Abstract
Magekreft (GC) er fortsatt en viktig årsak til sykelighet og dødelighet på verdensbasis, og det er derfor et klart behov for å søke etter mer følsomme tidlig diagnostiske biomarkører. Vi utførte en systematisk gjennomgang av åtte publiserte miRNA profilering studier som sammenlignet GC vev med tilstøtende noncancerous vev. En miRNA vurdering systemet ble brukt som tok hyppigheten av sammenligninger, retning av differensial uttrykk og total utvalgsstørrelse i betraktning. Vi identifiserte fem mirnas som ble mest konsekvent rapportert å være oppregulert (MIR-21, MIR-106b, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a) og to mirnas som ble nedregulert (MIR-378 og MIR-638). Seks av disse ble ytterligere validert i 32 parvise sett av GC og tilstøtende prøver noncancerous vev ved hjelp av real-time PCR. MiR-21, MIR-106b, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a ble bekreftet å være upregulatedin GC vev, mens uttrykket av MIR-378 ble redusert. Videre fant vi en signifikant sammenheng mellom uttrykk nivåer av MIR-21, MIR-106b, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a og clinicopathological funksjoner i GC. Disse mirnas kan brukes til diagnostisering og /eller prognostiske biomarkører for GC og derfor garanterer videre etterforskning
Citation. Wang J-L, Hu Y, Kong X, Wang Z-H, Chen H-Y, Xu J et al. (2013) Kandidat mikroRNA Biomarkører i Human Gastric Cancer: en systematisk og valideringsstudie. PLoS ONE 8 (9): e73683. doi: 10,1371 /journal.pone.0073683
Redaktør: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: May 16, 2013; Godkjent: 19 juli 2013; Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National Key Program (nr 30830055), Ministry of Public Health, Kina (nr 200 802 094), Kunnskapsdepartementet (nr 20090073110077) til Fang JY, og legen Innovation Foundation av Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr BXJ201219) til Wang JL. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for en ny reduksjon i forekomsten av mage kreft (GC) [1], er det fortsatt en årsak til betydelig sykelighet og dødelighet over hele verden, særlig i Øst-Asia. Totalt en million nye tilfeller av GC skjedde i 2008, med 738,000 dødsfall [2]. Dette utgjør 8% av det totale antallet tilfeller av kreft og 10% av alle dødsfall. Selv om endoskopi kan detektere de tidlige stadier av GC, er de fleste tilfeller fremdeles diagnostiseres på et avansert stadium, noe som resulterer i en dårlig prognose [3]. Den 5-års overlevelse for GC tilfeller med stadium II varierer fra 30% til 50%, men faller til mellom 10% og 25% for pasienter med stadium III sykdom [4]. Selv endoskopiske teknikker er i rask utvikling, er deres verdi for tidlig deteksjon av GC begrenset på grunn av mangel på sensitivitet, høye kostnader og ulemper. Nye diagnostiske og prognostiske biomarkører for GC blir derfor raskt behov.
microRNAs (miRNA) er kort kodende RNA-molekyler av 19-25 nt. De regulerer genekspresjon ved den post-translasjonelle nivå ved å lede den RNA-induserte lyddemping for komplekse til miRNA målområder i den 3 «ikke-translaterte region av mRNA, som fører til mRNA degradering eller inhibering av translasjon [5]. Tidligere studier har vist at mange mirnas er avvikende uttrykk på mange typer kreft, og miRNA uttrykket profilering har vist visse mirnas å bli assosiert med tumor utvikling, progresjon og effekten av behandlingen. De er derfor gode kandidater for bruk som diagnostiske, prognostiske og prediktive biomarkører [6].
Flere studier har blitt gjennomført for å søke etter biomarkører ved å identifisere differensial uttrykk for miRNAs mellom GC vevsprøver og tilsvarende ikke-tumor mage vev fra den samme pasient [7] – [14]. Disse studiene har resultert i identifisering av hundrevis av forskjellig uttrykt miRNAs. Imidlertid er mange av disse er sannsynlig å være falske positiver, og bare en liten del kan brukes som diagnostiske eller prognostiske biomarkører. En logisk tilnærming til å skille viktige mirnas fra et stort antall kandidat miRNA lister er å søke etter krysset av miRNAs identifisert i flere uavhengige studier [15]. Selv om denne metoden har blitt økende populære [15], [16], [17], ikke publisert studie har identifisert skjæringene mellom GC-relaterte mirnas basert på et stort antall miRNA ekspresjonsanalyse studier.
Vi har utført dette systematisk gjennomgang for å identifisere de viktigste forskjellig uttrykt mirnas som har vært konsekvent rapportert i en rekke uavhengige miRNA uttrykket profilering studier i GC pasienter. Videre tilbyr vi ytterligere validert noen av miRNAs som var mest opp- eller nedregulert med real-time PCR i 32 par av GC og matchet vevsprøver tilstøtende ikke-tumor.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
studiet ble godkjent av etisk komité i Shanghai Jiaotong University School of Medicine, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter ved studiestart.
Søk Strategi
Potensielle studier publisert på engelsk ble hentet fra Medline ved hjelp av følgende søkeord: «miRNA» eller «mikroRNA «OR» Mir «,» mage «OR» mage «,» profilering «OR» microarray «. Lister over referanser av oversiktsartikler og originalartikler ble søkt manuelt for flere publikasjoner.
inklusjonskriteriene i litteratur
For en studie for å bli inkludert i denne systematiske, flere kriterier måtte være oppfylt : 1) studier måtte være miRNA profilering studier i GC pasienter; 2) studier måtte bruke GC vev og deres tilsvarende tilstøtende ikke-tumorvev for sammenligning; 3) metoder måtte omfatte miRNA microarray teknikker. Videre ble bare fulltekst publikasjoner på engelsk inkludert. Profileringen studier som brukte GC cellelinjer eller serumprøver fra GC pasienter, de som sammenlignet GC biopsier fra svulster med forskjellige stadier av sykdommen, og de som brukte ulike miRNA teknologier ble ikke inkludert. Oversiktsartikler ble heller ikke inkludert i denne systemisk anmeldelse.
Data Utvinning og Lister over miRNA
uttrykt forskjellig mirnas ble identifisert fra hver inkludert profilering studien. Relevant informasjon ble bestemt (dvs. kromosom plassering, pre-miRNA lengde, moden miRNA sekvens og potensielle mål av mirnas), og manglende informasjon ble identifisert fra miRBase database (www. Mirbase.org/) og Pubmed.
Ranking
Hver inkludert profilering studie [7] – [14] laget en liste over forskjellig uttrykt mirnas (Tabell S1). Griffith og Chan utviklet en metode for å rangere potensielle biomarkører molekyl for sammenligningsgruppene [16], [17], som har vært brukt for miRNA profilering studier. For eksempel, Ma et al. [15] identifisert kryss av kolorektal kreft-relaterte mirnas basert på et stort antall miRNA profilering studier. Dermed ble kriteriene for litteraturen inngår i denne aktuelle systematisk vurdering basert på de i sine rapporter [15]. Mirnas ble rangert til kriteriene i følgende rekkefølge av betydning: (i) miRNA ble konsekvent rapportert som forskjellig uttrykt i en konsekvent retning av endring; (Ii) frekvensen av den miRNA ble rapportert i microarray undersøkelser; (Iii) den totale utvalgsstørrelsen for hver konsekvent rapportert mirnas.
Validering av miRNAs Bruke Real Time PCR
For å validere profilerings resultater, 32 friske GC vev og deres paret ikke-tumor mage vev ble hentet fra Renji Hospital, tilknyttet Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Total RNA ble ekstrahert fra 32 par av passet humane GC prøver (inkludert kreft og tilstøtende noncancerous vev) ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen). RNA-konsentrasjonen og renheten ble målt ved anvendelse av Nanodrop ND-2000, og den ultrafiolett absorpsjon målemetoden ble brukt for å detektere renheten av RNA, bare de A260 /A280 som ligger mellom 1,80 til 2,00, og A260 /A230 1,7, ble anvendt for det endelige eksperiment, ellers RNA må skiftes ut. Revers transkripsjon fra 3 ug RNA ble gjort usingAll-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit (Genecopoeia, Guangzhou, Kina), i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk, ble den fremstilte RNA reverstranskripsjonsreaksjonsløsningen inkubert ved 37 ° C i 60 minutter og ble avsluttet ved 85 ° C i 5 minutter, og deretter lagret ved -20 ° C for videre analyse. Kvantitativ PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av en ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA) med SYBR Premiks Ex Taq II (Takara). Primerne (MIR-21-5p, MIR-106b-5p, MIR-17-5p, MIR-18a-5p, MIR-20a-5p og MIR-378-5p) inkludert U6 ble hentet fra Genecopoeia (Guangzhou, Kina) . Kvantifisering ble beregnet ved hjelp av to -ΔΔCT metode og presenteres som normalisert mønster.
Statistical Analysis
Resultatene ble analysert ved hjelp av SAS 9.2-programvare (SAS Institute Inc. USA). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. T-test ble brukt for å sammenligne verdier mellom to uavhengige grupper.
Resultater
Litteratur Utvalg og studere Kjennetegn
Totalt 104 studier ble søkt i Pubmed bruke vår søke strategi, 73 av disse ble ekskludert etter screening av titler og sammendrag. 23 studier ble ekskludert etter å ha lest hele teksten. Bare åtte studier ble til slutt inkludert i denne systematiske. Den detaljerte studier utvalget ble vist i figur 1. De detaljerte egenskapene til hver studie er gitt i tabell 1.
uttrykt forskjellig mirnas
Det er totalt 223 forskjellig uttrykt mirnas ble rapportert i de åtte microarray studier (forskjellig uttrykt mirnas i hver studie ble beskrevet i tabell S1); 124 ble oppregulert i GC, og 99 ble nedregulert. Blant de 223 forskjellig uttrykt mirnas, 48 ble rapportert hos minst to studier; 39 (81,3%) hadde en konsekvent retning og ni (18,7%) hadde en inkonsekvent retning av endret uttrykk. Blant de tidligere 39, 20 ble oppregulert i GC, og 19 ble nedregulert. Tre av disse miRNAs ble rapportert i fem microarray studier (MIR-21, MIR-106B og MIR-378), fire ble rapportert i fire studier (MIR-17, MIR-18a, MIR-20a og MIR-638), og syv ble rapportert i tre studier (MIR-19a, MIR-20b, MIR-25, MIR-30d, MIR-923, MIR-375, og MIR-148a). Deres kromosom steder, pre-miRNA lengder, modne sekvenser og de potensielle mål er oppført i tabellene 2-4.
Validering av de utvalgte miRNAs i GC Pasienter
for å validere uttrykk av de seks mest konsekvent rapportert mirnas (MIR-21, MIR-106B, MIR-17, MIR-18a, MIR-20a og MIR-378), uttrykket av disse miRNAs i GC biopsier og tilstøtende noncancerous vev ble sammenlignet i 32 tilfeller av GC ved hjelp av real-time PCR. Den rå Ct-verdier på de seks mirnas ble vist i tabell S2.The Resultatene viste at MIR-378 ble nedregulert i GC vev, mens de andre fem mirnas (MIR-21, MIR-106B, MIR-17, MIR-18a og MIR ^ 20) ble oppregulert ved GC (figur 2). Resultatene var i overensstemmelse med de av de opprinnelige profilerings studiene. Videre utforsket vi forholdet mellom ekspresjonen av disse mirnas med de kliniske og patologiske trekk ved GC. Vi fant at uttrykket av MIR-21 var signifikant høyere i tilfeller av GC tilfeller med større tumor størrelser (≥8 cm), dårlig differensiering og metastasering med spredning til lymfeknuter og senere stadium sykdommen. MiR-106b, MIR-17 og MIR-18a nivåene var signifikant høyere i dårlig differensiert GC, saker med spredning til lymfeknuter, eller sent stadium sykdommen, mens MIR-20a nivåene var signifikant høyere i tilfeller av GC med spredning til lymfeknuter. Men ingen sammenheng ble funnet mellom uttrykket av MIR-378 og clinicopathological funksjoner i GC. Disse resultatene er beskrevet i Tabell 5.
Bruke U6 som en normalisering kontroll, uttrykket av MIR-21, MIR-106b, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a var betydelig høyere i GC vev, mens uttrykket av MIR-378 var betydelig lavere.
Diskusjoner
miRNA microarray studier gir mengder informasjon, men en felles ulempen er mangelen på konsistens mellom ulike studier . Ifølge rapporter fra Griffith et al. og Chan et al. [16], [17], en logisk løsning på dette problemet ville være å bestemme overensstemmelse mellom ulike studier benyttet ulike microarray plattformer. Flere systema [15] – [17] har brukt denne metoden for å bestemme differensielt uttrykte gener eller mirnas i ulike sykdomstilstander. Bruk av en lignende metode, observerte vi at totalt 48 forskjellig uttrykt mirnas ble rapportert hos minst to uavhengige studier blant åtte GC miRNA profilering studier [7] – [14]. Blant disse ble 39 mirnas rapportert å bli forandret på en konsistent retning, mens resultatene for ni var inkonsekvent. Blant de 39 mirnas som hadde konsistente endringer ble 20 mirnas konsekvent oppregulert i GC sammenlignet med noncancerous mage vev, og 19 ble konsekvent nedregulert i GC. Vi identifiserte fem mirnas som ble mest konsekvent oppregulert (MIR-21, MIR-106a, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a) og to mest konsekvent nedregulert (MIR-378 og MIR-638) i minst fire profilering studier. Deretter validert vi disse funnene ved hjelp av real-time PCR, som videre støttet funnene i denne systematiske. Vi har også fastslått at uttrykket av disse miRNAs korrelerte med clinicopathological funksjonene i GC, som foreslo at disse miRNAs kan være nyttige som biomarkører for GC.
En av de mest gjennomgående rapportert oppregulert miRNA i vår systema var MIR -21, som har endret uttrykk og onkogen aktivitet i ulike kreft hos mennesker. Cui et al. [18] viste at ekspresjonen av MIR-21 var signifikant høyere i GC vev sammenlignet med tilstøtende normalt vev. Ekspresjonen av MIR-21 er også blitt funnet å være høyere hos pasienter med GC med lymfeknutemetastase enn de uten, og var også signifikant korrelert med den histologiske tumortype og pTNM trinn [19], som ble validert ved vårt studium. Videre høyere uttrykk nivåer av MIR-21 spådd dårlig overlevelse hos pasienter med GC [19]. Andre studier har funnet at MIR-21 kan fremme tumor proliferasjon og invasjon i GC ved å undertrykke ekspresjon av PTEN eller PDCD4 [20], [21]. I tillegg har tidligere studier også avdekket onkogene aktiviteten til MIR-21 i tykktarmskreft [22], brystkreft [23] og spiserørskreft [24].
MiR-106b ble også konsekvent rapportert som en oppregulert miRNA i GC vev av denne og tidligere studier [14], [25]. Den høye uttrykk for MIR-106b har tidligere blitt assosiert med lymfeknutemetastase [25], [26], og dette ble bekreftet i vår studie. Kim et al. [27] fant at Mir-106b kan utøve sin onkogene aktivitet ved å undertrykke p21 uttrykk i GC. MiR-106b kan indusere epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) og en svulst initiere cellefenotyp i brystkreft ved å målrette Smad7 og Six1 og aktivering av TGF-β signalering [28]. Det kan også fremme celleproliferasjon i humane leverkreft ved downregulating ekspresjon av APC [29].
MiR-17 har kjent onkogen aktivitet i mennesker, og ble funnet å være oppregulert i 77,2% av vevsprøver av GC sammenlignet med tilstøtende normal mage vev. Det fremmer cellesyklusprogresjon og hemme apoptose i GC ved å målrette p21 og p53INP1 (tumor protein p53-indusert kjerneprotein 1) [30]. Sirkulerende nivåer av MIR-17 er forhøyet i GC pasienter, og konsentrasjonen av MIR-17 er signifikant assosiert med TNM stadium og grad av GC [31]. Men vår studie fant at uttrykket av MIR-17a var høyere i tilfeller av GC uten lymfeknutemetastaser enn de med spredning til lymfeknuter, som kan ha vært en konsekvens av den lille utvalgsstørrelse i vår studie. Den høye uttrykk for MIR-17 er signifikant korrelert med dårlig overlevelse utfall [31]. Tidligere studier har også funnet at Mir-17 har onkogen aktivitet i tykk- og endetarmskreft [32], brystkreft [33] og bukspyttkjertelkreft [34].
MiR-18a ble funnet å være oppregulert i fire studier på dette systematisk, og er kjent for å ha onkogen aktivitet hos mennesker. Wu et al. [35] avslørte at ekspresjonen av MIR-18a var signifikant oppregulert i GC vev sammenlignet med normal gastrisk vev, og kan direkte rettet mot PIAS3 (protein hemmer av aktivert signal transduser og aktivator av transkripsjon 3) og er positivt korrelert med nivåer av Survivin, BCL-XL og c-myc. Videre har oppregulering av MIR-18a blitt rapportert i nasofaryngeal karsinom [36], bukspyttkjertelkreft [37], leverkreft [38] og brystkreft [39].
Mir-20a er en annen miRNA med onkogene aktivitet, og ble funnet å være oppregulert i fire studier i denne litteraturen. Det er blitt vist at det sirkulerende nivået av MIR-20a er betydelig forhøyet i GC-pasienter sammenlignet med friske kontroller, og dette er signifikant assosiert med det stadium og grad av tumor [31], [40]. Vår studie fant også at Mir-20a ble signifikant forhøyet i GC vev og var signifikant assosiert med lymfeknutemetastase. Videre har oppregulering av MIR-20a tidligere blitt funnet i livmorhalskreft, prostatakreft og eggstokkreft, og dette miRNA kan fremme celleproliferasjon eller invasjon av disse kreftformene [41] -. [43]
mest konsekvent downregulated miRNA i denne systematiske gjennomgangen var MIR-378, som ble funnet å være nedregulert i fem studier. MiR-378 har vist seg å ha anti-onkogen aktivitet hos mennesker [44]. Den eksogene uttrykk for MIR-378 markert undertrykker spredning av GC-celler ved å undertrykke CDK6 og VEGF signale [44]. I vår studie, selv om vi fant at uttrykket av MIR-378 ble nedregulert i GC vev, ble ingen sammenheng finnes mellom uttrykket av MIR-378 og clinicopathological funksjoner i GC. Dette kan ha vært på grunn av den lille størrelsen på utvalget i denne studien. Det er også rapportert at MIR-378 er betydelig nedregulert i tykktarmskreft, og kan spille en viktig tumor suppressor rolle i denne kreft [45]. Imidlertid har andre studier har funnet at MIR-378 kan ha onkogen aktivitet i andre krefttyper [46] – [49]. Derfor eksakte rolle MIR-378 i kreftutvikling må belyses ytterligere.
Videre fant vi også at noen av kandidat mirnas identifisert i vår studie ble slso identifisert som serum biomarkører i ulike kreftformer. For eksempel ble serum MIR-21 signifikant forhøyet i perioperativ serum fra adenomer og kolorektal kreft (CRC), og var en uavhengig prognostisk markør for CRC [50], [51]; Plasma MIR-106b, sammen med MIR-20a og MIR-221 har potensial som nye biomarkører for tidlig deteksjon av magekreft [40]; Sirkulerende MIR-17 kan brukes som en roman invasiv biomarkør for nasopharyngeal carcinoma [52], magekreft [53] og CRC [54]; Serum MIR-18a, kan brukes som en ny biomarkør i brystkreft [55], kolorektal kreft [56], hepatocellulært karsinom [57], og kreft i bukspyttkjertelen [58]; Sirkulerende MIR-378 kan anvendes som en biomarkør i nyrecellekarsinom [59] og magekreft [60]. Disse studiene ytterligere bekreftet viktigheten av identifisert miRNAs, og kan utvide anvendelsen omfanget av disse miRNAs.
I konklusjonen, vår systemisk gjennomgang identifisert fem oppregulert mirnas (MIR-21, MIR-106B, MIR-17, MIR-18a og MIR-20a) og en downregulated miRNA (MIR-378) som er potensielle nye biomarkører for GC. Disse mirnas har vist seg å ha diagnostisk og /eller prognostisk potensial for denne kreft og berettige ytterligere undersøkelse. Videre studier som fokuserer på disse mirnas vil bidra til å finne et panel av diagnostiske og prognostiske GC biomarkører med passende nivåer av sensitivitet og spesifisitet.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
forskjellig uttrykt mirnas identifisert i hvert inkluderte studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s001 plakater (XLS)
Tabell S2.
Raw Ct verdien av de utvalgte mirnas
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s002 plakater (XLS)
tabell S3.
PRISMA Sjekkliste
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s003 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Miss Wei-Feng Qu for henne utmerket redaksjonell arbeid.
