KB-VIN10 celler (figur 6E). Videre BPR1K653 ble godt tolerert i dosering av 15 mg /kg (5 dager /uke i 3 sammenhengende uker) med ingen tegn på toksisitet i KB-VIN10 xenograft tumor modell som tap av kroppsvekt etter behandling var mindre enn 10 % i behandlingsgruppen som sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6F). Dermed utøver BPR1K653 potent anti-tumor effekt mot både MDR-negative og MDR-uttrykker tumorxenotransplantater.
farmakokinetikk BPR1K653 i rotter
Til slutt ble vist farmakokinetiske studier av BPR1K653 over en 24 h periode for å undersøke plasmakonsentrasjoner av BPR1K653 etter en enkel intravenøs administrering (tabell 4). Etter en enkelt administrering av BPR1K653 ved en dose på 5 mg /kg til rotter, oppnås BPR1K653 en maksimal plasmakonsentrasjon på 10 pM (5463 ng /mL) i 2 minutter etter dosering, og den estimerte BPR1K653 plasmakonsentrasjonen forble ved en konsentrasjon på 3,9 nM (2,1 ng /ml) 24 timer etter dosering. Plasmahalveringstiden, total clearance, og distribusjonsvolum ved steady state (Vss) var 3,9 ± 0,7 timer, 49,3 ± 10,6 ml /min /kg og 10,6 ± 5,1 l /kg, henholdsvis.
Diskusjoner
Aurora kinaser har dukket opp som viktige regulatorer av mitose og bevis indikerer abnormiteter i sitt uttrykk og aktivitet er nært knyttet til utvikling og progresjon av ulike kreftformer. I denne studien har vi utviklet en ny pan-Aurora kinase inhibitor BPR1K653 og ytterligere demonstrert sin effekt i målretting ulike typer kreft
in vitro
. Våre pervious røntgen co-krystallografi studier hadde vist de fysiske samspillet mellom forløperforbindelse BPR1K653 og Aurora kinaser [42], og den nåværende
in vitro
kinase hemming studie har bekreftet målet spesifisitet BPR1K653. I samsvar med de molekylære endringer observert i celler behandlet med Aurora-B kinase spesifikke siRNA oligos og med forskjellige pan-Aurora kinase hemmere som VX680 og SNS-314 [14], [43], [44], BPR1K653 behandling induserer også endo- replikasjon av celler og reduserer mengden av fosforylert Histone H3 tilstede i celler. I tillegg er BPR1K653 stand til å indusere apoptose kreftceller, men ikke autofagi (figur S2), som er det vanlige resultat i celler behandlet med Aurora-kinase-inhibitorer [43]. Interessant er BPR1K653 aktiv i alle de testet p53-hvete /-negativ /-mutant kreftcellelinjer til lave nano-molar konsentrasjoner (IC
50 20 nM), til tross for begrenset evne til annen pan-Aurora kinase inhibitor VX680 for å indusere endo-replikasjon og påfølgende apoptose er vist i kreftceller med normal p53-avhengig post-mitotiske sjekkpunkt funksjon i andre studier [14]. Til sammen BPR1K653 selektivt hemme Aurora kinaser, og i motsetning til VX680, er det i stand til å målrette ulike typer kreftceller uavhengig av p53 status.
Drug motstand er et vanlig problem i forvaltningen av neoplastiske sykdommer, og effektiviteten av mange kjemoterapeutiske medikamenter er begrenset av det faktum at de er substrater for efflukspumpen MDR1 (P-gp170). For eksempel, Aurora-kinase-inhibitoren AZD1152 /AZD1152-HQPA (Barasertib) ble vist å være substratet av MDR1 [24]. Videre våre referanse Aurora kinase hemmere, VX680 (Tozasertib) og PHA-739358 (Danusertib), ble tidligere vist ineffektive i målretting MDR1-uttrykke SA-DX5 (doxorubicin resistent), MB-231-PTX og H460-PTX (begge paclitaxel resistente) kreftceller hos andre forskere [25]. I denne studien ble BPR1K653 vist seg å være like effektiv mot to KB-avledet MDR1-positive kreftcellelinjer (KB-VIN10 og KB-S15) og en NTUB1-dervided MDR1-positive kreftcellelinje (NTU0.017)
in vitro
. Denne funksjonen er forskjellig fra de av godt karakterisert Aurora kinase hemmere, VX680 og PHA-739 358, fordi våre testede MDR1-positive kreftcellene er mer motstandsdyktig mot disse cytostatika enn foreldre MDR1-negative celler. Faktisk, co-inkubering av MDR1 inhibitor, verapamil, ble vist å være effektiv i å re-sensibiliserende MDR1-uttrykkende kreftceller til både VX680 og PHA-739 358, mens den samme behandling ikke kunne øke følsomheten til BPR1K653 ikke i noen MDR1- negativ (KB og NTUB1) eller MDR1-uttrykke celler (KB-VIN10, KB-S15 og NTU0.017). Viktigere, BPR1K653 er også effektiv i å inhibere veksten av både MDR1-negative KB og MDR1-uttrykk KB-VIN10 cancerceller
in vivo
, noe som ytterligere støtter hypotesen om at over-ekspresjon av vanlig legemiddel efflukspumpen MDR1 kunne ikke forstyrrer effektiviteten av BPR1K653 i målretting kreftceller. Siden kjemoterapeutiske forbindelser som paclitaxel, vinkristin (anti-mikrotubulidynamikk midler), doxorubicin (DNA interkalerende agent), tretinoin (
all-trans
retinsyre), mitoxantrone, VP-16 (topoisomerase II-hemmere) og imatinib (
