Abstract
Bakgrunn
Til tross for lav forekomst, er eggstokkreft den femte ledende årsak til kreft dødsfall og det har den høyeste dødeligheten av alle gynekologiske kreftformer blant amerikanske kvinner. Dødeligheten vil bli redusert med en tidlig deteksjon markør. Den folat reseptoren alfa (FRα) er en logisk valg for en biomarkør på grunn av sin utbredt overekspresjon i eggstokkreft og sitt eksklusive uttrykk i bare noen få normale vev. I tidligere arbeid, ble det observert at pasienter med ovarialcancer hadde forhøyede serumnivåer av et protein som er bundet til en FRα-spesifikt monoklonalt antistoff sammenlignet med friske individer. Det ble imidlertid ikke vist at proteinet detektert var intakte funksjons FRα. I denne studien var målet å finne ut om eggstokkreft pasienter (n = 30) hadde forhøyet serumnivå av en fullt funksjonell intakt FRα sammenlignet med tilsvarende friske kontroller (n = 30).
metodikk /hovedfunnene
FRα nivåer i serum ble analysert av to metoder, immunblotanalyse og en radiomerket folsyre-baserte mikrobindingsanalysen. Ved hjelp av den immunologiske måling, observerte vi at nivåene av FRα var høyere i serum av eggstokkreft pasienter sammenlignet med kontroller. Lignende resultater ble også observert ved anvendelse av mikrofiltreringsbindingsanalysen, noe som viste at den sirkulerende FRα er funksjonell. Viktigere, fant vi også at nivåene av FRα var sammenlignbare mellom tidlig og avansert stadium pasientene.
Konklusjoner
Våre resultater viser at kreftpasienter på eggstokkene har forhøyede nivåer av funksjonelle intakte FRα. Disse funnene støtter den potensielle bruken av sirkulerende FRα som en biomarkør for tidlig eggstokkreft
Citation. Basal E, Eghbali-Fatourechi GZ, Kalli KR, Hartmann LC, Goodman KM, Goode EL, et al. (2009) Funksjonell Folat Receptor Alpha er forhøyet i blodet av eggstokkreft pasienter. PLoS ONE 4 (7): e6292. doi: 10,1371 /journal.pone.0006292
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 23 april 2009; Godkjent: 11 juni 2009; Publisert: 20.07.2009
Copyright: © 2009 Basal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette tilskuddet ble støttet av National Cancer Institute tilskudd, K01-CA100764 og R03-CA121386. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den femte største årsaken til kreftdød og har den høyeste dødeligheten av alle gynekologiske kreftformer blant amerikanske kvinner med anslagsvis 21,650 nye tilfeller og en forventet 15.500 dødsfall i 2008 [1]. Flertallet av pasienter med eggstokkreft stede med avansert sykdom (trinn III-IV) og har en 5-års overlevelse på typisk 30%. Det faktum at overlevelse av pasienter med trinn I-II-sykdom i området fra 60% -90%, avhengig av tumor grad [1], [2] antyder muligheten for en høy herdehastighet med tidligere påvisning sykdom. Siden fysiske symptomer er fraværende i tidlige stadier av eggstokkreft, arbeides det med å utvikle analyser for blod eller vev biomarkører.
Selv om serum CA-125, en ovarian celleoverflateglykoprotein (dvs. en mucin) med ukjent biologisk betydning, er forhøyet i 80% av pasienter med avansert ovarialcancer, har denne markøren en positiv prediktiv verdi av 10% i tidlig stadium sykdom [3]. Videre er CA-125 også forbundet med en rekke ikke-maligne tilstander, slik som graviditet, endometriose, adenomyose, uterine fibroider, bekkensykdom, menstruasjon, og benigne cyster. CA-125 er også forbundet med andre ondartede tilstander så som bukspyttkjertel, bryst, lunge, mage, og kolon-kreft [4]. Selv om CA-125 er nyttig i oppfølgingen av pasientens kjemoterapi og i å oppdage tidlig tilbakefall hos pasienter med allerede kjente eggstokkreft, er det ikke nyttig for å identifisere tidlig stadium sykdommen [5].
folat reseptor α (FRα), en 38-40 kDa molekylet, er et godt karakterisert medlem av folat reseptoren (FR) familie med høy affinitet for folater. FRα er forankret til cellemembraner gjennom en glykosylfosfatidylinositol del og transporterer folater via en endocytiske prosessen [6]. FRα oppviser begrenset normalt vev fordeling, med målbar ekspresjon begrenset til de apikale overflater av noen få epitel, hovedsakelig i lunge, nyre og choroid plexus, men er overuttrykt i et spekter av faste tumorer, inkludert kreft i eggstokkene, ikke-småcellet lungekreft , brystkreft, nyrekreft og i høy grad osteosarkom [7] – [10]. Dette over-ekspresjon av høy affinitet FRα ved noen kreftformer kan ha oppstått for å oppfylle krav til cellulære DNA-syntese og vekst [11].
I tillegg til sin celleoverflate lokalisering, FRα kan også utskilles i blodet. Shedding ble først identifisert under utviklingen av folat radioligand bindingsanalyser som anvendes renset cellefritt FR som et bindende protein. I disse studiene ble det bemerket at det var ofte en stor uoverensstemmelse i vurderingen av totalt serum folat når analysert etter varmeutvinning sammenlignet med naturlig serum [12]. Når skur, vil FRα binde sirkulerende folat, ettersom affinitet er i nM rekkevidde. Nå er det velkjent at utstøtingen kompliserer tolkningen av serum folat assays og muligens masker tilstedeværelse av funksjonell reseptor, med mindre en syrebehandling anvendes for å frigjøre endogent folat og tillate FRα metning med det radiomerkede folsyre. Dette avviket i folsyre nivåer mellom innfødte og varme hentet serum førte til identifisering av sirkulerende FRα i noen prøver av navlestrengsblod og i noen av morens serum [13]. Viktigere, utgitt FRα fra normale epitelceller bør ikke bidra til FRα nivåer i serum, ettersom reseptoren er alltid lokalisert til den apikale overflate av en polarisert epitel hvor dens avgivelse vil levere den frie reseptor inn i et hulrom som naturlig drenerer fra kroppen via sin egen åpning.
Nyere studier tyder på at FRα kan også kaste i blodet fra svulster, som gir en mulighet til å få tilgang til og måle det som en svulst markør for tidlig stadium kreft. Den utbredte uttrykk for FRα i eggstokkreft, blant alle stadier, har stimulert interessen for å bruke det som et terapeutisk mål og biomarkør [14]. Målet med denne studien var å finne ut om intakt funksjonelle FRα er utgytt i sirkulasjon og for å evaluere sitt potensial som en sirkulerende biomarkør. Dette målet er støttet av tidligere arbeid som viste at kreftpasienter på eggstokkene har forhøyede nivåer av et serum protein som reagerer med anti-FRα antistoffer [15]. Hva gjensto å bli besvart var om antistoffene oppdaget hele FRα og om oppdaget proteinet var en funksjonell folat reseptor (FR). Således, i den foreliggende undersøkelse, nivåene av sirkulerende FRα i blodet hos pasienter med kreft i eggstokkene ble undersøkt ved anvendelse av en
3H-FA-baserte mikro assay som ble utviklet for å detektere funksjonelle FRα. I tillegg ble en immunoblot-analyse anvendt for å bekrefte tilstedeværelsen av den spesifikke hele FRα protein. Som det vil bli vist, kreftpasienter på eggstokkene demonstrere forhøyede nivåer av FRα i omløp som støtter dens potensielle bruk som en sykdom biomarkør.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
The Mayo Clinic IRB godkjent studien og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag.
fag
Hver eggstokkreft saken ble først matchet til en kvinnelig kontroll på blodprøvetaking innen 6 måneder (alle 30 tilfeller matchet med hell), og deretter alder i løpet av 5 år. Tjueni saker ble vellykket matchet. Den 30. Saken ble matchet på blodprøvetaking innen 6 måneder og alder innen 9 år til en kvalifisert kontroll. Kvalifiserte tilfellene var pasienter, over 20 år, med histologisk bekreftet primære epitelial eggstokkreft. En 40-mL (preoperativ) blodprøve ble oppsamlet, behandlet, delt i porsjoner og lagret ved -80 ° C i serum. Gjennomsnittlig alder (± SEM) av de alderstilpassede friske kvinnelige donorer og pasienter var henholdsvis 61 ± 3 og 60.63 ± 3 år. Andre pasient og tumoregenskaper er vist i Tabell 1.
Tilbehør og reagenser
Folsyre ble hentet fra Alexis Biochemicals. Sentrifuger filtre (10 000 dalton cutoff) ble kjøpt fra Millipore (Burlington, MA). Tritium folsyre [3,5,7,9-
3H] natriumsaltet, (
3H-FA, en mCi /ml) ble kjøpt fra amerikanske Radiomerket Chemicals (St. Louis, Missouri), og Ferdig sikker flytende scintillasjonscocktail var fra Beckman Coulter. Anti-FRα antistoffer, MOv18 /Zel og F5753 var fra Alexis Biochemicals (San Diego, California) og US Biologisk (Swampscott, MA), henholdsvis.
Utarbeidelse av tumorcellelysatene og cellekultursupernatanter som kilder til FRα
KB-celler er humane nasofaryngeale epidermoide karsinom-celler som uttrykker høye nivåer av FRα [16] – [18]. KB-celler ble dyrket i media bestående av folat-fri RPMI 1640, supplert med 55 uM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES-buffer, 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum. Supernatanter ble fremstilt ved sentrifugering av kondisjonert medium ved 4 ° C for å fjerne unanchored celler. Aliquoter av 4-dagers Supernatantene ble lagret ved -80 ° C for å bli brukt som en kilde for ikke-celleassosiert FRα. Cellelysater ble fremstilt fra sammenflytende KB monolag ved gjentatte fryse-tine-sykluser, etterfulgt av sentrifugering for å fjerne rusk. For begge supernatanter og cellelysater, ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved optisk tetthet. MCF-7 humane brystcancerceller ble benyttet som en FRα-negativ kontroll og fremstilt på lignende måte KB-celler. Lysates (5-10 mikrogram av lysatene) og supernatanter (10-20 mL) ble benyttet for analyse utvikling og som kontroller.
3H-folsyre bindingsanalysen
Måling av folat reseptorer i tilfeller og kontroller var en variant av en tidligere beskrevet metode [19]. Prøver (10 ul) ble fylt i det øvre kammer av et par rør filtrering og fortynnet til 50 pl total med en oppløsende oppløsning (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 25 mM
n
-oktyl -β-D-glukopyranosid, 5 mM EDTA og 0,02% natriumazid). Filtrerings Rørene ble sentrifugert og filtrene ble behandlet med 30 mM acetat (pH 3,0) for å fjerne endogen FA fulgt av sentrifugering og to vaskinger med det oppløsende løsning. Da parene av filtrerings Rørene ble inkubert enten med en 1000X kald FA i en bindende løsning (10 mM Na
2P
4, 1,8 mM KH
2PO
4, 500 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4, og 25 mM
n-
oktyl-β-D-glukopyranosid) eller med bindingsløsning alene, og prøvene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og deretter sentrifugert. Binding oppløsning inneholdende
3H-FA ble deretter tilsatt til alle prøver, fulgt av inkubering over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Filtrene ble sentrifugert og vasket med PBS inneholdende 50 mM
n
-oktyl-β-D-glukopyranosid for å fjerne ubundet
3H-FA. Bundet
3H-FA tilbakeholdt på filtrene ble fjernet med 100 ul PBS inneholdende 4% Triton X-100 og overført til et hetteglass med væske-scintillasjons-cocktail, og aktiviteten ble målt i en Beckman LS6000IC Scintillation Counter. Spesifikk binding ble bestemt ved å trekke fra aktiviteten i nærvær av overskudd av kald FA fra aktiviteten av den samme prøven uten FA konkurranse.
Immunoutfelling og immunoblotanalyse av FRα
FRα i serumet ble direkte målt ved hjelp av immunoblot-analyse av immunoutfellinger. Serumprøver (100 ul), Lysatene (25 ug KB eller MCF-7) eller KB-supernatanter ble pre-erte to ganger med Protein G-Sepharose og 5 ug av hver av monoklonale antistoffer, MOv18 /Zel og F5753, ble tilsatt til hver prøve og inkubert i 1 time ved 4 ° C. Protein G pluss Sepharose-kuler ble deretter tilsatt, og blandingen ble tillatt å rotere over natten ved 4 ° C. Kulene ble deretter samlet med sentrifugering og vasket med 600 ul lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na
2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, og proteaseinhibitorer). Kulene ble dekantert og kokt i Laemmli-buffer. Proteinene ble oppløst ved SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser, etterfulgt av blotting. Blottene ble probet med MOv18 /Zel antistoff (5 pg /ml i 2% fettfri tørrmelk, 0,1% Tween 20 i TBS), etterfulgt av sekundær anti-mus-IgG-pepperrot-peroksidase (HRP) konjugert antistoff (1:5000 i 2% ikke- fett tørrmelk i 0,1% Tween 20), og er utviklet av forbedret chemiluminescence med Super Signal West Pico kjemiluminescenssubstrat i 5 minutter (Pierce, Rockford, IL, USA). Blottene ble deretter utsatt for røntgenfilm og bandet stillinger og bandet tettheter ble beregnet ved hjelp av en datastyrt bildeanalyse system (UVP Biochem Imaging Systems, Upland, CA).
Statistical Analysis
gjennomsnittlig nivå av sirkulerende FRα, oppdaget med enten ligand-bindingsanalysen eller immunblotting analyse, mellom saker og kontrollpersoner ble sammenlignet med Wilcoxon matchet parvis test. I noen tilfeller lineær regresjonsanalyse ble benyttet for å undersøke for statistisk signifikante korrelasjoner. Proporsjoner ble testet ved hjelp av Fishers eksakte test. I alle tilfeller, ble en to-tailed test brukt og ap verdi på mindre enn eller lik 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Påvisning av FRα bruker mikrobindingsanalyser og immunoblotting
i innledende arbeidet med å måle nivåer av sirkulerende FRα av
3H-FA bindende studier ble forstudier gjort for å bestemme egenskaper av mikrofiltrering analysen. KB cellesupernatanten prøver ble inkubert med økende mengder av
3H-FA i fravær og nærvær av overskudd av kald FA og deretter målt gjenvinning av bundet
3H-FA. Som vist i figur 1A, mellom 10 og 120 nmol /L
3H-FA, den totale bindingen økes på en lineær måte. Når overskudd av kald FA var tilsatt, ble mengden bundet redusert til bakgrunnsnivåer. De beregnede FA konsentrasjoner enn dette området (10-120 nmol /L) var konsistente og ingen av verdiene var signifikant forskjellig (ikke vist). Resultatene viser at analysen er i stand til å måle FRα over et bredt område av konsentrasjoner FA
Panel A:. Ti pl aliquoter av KB kultursupernatant ble fortynnet til 50 mL med bindingsbuffer som inneholdt økende konsentrasjoner av
3H-FA pulset, uten (Total bundet) eller med 1000X kald FA. Etter inkubasjonen ble ubundet FA fjernes ved mikrofiltrering. Vist er CPM beholdes av mikrofilter. Også vist er bakgrunnen som er bindende i fravær av KB supernatanter og uten overflødig kaldt FA. * P 0,05. Hvert datapunkt er gjennomsnittet (± SE) av 3 replikater. Det innfelte stiplet linje er den lineære regresjonslinjen av det totale bundet presentert med de tilsvarende p og r-verdier. Panel B viser at mengden av spesifikk binding er avhengig av inngangsnivåer. I dette tilfelle økende mengder av serum inneholdende en KB-protein pigg ble undersøkt. Dette forsøk er representativt for 2 forskjellige eksperimenter. Panel C viser FA konsentrasjon som var bundet i enten KB supernatantene eller en representant serumprøve fra en sak og kontroll, sammenligne 30 KD og 10 cutoff microfilters. Eksperiment er representative for to eksperimenter. Panel D viser et representativt eksempel på immunoblotanalyse av FRα. Pil = M
r 38000 protein; KD = kDa; IP = immunoprecipitation. Lane 1, IP w ingen serum; lane 2, IP av KB lysat; spor 3, IP av forhåndsklaret serum med KB lysat pigg; kjørefelt 4. IP av serum alene, spor 5, KB lysat ingen IP; felt 6, IP av KB-lysat uten serum.
For å bestemme den minste mengde serum som kreves, er en normal kontrollserumprøve (100 ul) tilsatt KB cellelysat (5 ug) og forskjellige volumer (0-40 ul) ble testet for binding
3H-FA. Som vist i et representativt eksempel eksperiment på figur 1B, kan mikroanalyse påvise FA-binding i et volum så lite som 10 mikroliter. Imidlertid ovenfor 20 ul serum, ble det funnet at mikrofiltre ikke alltid lett renne. Således ble et standard volum på 10-20 pl brukes for tilfeller og kontroller.
Selv om det tidligere arbeid hadde brukt 30 KD cut-off filter for å måle FRα i vevsprøver [19], var det en bekymring for at noe tap kan har oppstått som følge av en variasjon i porestørrelse, noe som resulterer i tilstedeværelsen av noen filterporene som ville tillate passering av 38 KDa FRα. Derfor tester ble gjort sammenligne 30 KD og 10 KD cutoff filtre. Generelt var det bare små forskjeller. For eksempel, som vist i figur 1C, var det ingen betydelig forskjell i den bundede FA ved bruk av KB-cellelysatene av KB supernatanter. I motsetning til dette, ble små økninger gjennomgående observert i serumprøver ved bruk av de 10 KD cutoff filtre. Dermed ble 10 KD cutoff brukes til å måle FRα i sera av saker og kontroller.
I et forsøk på å underbygge de mikro resultater, en immunoprecipitation og immunoblotting metoden ble etablert. Som vist i figur 1D, kan FRα bli immunopresipitert fra sera (100 ul) og immunoblottet som resulterer i påvisning av det 38 KD FRα. Samlet viser disse resultater at mikrofiltreringen analysen kan brukes til å oppdage FRα i små seraprøver. Videre immunoblotting analyse avslører tilstedeværelsen av intakt helaftens FRα.
Pasienter med ubehandlet eggstokkreft har forhøyede gjennomsnittlig nivå av sirkulerende FRα sammenlignet med matchede kontroller
Pasient (dvs. tilfeller) egenskaper er detaljert i tabell 1. mikrofilteret bindingsanalyser og immunblotting viste at sera avledet fra de tilfeller som inneholdt signifikant høyere nivåer av midlere FRα i forhold til kontrollene (figur 2A-C). Lineær regresjonsanalyse av alle målingene fra begge tilfeller og kontrollene viste at det var en signifikant korrelasjon mellom resultatene av de mikrofiltrerings og Immunoblotanalyse analyser (figur 2D). For å vurdere hvilke analysen potensielt kan være mer mottagelig for utvikling som en biomarkør test ble cutoffs etablert fra kontrollgruppen verdien for begge analyser ved anvendelse av middelverdien og to standardavvik. Med denne strategien falt mer enn 95% av kontrollverdiene under avskjæringen. Som vist i figur 3, ved hjelp av denne strategien ble 13% og 27% av tilfellene anses å ha forhøyede nivåer av FRα i mikrofiltrerings og immunoblottingforsøk analyser, respektivt. Statistisk analyse ved hjelp av Fishers eksakte test viste at fraksjonen av tilfellene med forhøyede nivåer av FRα, som påvist med den immunblotting-analyse, var betydelig annerledes enn den brøkdel av kontroller betraktes som positiv. I motsetning til dette, den fraksjon av tilfellene detektert med mikrofiltrering analysen var ikke signifikant, og foreslo at immunblotting-analysen kan potensielt ha en bedre positiv prediktiv verdi.
Panel A viser antallet sirkulerende folat-reseptor (FR) ekstrapolert fra mikrofiltreringen analysen antar et 01:01 molarforhold av FA:FR i begge tilfeller og matchede kontroller Panel B viser densitometriske signal som oppnås ved hjelp av immunblotting. P-verdier i paneler A og B er beregnet ved hjelp av Wilcoxons matchet parvis test og hver stolpe representerer gjennomsnittsverdier ± S.E.M.. Panel C: Lane 1, immunoprecipitation negativ kontroll; kolonne 2, negativ kontroll (MCF-7) lysat; spor 3, positiv kontroll (KB) lysat); felt 4, kontrollserumprøven; lane 5, matchet eggstokkreft serumprøve; kjørefelt 6, kontroll serumprøve; kjørefelt 7 matchet eggstokkreft serumprøve. Pil = M
r 38000 protein; KD = kDa. Panel D viser den lineære regresjonsanalysen korrelere mikrobindingsanalysedata og immunoblotting data. Hvert datapunkt representerer et unikt individ. Åpne symboler representerer de friske kontroller og lukkede symboler er pasienter.
panel A og B viser prosentandelen av tilfellene og kontroller som ble betraktet som positive ved mikrofiltrering eller immunblotting-analyse, henholdsvis, med konsentrasjon etablert som den midlere pluss to standardavvik av kontrollverdiene. P-verdien ble beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test.
Nivåer av sirkulerende FRα er sammenlignbare mellom tidlig og avansert sykdom
Vi har testet om det var noen sammenheng mellom nivåene av sirkulerende FRα og en rekke kliniske egenskaper, samt FRα uttrykk i tumoren. Vi fant ut at sirkulerende FRα nivåer (som vurderes immunoblotting) var sammenlignbare mellom tidlig (stadium I /II, n = 15, 16 ± 2 au) og avansert stadium (Stages III /IV, n = 15, 12 ± 2 au, p = 0.24) pasienter som er vist på figurene 4A. Forskjellene i sirkulerende FRα mellom tidlig og avansert stadium pasienter som vurderes av bindingsanalyser var heller ikke signifikant (1,4 ± 0,3 vs. 1,0 ± 0,2 p. 0,2, Figur 4B). Viktigere, nivåer av FRα i tidlig stadium pasienter var betydelig høyere enn alle kontroller (n = 30, 7 ± 0,9 au, immunoblotting, p 0,0001 og 0,6 ± 0,1 nmols /l bindende, p = 0,02).
panelene A og B viser sammenligningen mellom tidlig og sent stadium densitometriske og mikroanalysesignaler, respektivt. Hvert datapunkt representerer et unikt individ og den horisontale linjen representerer gjennomsnittet. p-verdiene vist ble beregnet ved hjelp av en Student t-test.
Det ble ikke observert noen signifikante sammenhenger mellom sirkulerende FRα og enten alder, klasse, tilbakefall status eller omfang av debulking (optimal vs sub-optimal) (p & gt 0,05). Svulster fra 27 av 30 pasienter som hadde høyt FRα ekspresjon, i samsvar med tidligere arbeid, og derfor vår prøvestørrelsen var ikke stor nok til å bestemme om tumor FRα ekspresjon var forbundet med nivåer av FRα i blodet. Men av de tre svulster (en serøs borderline og to mucinous borderline) med lav tumorassosiert FRα, bare en mucinous border viste lave sirkulerende FRα nivåer. Dette tyder på at sirkulerende FRα kanskje ikke korrelerer godt med kreft nivåer. Faktisk, i våre tidligere studier, observerte vi noen avvik i FRα flekker forskjellig tumor foci (tilbakevendende og metastaselesjoner) [14].
Diskusjoner
Eggstokkreft ofte unnvike gjenkjenning på grunn av mangel på definitive tidlige symptomer. Følgelig presenterer kreft i eggstokkene ved fremskredent stadium i ~70% av pasientene. De biomarkører i bruk i dag er ikke tilstrekkelig for påvisning av forstadier til kreft. Derfor er det ikke overraskende at eggstokkreft er nummer én dødsårsaken blant alle de gynekologiske kreftformer i de siste årene. For tiden tilgjengelige markører CA-125 og proteomikk profiler mangler sensitivitet, spesifisitet og /eller reproduserbarhet. Det er klart behov for diagnostiske markører for å oppdage kreft i eggstokkene ved tidlige stadier. Et molekyl uttrykt nesten utelukkende i patogene vev ville gjøre en ideell biomarkør og en slik lovende kandidat er folat reseptor (FR-α). FR-α er sterkt overuttrykt i de aller fleste av eggstokkreft, men viser begrenset uttrykk i vev som er ansvarlig for hele kroppen oppbevaring av folater (f.eks morkaken, choroid plexus og nyre). I denne studien har vi testet om det var mulig å påvise sirkulerende FRα i eggstokkene kreftpasienter og om sirkulerende FRα var full-lengde og funksjonell.
Våre data viser at pasienter med eggstokkreft har forhøyede nivåer av FRα sammenlignet med friske kontroller. Disse resultatene antyder at sirkulerende FRα potensielt kan bli utviklet som en biomarkør. Den økte nivåer av FRα i tidlig fase sykdom indikerer at oppregulering av FRα kan forekomme tidlig eggstokk karsinogenese i noen pasienter. Faktisk Toffoli og kolleger at nesten 79% av pasienter med tidlig stadium (I og II) eggstokkreft overuttrykt FRα, som var i det vesentlige identisk med den andelen av avansert stadium pasienter som hadde FRα uttrykk [9]. Vi observert i våre studier at nivåene av sirkulerende FRα i tidlig stadium pasientene var ikke annerledes enn avansert stadium pasienter. Men Toffoli og kolleger fant at mens andelen var lik, nivåene av FRα på svulsten var betydelig høyere i avansert stadium pasientene. Mangel på korrelasjon kan tyde på at det finnes andre faktorer som regulerer serumnivåer. For eksempel, Mantovani og kolleger at normale humane urinprøver var sterkt positive for FRα immun-reaktivitet, noe som tyder på at det er en mekanisme for sin raske nyre clearance [15]. Siden de proksimale tubuli i nyrene sterkt uttrykke proteinet, kan man konkludere med at nyren har et velutviklet strategi for å eliminere FRα for å hindre at det samler seg i blodet og hindrer FA-opptak i vev [19]. Dette støttes i kinetiske murine modellerings studier som har vist at etter hvert som tumoren skrider frem, stiger i urinnivåer FRα forut for serumsnivåer vesentlig [15].
Intakt FRα er et 38 kDa-protein, og i vår immunoblot assay anti-MOv18 /Zel-antistoff påvist et protein med samme molekylvekt. Videre viste vi at mikroanalyse oppdaget funksjonelt protein, som til sammen tyder på at FRα skur av eggstokkreft er intakt og funksjonell. Tilstedeværelsen av FRα i sirkulasjon av pasienter har terapeutisk betydning som en rekke behandlinger har blitt utviklet som målcelleoverflaten FRα hos kreftpasienter [20]. Disse sirkulerende FR kan binde og forstyrre klinisk effekt. Dette kan forklare høye feilrater observert i noen FRα-rettet immunterapi hos pasienter med eggstokkreft. For eksempel, Kershaw og kolleger utviklet en metode hvori autologe T-celler fra pasienter ble gen-modifisert med en kimær reseptor som inneholdt en FRα-spesifikt enkelt kjede antistoff koblet til Fc-reseptor y-kjede [21]. Mens cellene utskilte IFN-γ svar på FRα, de ikke klarte å lokalisere til tumorstedet, en svikt som kan forklares ved sirkulering FRα som mettede de kimære reseptorer. Derfor kan analysen av sirkulerende FRα hos kreftpasienter hjelpe med å bestemme nivåer av anti-FRα målrettet kimære reseptorer som trengs for vellykket behandling. I tillegg fant vi også at forhøyet sirkulerende FRα var funksjonelle, noe som tyder på eventuelle forstyrrelser med en rekke folsyre-konjugert medisinsk behandling som har blitt utviklet som krever et funksjonelt bindingssete [20], En av vanskelighetene, men i å måle serum nivåer av FRα er mangelen på en kvalitet assay. Mens våre bindingsanalyser var i stand til å detektere en forskjell mellom tilfeller og kontrollene, de oppnådde resultater tyder på at immunblotting-analyse kan være potensielt mer anvendelige ved påvisning av forhøyede nivåer. Imidlertid, i likhet med en hvilken som helst blotting-analyse, er nytten begrenset av dens tekniske kompleksitet (dvs. immunoutfelling etterfulgt av immunblotting), og resultatene fra denne analysen er bare semi-kvantitativt.
Som konklusjon, våre resultater viser at eggstokkreft pasienter, inkludert de med tidlig sykdom, har forhøyede nivåer av funksjonelle intakte FRα sammenlignet med friske kontroller. Med videre utvikling, herunder større tidlig stadium ovarialcancer utvalgsstørrelser og bedre analyseytelsen, kan bruk av FRα som en biomarkør for eggstokkreft være gjennomførbart.
Takk
Forfatterne ønsker å takke Dr. Linda E. Kelemen for hennes verdifulle diskusjoner med manuskriptet.
