Abstract
lyddemper cytokin signalering (SOCS) familie er en viktig negativ regulator av cytokin signalisering og deregulering av SOCS har vært involvert i mange typer kreft. Alle livmorhalskreft cellelinjer som ble testet viste lavere uttrykk for SOCS1, SOCS3, og SOCS5 enn normalt vev eller cellelinjer. Den immunhistokjemi resultat for farlige stoffene proteiner i menneske cervical vev også bekreftet at normalt vev uttrykt høyere nivå av farlige stoffene proteiner enn nabo svulst. I likhet med regulering av SOCS i andre typer kreft, bidro DNA metylering til SOCS1 downregulation i CaSki, ME-180, og HeLa celler. Med uttrykket av SOCS3 eller SOCS5 ble ikke gjenvunnet ved inhibering av DNA-metylering. Histone deacetylering kan være en annen reguleringsmekanisme involvert i SOCS1 og SOCS3 uttrykk, men SOCS5 uttrykk var verken påvirket av DNA metylering eller histon deacetylering. Ektopisk uttrykk for SOCS1 eller SOCS3 dratt radioresistance til HeLa celler, som underforstått SOCS signale regulerer respons på stråling i livmorhalskreft. I denne studien har vi vist at SOCS uttrykk trykt av, delvis, epigenetiske og endret SOCS1 og SOCS3 uttrykk kan bidra til radiosensitive fenotype i livmorhalskreft
Citation. Kim MH, Kim MS, Kim W, Kang MA, Cacalano NA, Kang SB, et al. (2015) lyddemper cytokin signalering (SOC) gener blir brakt til taushet av DNA Hypermethylation og Histone Deacetylering og regulere Response to Strålebehandling i livmorhalskreftceller. PLoS ONE 10 (4): e0123133. doi: 10,1371 /journal.pone.0123133
Academic Redaktør: Rodney John Scott, University of Newcastle, AUSTRALIA
mottatt: 15 juli 2014; Godkjent: 22 februar 2015; Publisert: 07.04.2015
Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data kan ikke være gjort tilgjengelig på grunn av etiske begrensninger. Dataene er tilgjengelige fra KIRAMS Institutional Data Access /etiske komité for forskere som oppfyller kriteriene for å få tilgang til konfidensielle data
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Nuclear R D Program for departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging, Republikken Korea (KIRAMS RTR: 504580-2012). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
medlemmer av suppressor cytokin signalering (SOCS) familie av proteiner spiller sentrale roller i den negative reguleringen av cytokin signaltransduksjon. Disse proteinene opptre på en negativ feedback loop, hemme cytokin-aktiverte Janus kinase /signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon (JAK /STAT) signalveien å modulere cellulære responser [1]. SOCS1 ser ut til å ha tumor suppressor aktivitet [2] og restaurering av SOCS1 genekspresjon forårsaker veksthemming og induksjon av apoptose i HCC celler [3]. Nylig Sobti et al viste tap av SOCS1 uttrykk gjennom promoter metylering i mer enn 60% av livmorhalskrefttilfellene og foreslo betydningen av SOCS1 downregulation i HPV-indusert livmorhalskreft [4]. SOCS3 er involvert i utvikling og progresjon av flere kreftformer, og mye tyder på at SOCS3 har ulike funksjoner avhengig av tumor opprinnelse. I human lunge [5], hepatocellulær [6], og hode- og halskreft [7], er SOCS3 brakt til taushet av hypermethylation, noe som gir en vekstfordel til kreftceller. I kontrast er SOCS3 påvises i brystkreft [8], og SOCS3 uttrykk økes under utvikling og progresjon av prostatakreft [9].
Det er generelt akseptert at livmorhalskreft er radiosensitive og behandlingsresultatene er fortsatt lovende selv etter at svulsten er diagnostisert for sent for behandling ved hjelp av radikal hysterektomi. I Korea er livmorhalskreft en stor helsemessig bekymring for kvinner, sto for 9,8% av nye kvinnelige krefttilfeller. Selv om forekomst og dødelighet har gått ned, er forekomsten av livmorhalskreft hos eldre øker [10]. Men de fleste av behandlingssvikt i avansert livmorhals cancersoriginate fra utvikling av radioresistance, et problem som vi ennå ikke har overvunnet. Interessant, sensitizes SOCS1 glioblastom-celler for stråling, mens SOCS3 øker tumorcelleoverlevelse og radioresistance [11]. Zhou et al. antydet at målretting SOCS uttrykk eller funksjon i glioblastom celler kan være en nyttig strategi for å bevisstgjøre kreftceller for ioniserende stråling. Mens den DNA-skade responsen reaksjonsveien er kritisk for styring av genotoksiske stress, resultatet av reaksjon er svært avhengig av cellulær kontekst. Åpenbart andre signalveier aktivert i cellen ved tidspunktet for DNA-skade kan modulere respons og endre utgangen fra DNA-skade-indusert signaltransduksjon [12].
I den foreliggende undersøkelse har vi analysert SOCS1, SOCS3, og SOCS5 genuttrykk i et panel av cellelinjer som representerer primær,
de novo
menneskelig cervical cancersthat er radiosensitive. Vi har vist at SOCS1, SOCS3, og SOCS5 uttrykk er undertrykt, delvis epigenetiske av DNA hypermethylation og histon deacetylering. Vi viser at endret SOCS1 og SOCS3 uttrykk kan bidra til radiosensitive fenotype i livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Cell kultur, normal cervix vev og hemmer behandling
Den menneskelige livmorhalskreft cellelinjer CaSki, HeLa, ME-180, og Siha ble hentet fra den koreanske cellelinje Bank (KCLB, Seoul, Korea). Normale menneskelige fibroblast cellelinjer CCD-18Lu, CCD-18Co, og WI-38 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). De CaSki og ME-180 cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 (PAA Laboratories, Pasching, Østerrike) og HeLa, Siha og normal fibroblast-cellelinjer ble holdt i DMEM (PAA Laboratories), supplert med 10% føtalt bovint serum ( Lonza, Walkers, MD, USA) og 100 enheter av penicillin og streptomycin (PAA Laboratories). Alle celler ble dyrket i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C. For inhibering av DNA-metyltransferase, ble cellene sådd ut ved en tetthet på 2-5 x 10
5/100-mm skåler og behandlet med 5-azacytidin (5-AzaC) ved 10 uM i 72 timer. Media og 5-AzaC ble erstattet hver 24 timer. For hemming av histondeacetylase, ble cellene behandlet med Trichostatin A (TSA) ved 100 eller 200 nM i 16 timer. Begge inhibitorer ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA). En normal cervix vev ble hentet fra en pasient som gjennomgikk hysterektomi for myom uteri. Vi har fått et skriftlig informert samtykke fra pasienten før operasjonen. The Institutional Review Board godkjent samtykke prosedyre og studieprotokollen (K-1103-003-016) ved Korea Institute of Radiological og Medical Science.
RealtimeqRT-PCR
Total RNA fra celler og vev ble isolert ved hjelp av hybrid-R Total RNA Purification Kit (GeneAll, Seoul, Korea). Totalt 1 mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc, Japan) med 25 pmol av oligo-dT primer og 50 pmol av tilfeldig heksamer. cDNA ble fortynnet 1/10 med EZ fortynningsbuffer (Takara Bio Inc.), og 2 pl ble anvendt som templat i en 20 pl PCR-reaksjon. Kvantitativ PCR ble utført ved anvendelse av Premiks Ex Taq (Takara Bio Inc) i en CFX-96 thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). De følgende primere ble anvendt for PCR: Cyklofilin A (CypA) (forstand, ACG GCG AGC CCT TGG; antisense, TTT CTG CTG TCT TTG GGA CCT), SOCS1 (forstand, TTT TCG CCC TTA GCG TGA A; antisense, CAT CCA GGT GAA AGC GGC), SOCS3 (følelse, GCT CCA AAA GCG AGT ACC AGC, anti, AGT AGA ATC CGC TCT CCT GCA G), og SOCS5 (forstand, AAA AGT TGG ATC TGT TCC TAT GCC, anti, ACT ATT ATC TGA CTT GTT TG). Fluorogene sonder (6-carboxyfluorescein) var: CypA, CGC GTC TCC TTT GAG CTG TTT GCA; SOCS1, CCT CGG GAC CCA CGA GCA TCC; SOCS3, TTG CGC ACG GCG TTC ACC AC; SOCS5, AGG ATG ATT TTG TGA ACC GTG AAG TAC GTG A. DNMT1 genekspresjon ble målt ved hjelp av SYBR premix Ex Taq II kit (Takara Bio Inc) med primere (sans, CTT CTT CAG CAC AAC CGT CA, anti, GAA GAG CCG GTA GGT GTC AG). Den relative kvantifisering av genekspresjon ble beregnet med den ddC (t) -metoden, hvor CypA mRNA ble anvendt for normalisering. PCR-programmet var som følger: etter en innledende pre-inkubering trinn ved 95 ° C i 3 minutter, var 45 sykluser, hver bestående av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 sek. Den siste forsterkning syklusen ble etterfulgt av en smelte kurve analyse for å være sikker på om spesifisiteten av QRT-PCR.
Immunohistochemistry
Alle vevsprøver ble oppnådd med full etisk godkjenning fra KIRAMS institusjonelle gjennomgang kortet (IRB-nr K-1103-003-016). Immunhistokjemisk farging for SOCS1, SOCS3, og SOCS5 ble utført av en automatisert immunhistokjemisk Stainer (Autostainer 480, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) på formalinfiksert parafin vevssnitt av plateepitelkarsinom hentet fra livmorhalsen. Snittene ble deparaffinized med xylen i 15 min og forbehandlet i en mikrobølgeovn ved bruk av 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 30 min. Seksjoner ble inkubert med primære antistoffer rettet mot SOCS1 (01:25, ab62584, Abcam, Cambridge, UK), SOCS3 (1: 100, ab16030, Abcam) og SOCS5 (1: 100, sc-100858, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA) i 60 minutter ved romtemperatur og påvist ved å bruke Ultra LP deteksjonssystem HRP Polymer DAB Plus kromogen (Thermo Fisher Scientific).
Metylering spesifikke PCR (MSP)
MSP ble gjennomført for å undersøke metylering status for promoter regioner av SOCS1, SOCS3, og SOCS5 gener . Etter bisulfitt behandling for å modifisere DNA, ble PCR utført for å skille fra metanoldenaturert unmethylated DNA som beskrevet av Herman et al [13]. Genomisk DNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp Exgene Cell SV Kit (GeneAll, Korea) og bisulfite modifikasjon av genomisk DNA ble utført ved hjelp av EZ DNA metylering Kit (Zymo Research, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Bisulfitt-behandlede DNA ble amplifisert med enten en metylering-spesifikke primere eller primere som er spesifikke for den unmethylated sekvensen. I korthet, en 20 ul reaksjonsvolum inneholdende 25 ng bisulfitt modifisert DNA, 1 x PCR-buffer, 1,5 mM MgCl
2, 0,25 mM dNTPs, 0,5 mM spesifikk primer blanding og en enhet Ex Taq Hot Start-enzym (Takara BioInc) var anvendes. PCR-produktene ble elektroforesebehandlet på en 2% agarosegel farget med RedSafe Nucleic Acid fargeløsning (Intron, Korea) og visualisert under UV-belysning. Primer lister og PCR betingelser for MSP er oppsummert i S1 tabell.
Bisulfite sekvense
Bisulfite behandlet genomisk DNA ble forsterket av prim oppført i S2 tabell. PCR-produktene ble klonet inn i Topo TA kloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) eller T-sløv PCR kloning Kit (Solgent, Daejeon, Korea). Fem tilfeldig plukket kloner ble sekvensert og justert ved hjelp Quma (Kvantifisering verktøy for Metylering Analysis).
Gene stanse ved shRNA
De lentiviral shRNA ekspresjonsplasmider rettet mot DNMT1 ble generert ved kloning oligonukleotider inn i pLKO. 1 puro vektor. Sekvensene av hårnåler målretting DNMT1 er: GCCGAATACATTCTGATGGATCTCGAGATCCATCAGAATGTATTCGGC (TRCN0000021890) og GCCCAATGAGACTGACATCAACTCGAGTTGATGTCAGTCTCATTGGGC (TRCN0000021891). Kontrollen egge shRNA uttrykkende plasmid ble oppnådd fra Addgene med følgende hårnål sekvens: CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG. For emballasje, ble pCMV-dR8.2 dvpr og pCMV-VSVG brukt, som begge ble kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA, USA). Produksjonen av viruspartikler og transduksjon av målcellene ble gjennomført etter pLKO.1 protokollen fra Addgene. Supernatanter fra 293T-celler transfektert med shRNA og emballasje vektorer ble oppsamlet 48 og 72 timer etter transfeksjon, etterfulgt av konsentrering av viruset. Konsentrert virus ble anvendt for infeksjoner i nærvær av 8 mikrogram /ml polybren. En dag etter infeksjon, puromycin (1 pg /ml) ble tilført i 4 dager for å velge transduserte celler, som ble høstet for realtime PCR-analyse.
Kloning av SOCS overekspresjon retrovirale konstrukter
Bygger for overekspresjon SOCS1, SOCS3, og SOCS5 ble gjort ved å klone SOCS1, SOCS3, og SOCS5 ORF inn i pLNCX2 retroviral vektor (Clontech). De SOCS1 og SOCS3 gener av mus opprinnelse ble vennlig levert fra Dr. Cacalano NA (UCLA, CA).
Bam
HI fragment som inneholder SOCS1 cDNA merket med Myc ved C-terminalen eller SOCS3 cDNA merket med flagg ved C-terminalen ble subklonet inn
Bgl
II stedet pLNCX2. Kloner med korrekt orientering ble screenet med
Eco
RI fordøyelse og deretter bekreftet ved sekvensering. Den SOCS5 gen av muse-opprinnelse ble kjøpt fra Openbiosystems (MMM1013-9202191) og forsterket med forstand (5′-AAACTCAGATCTACCATGGATGGATAAAGTGGGGAAAATG-3 «) og antisense (5′-AGATATGGATCCCTCGAGCTACTACTTATCGTCATCATCTTTATAATCGATCTTTGCCTTGACTGGTTCTC-3») primere. En
Bgl
II og
Sal
fragment innehold SOCS5 med flagget på C-terminalen ble subklonet inn i
Bgl
II og
Xho
jeg stedet pLNCX2 retroviral vektor.
Virus produksjon og etablere stabile celler
SOCS overekspresjon retrovirale vektorer og emballasje plasmider, pCMV-Gag-Pol og pCMV-VSVG, ble transfektert inn 293T celle. Supernatanter fra 293T-celler ble samlet opp 48 og 72 timer etter transfeksjon, etterfulgt av konsentrering av retrovirus, og som brukes til å infisere HeLa-celler i nærvær av 8 mikrogram /ml polybren. En dag etter infeksjon, ble G418 (200 ng /ml) tilføres til stabile kolonier dannet. Koloniene ble slått sammen for å kontrollere SOCS overekspresjon og anvendt for klonogene analysen.
Western blot-analyse
Celler ble lysert med SDS-prøvebuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS , 15% glycerol og 0,004% bromfenolblått) og deretter kokt i 10 min. Proteininnholdet ble målt ved BCA Protein Assay Reagent (Intron). Like mengder av cellelysat ble separert ved SDS-polyakrylamidgeler, overført til en nitrocellulosemembran, immunoblottet og detekteres ved hjelp av kjemiluminescens ECL-påvisning reagenser. Anti-myc, anti-aktin og pepperrot peroksidase-konjugert sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA) og anti-FLAG antistoff var fra Sigma Chemical Co.
klonogene analysen
klonogene overlevelses ble definert som evnen til cellene for å opprettholde klonogene kapasitet og til å danne kolonier. I korthet ble cellene høstet fra kulturer eksponensielle fase ved trypsinering, telt og utsådd for kolonidannelse. Dagen etter ble gammastråling levert med en dual-kilde
137Cs enhet i en dose på 3,2 Gy /min med en GC-3000 Elan irradiator (MDS Nordion, Ontario, Canada). Etter 14 dager ble kolonier farget med 0,4% krystallfiolett (Sigma Chemical Co.). Koloniene ble talt og grupper av 30 celler ble ansett som kolonier. Pletterings effektivitet (PE) representerer prosentandelen av celler sådd som vokser inn i kolonier under en bestemt dyrkingsbetingelser for en gitt cellelinje. Overlevelsesfraksjon, uttrykt som en funksjon av bestråling, ble beregnet som følger: Flyte fraksjon = kolonier tellet /(celler sådd x PE /100). Vi gjentok eksperimentene fem ganger for å sikre reproduserbarhet.
Statistisk analyse
Data er gitt som gjennomsnitt ± SD. Den paret Student
t
-test ble utført og
p
-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
SOCS uttrykk profil incervical kreft celler
for å avdekke mulige rolle SOCS i livmorhalskreft utvikling og spredning, uttrykk for SOCS1, SOCS3, og SOCS5 ble undersøkt i flere menneskelige livmorhalskreft cellelinjer, CaSki, HeLa, ME-180, og Siha. MRNA nivået av SOCS1 (figur 1A), SOCS3 (figur 1B), og SOCS5 (figur 1C) var signifikant lavere i alle cervikale kreftceller som ble testet enn i normalt livmorhalsen vev og etablert normal tykktarm (CCD-18Co) eller lungefibroblaster (CCD -18Lu, WI-38) cellelinjer, etter
Expression of SOCS1 (A), SOCS3 (B), og SOCS5 (C) genet ble undersøkt ved QRT-PCR i normal cervix (N Cx) vev, tre normal fibroblast cellelinjer (CCD-18Co, CCD-18Lu, WI-38) og livmorhals kreft cellelinjer (CaSki, HeLa, ME-180, Siha). Expression nivå av normale kontrollprøver markert som åpen bar og livmorhals kreft celle lukket bar. Stjerne (*), statistisk signifikant (
p
0,05)
For å bekrefte at den nedre uttrykk for SOCS1, SOCS3, og SOCS5 i livmorhalskreftceller er et generelt fenomen. observert i humane tumorer, ble immunhistokjemisk farging av socs proteiner utføres i human cervical cancer vev og i det omgivende normalt vev som en kontroll (figur 2). Alle tre socs proteinene ble farget mørkere i normal (N) vev i forhold til tumor (T) område. Alle disse resultatene førte til den konklusjon at SOCS1, SOCS3, og SOCS5 uttrykk ishigher i normalt vev enn i livmorhalskreft, og støtter muligheten for at nedregulering av SOCS kan bidra til tumorigenesis eller vedlikehold av livmorhalskreft.
Expression nivå SOCS1 (A), SOCS3 (B), og SOCS5 (C) i tumor (T) og nabo normal (N) epitelceller av et kirurgisk fjernet pasientprøve ble sammenlignet.
DNA metylering analyse av sOCS genet promoter
for å avgjøre om DNA metylering bidrar til nedregulering av farlige stoffene proteiner i livmorhalskreft, ble en metylering-spesifikk PCR (MSP) analyse utført. SOCS1 uttrykk var korrelert med differensial DNA metylering bare i CaSki, HeLa, og ME-180 celler (figur 3A). Den SOCS1 promoteren i Siha celle ikke ble metylert i dette område, selv om SOCS1 transkripsjon ble nedregulert i Siha celler til en lignende levelas andre cervix-cellelinjer. I motsetning til dette ble ingen DNA-metylering detektert i SOCS3 og SOCS5 promoter-regionen, i det minste i den CpG-anrikede region undersøkt i dette forsøk, av alle livmorhalsen cancercellelinjer (figur 3A).
(A) Metyl- -spesifikke PCR-analyse. Bisulfitt-behandlede genomisk DNA ble amplifisert med unmethylated (U) eller denaturert (M) DNA-spesifikke primere. (B-D) Bisulfite sekvensering av SOCS1 (B), SOCS3 (C), og SOCS5 (D). Unmethylated CpG nettstedet i forsterket promoter-regionen ble vist som en åpen sirkel og denaturert CpG som en lukket sirkel.
For å bekrefte MSP resultat promotorområdene av SOCS1, SOCS3, og SOCS5 gener omfatter CpG øyer ble klonet og fem uavhengige kloner ble sekvensert (fig 3B-3D). Unmethylated CpG områder er markert med en åpen sirkel og denaturert CpG nettsteder er angitt med en fylt sirkel. DNA-metylering ble påvist i SOCS1 genpromoteren i CaSki, HeLa og ME-180 celler, men ikke i Siha (figur 3B), som samsvarer med MSP resultat (figur 3A). I CaSki og HeLa, den metylert regionen SOCS1 tilsvarer nesten unmethylated regionen, mens det i ME-180 celler fleste av promoter-regionen ble metylert. Metylert CpG steder ble ikke påvist i SOCS3 og SOCS5 arrangører i livmorhalskreft cellsor normale celler (figur 3C og 3D), samtidig med MSP eksperimentet (figur 3A).
Hemming av DNA hypermethylation gjenoppretter SOCS1 uttrykk
for å avgjøre om DNA metylering av SOCS1 arrangøren bidrar til nedregulering av SOCS1 genekspresjon
in vivo
, behandling med 5-AzaC ble brukt til å hemme DNMT1 (fig 4). I CaSki (figur 4A) og HeLa (figur 4B), ble SOCS1expression tydelig øket etter 5-AzaC behandling. SOCS1 ekspresjon i ME-180 ble svakt øket ved behandling med den DNMT1 inhibitor (figur 4C), muligens på grunn av tothe høyere metylering av SOCS1 genpromoteren i ME-180 celler (figur 3A og 3B) enn i de andre cellelinjer. SOCS3 og SOCS5 uttrykk ble ikke påvirket av 5-AzaC behandling, støtte til forrige resultat (figur 3) som DNA metylering er ikke involvert i nedregulering av SOCS3 og SOCS5. Dette resultatet ble bekreftet av shRNA-mediert knock-downof DNMT1 (fig 4D-4F). RNA interferens (RNAi) er veien ved hvilken kort interfererende RNA (siRNA), eller kort hårnål RNA (shRNA) brukes til å inaktivere ekspresjon av målgener [14]. SOCS1 uttrykk ble økt med hemming av DNMT1 mens SOCS3 og SOCS5 uttrykk økt litt. Disse funnene, sammen med MSP og bisulfitt sekvense resultater, foreslå en mulighet for at reguleringsmekanismer annet enn hypermethylationare viktig for å kontrollere SOCS uttrykk.
CaSki (A, D), HeLa (B, E), og ME-180 (C, F) ble cellene behandlet med 10 pM av 5-azacytosin (5-Aza) i 72 h (AC) eller infisert med kontroll lentivirus (shSCR) eller lentivirus som uttrykker shRNA målretting DNMT1 (shDNMT1) (DF). Knock-down av DNMT1 og SOCS genuttrykk ble undersøkt med QRT-PCR. Stjerne (*), statistisk signifikant (
p
0,05)
Histone acetylering regulerer SOCS1 og SOCS3 genuttrykk
Histone deacetylering er en godt kjent. epigenetisk regulering mekanisme som vi testet for en tilknytning til nedregulering av SOCS genuttrykk. Behandling av Trichostatin A (TSA), en selektiv hemmer av klasse I og II pattedyr histondeacetylase (HDAC) familier av enzymer, økt SOCS1 genuttrykk i CaSki, HeLa, og Siha men ikke meg-180 celler (figur 5A). SOCS3 genekspresjon ble også gjenfunnet i CaSki og Siha celler etter TSA behandling (figur 5B). Imidlertid ekspresjonen av disse genene ble ikke påvirket av TSA i WI-38, en normal kontroll lunge fibroblast cellelinje. Disse resultatene tyder på at SOCS1 og SOCS3 blir nedregulert ved HDAC i flere cervix kreftceller. Dette er den første rapport som SOCS ekspresjon påvirkes av ikke bare hypermethylation men også histon deacetylering i solide tumorceller. I motsetning til dette ble SOCS5 genekspresjon ikke endret i det hele tatt av HDAC inhibering i WI-38 eller i en hvilken som helst av de cervikale kreftceller som ble testet (figur 5C). Videre studier er nødvendig for å karakterisere de mekanismene undertrykkende SOCS genekspresjon i livmorhalskreft.
Normal lunge fibroblast-celler (WI-38) og livmorhals kreftceller ble behandlet med 0, 100 eller 200 nM av TSA i 16 timer og SOCS1 (A), SOCS3 (B), og SOCS5 (C) genekspresjon ble målt med QRT-PCR. Stjerne (*), statistisk signifikant (
p
0,05).
Overuttrykte SOCS1 eller SOCS3 gi gave radioresistance til HeLa-celler
For å undersøke de biologiske effektene av økt SOCS genuttrykk i livmorhalskreftceller, ble flere HeLa-celler etablert av infeksjon med retrovirus overekspresjon den SOCS genet. Uttrykk for den eksogene SOCS genet i neomycin resistente HeLa-celler ble bekreftet av western blotting (fig 6A). Det var ingen signifikant forskjell observert i celleproliferasjon eller levedyktighet mellom håne eller SOCS-overekspresjon HeLa-celler (data ikke vist). Som SOCS1 og SOCS3 har vært involvert i respons til stråling i glioblastom [11], ble klonogene analyser utført for å vurdere mulige bidrag SOCS genuttrykk til radioresponsivity. Som vist i figur 6, overekspresjon av SOCS1 eller SOCS3 gjøre HeLa-celler mer motstandsdyktig mot stråling enn kontrollcellene (figur 6B). Imidlertid Radiosensitivity av HeLa-celler som overuttrykker SOCS5 ble ikke endret.
SOCS1, SOCS3, eller SOCS5 overuttrykke HeLa-celler ble etablert ved bruk av pLNCX2 retrovirusvektor, og overekspresjon ble bekreftet ved western blot analyse (A). En klonogene Analysen ble utført etter eksponering til den indikerte dose av stråling i socs-overuttrykkende celler (B). Verdiene er middelverdier ± standardavvik for triplikate brønner for hver dose punkt. Stjerne (*), statistisk signifikant (
p
0,05)
Diskusjoner
SOCS er en stor super av proteiner som er generelt sett på som antagonister av cytokin indusert Janus-aktivert kinase-STAT signalering. Imidlertid er SOCS involvert i reguleringen av flere signalveier, inklusive fosfatidylinositol 3-kinase og ERK MAPK [15]. Studier om SOCS og livmorhalskreft er få i antall. SOCS1may spille en rolle i å regulere nivåene av E7 proteinet av human papilloma virus, og som påvirker deres trans potensial [16]. De observerte IFN-γ behandling til HeLa og CaSki-cellelinjer førte til reduksjon av E7-protein. Kamio et al. viste overekspresjon av SOCS1 redusert spredning hastighet i begge HeLa og CaSki cellelinjer. De bekreftet også SOCS1 trykkes DNA-syntese ved å observere redusert inkorporering av BrdU [16]. Men i aspekt av immunresponsen, SOCS1 stanse forbedret uttrykket nivåer av proinflammatoriske cytokiner, slik som interleukiner, TNF-a, IFN-γ som resulterer i forbedret antigen presentasjon av dendrittiske celler [17]. Derfor foreslår vi at nettoeffekten av SOCS1 undertrykkelse går ugunstig for vertene. Våre resultater tyder også på muligheten for at farlige stoffene proteiner fungerer som tumor suppressors. SOCS1, SOCS3, og SOCS5 uttrykk var lavere i livmorhals kreft enn omkringliggende normalt vev (fig 2), og mRNA nivåer av farlige stoffene gener var lavere i livmorhalskreft cellelinjer enn i normale livmorhalsen vev eller fibroblast cellelinjer (figur 1). Det har tidligere blitt rapportert at markant undertrykkelse av transkripsjon av gener socs resulterte fra DNA hypermethylation i promoterregionen [6,7,9]. En lang liste med hypermethylated gener er et felles kjennetegn på alle typer kreft hos mennesker. Selv om mange tumorsuppressorgener er brakt til taushet av DNA metylering under kreftutvikling, nedregulering av SOCS3 og SOCS5 var ikke avhengig av DNA hypermethylation (figur 3 og 4). En annen epigenetisk genet stanse mekanisme, histon hypoacetylation formidler SOCS1 downregulation i CaSki, HeLa, og Siha celler og SOCS3downregulation i CaSKi og Siha celler (fig 5). SOCS5 genekspresjon ble ikke endret i det hele tatt ved hemming av DNA-metylering eller histon acetylering. Som Gene stanse innebærer ofte en kombinasjon av DNA metylering og kromatin histon acetylering, undersøkte vi også kombinasjonen effekten av 5-Aza og TSA på SOCS1 uttrykk i ME-180 celle. Det ble imidlertid ikke observert noen signifikant økning i SOCS1 uttrykket (data ikke vist). Epigenetisk regulering av farlige stoffene gener i livmorhalskreftceller ble oppsummert i S3 tabell. Det er verdt å huske at vi analyserte epigenetisk SOCS genregule bare i fire etablerte livmorhals kreft cellelinjer og ytterligere bekreftelse er nødvendig om dette Reguleringen gjelder primær cervix cancer.
Våre data viste at endret uttrykk for SOCS1or SOCS3 påvirket strålingsresponsen til livmorhalskreftceller. Overekspresjon av SOCS1 og SOCS3 forbedret celle overlevelse etter ioniserende stråling (figur 6). SOCS1 er en viktig aktivator av p53 og DNA-skade reaksjon [18]. Fordi SOCS1 krever SOCS boksen for å danne et kompleks med ATM, v-Abl- eller Pim kinase-mediert fosforylering kan potensielt forstyrre denne interaksjonen og blokken p53-aktivering. Derfor synes det som om avvikende fosforylering av onkogene kinaser kan forstyrre tumorsuppressorgener aktivitetene til SOCS1 ved minst to forskjellige mekanismer: (1) fosforylert SOCS1 ville ikke være i stand til å hemme JAK /STAT vei og til å samhandle med ATM og fremme p53 aktiverings~~POS=TRUNC [18]. (2) SOCS3improves celle survivalin glioblastom [11], men handlet som en chemosensitizer i anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft [19]. Keratinocytt-spesifikk overekspresjon av SOCS3 førte til magre sår margin epitel og forsterkes den inflammatoriske respons av viklede keratinocytter ved en økning i kjemokin (MIP-2) og inflammatorisk enzym (COX-2 og iNOS) ekspresjon [20]. COX-2 bidrar til metastasering av livmorhalskreft ved å fremme autokrint eller parakrint VEGF uttrykk på både primære og metastaser [21]. Derfor er det rimelig å foreslå at SOCS3 vanligvis fungerer som en celle overlevelse faktor, bortsett fra i anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft. Men SOCS1 handlet som en radiosensitizer i glioblastom celler [11]. Det avbrutt transformasjonen av normale livmorhals epitel i neoplastiske celler gjennom en E7 protein, som en tumor suppressor. På den annen side, SOCS1 hemmet apoptose av øyimplantater grunn av kaspase 3 og apoptose-induserende faktor baner i bukspyttkjertelen hos rotter [22], noe som indikerer at, i samsvar med våre data, det fremmer celleoverlevelse.
Wild -type livmorhalskreft cellelinjer viste undertrykte uttrykk for SOCS1, SOCS3, og SOCS5. Både DNA-metylering og histon-deacetylering kan bidra til nedregulering av SOCS 1, 3, 5 gener i cervikale kreftceller. Gjenoppretting av SOCS1 og SOCS3 genuttrykk redusert Radiosensitivity av HeLa-celler. Det synes lite sannsynlig at funksjonen av SOCS1 og SOCS3 i solide tumorer opptrer jevnt i én retning
in vivo
.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Primer listen og PCR betingelse for MSP
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123133.s001 plakater (docx)
S2 Table. Primer liste brukes til bisulfite sekvense
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123133.s002 plakater (docx)
S3 Table. Oppsummering av epigenetisk regulering av farlige stoffene gener i livmorhalskreftceller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123133.s003 plakater (docx)
