Abstract
Livmorhalskreft er den viktigste årsaken til kreft dødsfall hos kvinner, særlig i utviklingsland og humant papillomavirus infeksjon i forbindelse med flere deregulerte signalveier fører til livmorhalskreftutvikling. TGF-β signalering i senere stadier av kreft er kjent for å indusere epiteliale til mesenchymal overgang fremme tumorvekst. Fytokjemikalier, curcumin og emodin, er effektive som chemopreventive og kjemoterapeutiske forbindelser mot flere krefttyper, inkludert livmorhalskreft. Hovedmålet med dette arbeidet var å studere effekten av curcumin og emodin på TGF-β signalveien og dets funksjonelle betydning for vekst, migrasjon og invasjon i to livmorhalskreft cellelinjer, Siha og HeLa. Siden TGF-β og Wnt /β-catenin signalveier er kjent for å krysstale ha felles nedstrøms mål, analyserte vi virkningen av TGF-β på β-catenin (en viktig aktør i Wnt /β-catenin signal) og også undersøkt om curcumin og emodin modulere dem. Vi har observert at curcumin og emodin effektivt ned regulere TGF-β signalveien ved å redusere ekspresjon av TGF-β Receptor II, P-Smad3 og Smad4, og også motvekt tumorigene effekter av TGF-β ved å inhibere TGF-β-indusert migrering og invasjon. Uttrykk av nedstrøms effektorer av TGF-β signalveien, cyclinD1, p21 og Pin1 ble hemmet sammen med nedregulering av nøkkel mesenchymale markører (Snail og Slug) ved curcumin og emodin behandling. Curcumin og emodin ble også funnet å synergi hemme cellepopulasjon og migrasjon i Siha og HeLa celler. Videre fant vi at TGF-β aktiverer Wnt /β-catenin signalveien i HeLa-celler, og curcumin og emodin ned regulere veien ved å hemme β-catenin. Til sammen våre data gi en mekanistisk grunnlag for bruk av curcumin og emodin i behandling av livmorhalskreft
Citation. Thacker PC, Karunagaran D (2015) Curcumin og emodin nedregulerer TGF-β signalveien i menneske~~POS=TRUNC Cervical kreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0120045. doi: 10,1371 /journal.pone.0120045
Academic Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, CANADA
mottatt: 30 oktober 2014; Godkjent: 02.02.2015; Publisert: 18 mars 2015
Copyright: © 2015 Thacker, Karunagaran. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall hos kvinner over hele verden og mer enn 85% av livmorhalskrefttilfellene og dødsfallene skjer i utviklingsland ut av dette, er India rapportert å utgjøre 27% av den totale livmorhals kreftdødsfall [1]. Den underliggende mekanisme for å fremme cervikale tumorigenesis er kompleks og inkluderer deregulering av nøkkelsignalveier bortsett fra det viktig rolle spilt av HPV (human papillomavirus) infeksjon [2]. TGF-β signalreaksjonsveien inngår i komplekse cellulære prosesser som regulerer utvikling, differensiering og homeostase [3]. TGF-β ligand bindes til TGF-β reseptor II, aktivering av TGF-β reseptor I ved transphosphorylation, som i sin tur aktiverer R-Smads (Smad2 og Smad3) via fosforylering ved deres C-terminale rester. Aktiverte R-Smads danner en hetero med Smad4 og translocate til kjernen hvor de aktiverer TGF-β responsive gener [4]. I de tidlige stadier av tumorgenese, opptrer TGF-β signalveien som en tumor suppressor å hindre progresjonen av cellesyklusen gjennom G
1 fase ved nedregulering av CyclinD1 og cyklinavhengig kinase (CDK) proteiner og induksjon av p15
INK4B, p16
INK4A, som hemmer CDK4 og CDK6; likeså p21
Cip1or p27
Kip1appears å oppfylle funksjonen til p15
INK4B i sitt fravær [5, 6]. TGF-β-mediert apoptose er kjent for å øke forholdet av ekspresjon av proapoptotiske Bax og anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner [7]. Men i fremskredne stadier av kreft, TGF-β signalering er også vist å fremme invasivitet og metastase ved å indusere ekspresjon av sneglen og andre transkripsjonsfaktorer derved forårsaker differensiering av epitelial til mesenchymale fenotype [8]. Slug og N-cadherin, som er kjent å spille EMT, indusert av TGF-β er involvert i migrering og invasjon [9], og TGF-β-mediert induksjon av N-cadherin innebærer Pin1 (peptidyl-prolyl cis /trans-isomerase), kjent å spille en viktig rolle i TGF-β-indusert migrering og invasjon av kreftceller [10]. TGF-β er også vist å stimulere cyclinD1 ekspresjon i det minste delvis ved aktivering av Wnt /β-catenin signalering [11]. Wnt /β-catenin signalering er kjent for å regulere bredt område av cellulære prosesser som regulerer evnen av det multifunksjonelle β-catenin protein for å aktivere transkripsjon av gener som er involvert i celleadhesjon, proliferasjon, differensiering og andre signalveier [12]. Deregulering av Wnt /β-catenin signal er kjent for å påvirke kreftutvikling, og endringer i Wnt /β-catenin signalveien er rapportert i cervical neoplasi [13]. Wnt ligand binder seg til de transmembrane frizzled reseptorene, stabiliserings- β-catenin ved å hemme aktiviteten av glykogensyntasekinase 3 β (GSK-3 β), forbundet med et multimert død kompleks bestående av Axin, adenomatosis polypose coli (APC) og kasein kinase 1α (CK1α), hvor CK1α og GSK-3β phosphorylate β-catenin sekvensielt, merking det for ubiquitinering og proteasomal degradering. Som svar på aktivert Wnt /β-catenin signalering, er GSK-3 β inhibert av disheveled proteiner, hvorved, β-catenin akkumuleres i cytoplasma og translocates inn i kjernen. I kjernen, β-catenin i forbindelse med T-celle faktor /lymfocytter enhancer faktor (Tcf /Lef) familie og andre transkripsjons kofaktorer, aktiverer en rekke målgener inkludert c-myc og cyclin D1 [14]. Konvergens av TGF-β og Wnt /β-catenin signal fremmer epitelial til mesenchymale overgang ved å fremkalle uttrykket av sneglen og Slug [15]. Det er en markert økning i ekspresjon av TGF-β mRNA og protein i humane kreftformer og høy ekspresjon av TGF-β korrelerer med mer avanserte stadier av malignitet og redusert overlevelse [16]. Cervikale kreftceller er kjent for å utskille TGF-β [17], som er i stand til å forsterke intratumoral stroma og redusere tumor infiltrat, styrke tumorvekst og metastase mens gå utenom vertens immunsystem [18]. Sentral rolle TGF-β i å fremme tumorprogresjon antyder at signalveien kan være et godt mål for behandling av kreft [16]. De nåværende behandlingsalternativer for livmorhalskreft som strålebehandling, kirurgi og kjemoterapi, spesielt i utviklingsland, har sine begrensninger i hovedsak på grunn av utilgjengelighet av behandlingsform, kostnaden, alvorlighetsgraden av bivirkninger, høy systemisk toksisitet og narkotika motstand, og hyppig utvikling av infertilitet etterbehandling [19]. Videre, øker motstanden mot kjemoterapi voksende ut av deregulering av signale kaskader er en stor utfordring til effektiv behandling, og TGF-β signalering er en av de signalveier som er kjent for å forårsake chemo-resistens via induksjon av EMT [20]. Chemopreventive fytokjemikalier målrette ulike intracellulære signalkaskader å hemme tumorvekst, spredning og progresjon [21]. Curcumin, en polyphenol avledet fra
Curcuma longa Hotell og emodin, en antrakinon stede i røtter og bark av flere medisinske planter er tenkt å fungere ved å modulere deregulerte signalveier i neoplastiske celler [22, 23]. Curcumin er kjent for å indusere apoptose og blokkere progresjonen av livmorhalskreft [24-26] og emodin er også vist å indusere apoptose i livmorhalskreft-celler [27, 28]. Curcumin er kjent for å inhibere TGF-β signalisering i bryst og bukspyttkjertel kreft [29, 30] mens emodin er kjent for å differensielt regulere TGF-β signalisering i en kontekstavhengig måte [31, 32], men effekten av disse fytokjemikaliene på TGF -β signalering i livmorhalskreftceller gjenstår å bli undersøkt.
Dermed hoved~~POS=TRUNC med dette arbeidet var å studere effekten av curcumin og emodin på TGF-β signalveien og dets funksjonelle relevans for vekst og migrasjon i to livmorhalskreft cellelinjer, Siha og HeLa. Videre var det av interesse å undersøke om den kombinerte effekten av disse forbindelsene hatt noen synergi eller additive effekter. Vi har observert at curcumin og emodin ned regulere TGF-β signalveien i Siha og HeLa-celler, og også motvekt tumorigene effekter av TGF-β ved å inhibere TGF-β-indusert migrering og invasjon av disse cellene. Også kombinasjonen av curcumin og emodin synergi hemmet celleviabilitet i Siha og HeLa celler.
Materialer og metoder
Reagenser
Curcumin, emodin, 5, 5 «, 6 , 6′-tetraklor-1, 1′, 3, 3»-tetraethylbenzimidazol-carbocyanine jodid (JC-1) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). En 10 mM løsning av hver forbindelse (curcumin eller emodin) ble fremstilt i dimetyl sulfoksid (DMSO), lagret som små alikvoter ved -20 ° C, og deretter fortynnet videre i cellekulturmedium etter behov. DMSO (0,4%) ble benyttet som bærerkontroll for alle forsøkene. Menneske TGF-β1was kjøpt fra Peprotech (USA). Geltrex, propidiumjodid, Lipofectamine 2000, Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS South amerikansk opprinnelse) ble anskaffet fra GIBCO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Polyetylenimin (PEI) ble kjøpt fra Polysciences (Warrington, PA, USA). Polyvinylidenfluorid membran og Enhanced chemiluminescence kit ble hentet fra BIORAD (Hercules, CA, USA). Protease og fosfatase inhibitor cocktail ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). β-Actin antistoff ble levert fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) og antistoffer mot TGF-β-reseptor I, TGF-β reseptor II, Smad4, N-cadherin, Pin1, β-catenin, GSK3p og P- GSK3P (ser9) ble oppnådd fra Santa Cruz (CA, USA). Antistoffer mot P-Smad2, Smad2, P-Smad3, Smad3, sneglen, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2 og p15, p16, p21, p27 var fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA) og pepperrot peroksidase konjugert sekundært antistoff ble hentet fra Jackson Immunoresearch Inc. (USA).
Cell kultur
Menneskelige livmorhalskreft cellelinjer, HeLa og Siha, ble hentet fra Nasjonalt senter for Cell Sciences (NCCer) Pune, India . De ble dyrket i fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (cDMEM) sammensatt av DMEM supplert med streptomycin (100 ug /ml), penicillin (100 U /ml) og 10% FBS. Celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37
0 ° C med 5% CO
2.
Resazurin reduksjon assay
Analyse av cytotoksisitet ble bestemt ved Resazurin reduksjon analyse [33]. Celler ble sådd ut i en 96well plate ved en densitet på 5000 per brønn og dyrket over natten. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av curcumin og emodin med eller uten 5 ng /ml TGF-β i cDMEM i 48 timer. Resazurin fargestoff ble tilsatt til mediet til en sluttkonsentrasjon på 0,1 mg /ml, inkubert i 3 timer for reduksjon av det blå fargestoff resazurin til rosa resorufin og absorbansen ble målt ved 570 og 595nm. Dataene ble analysert som prosent av kontroll, hvor kontrollbrønnene ble behandlet med ekvivalente mengder av DMSO alene. De analyserte data som representerer prosentandel populasjon av celler, ble plottet som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (S.E.M.). IC
50 ble oppnådd ved å bestemme konsentrasjonen av forbindelsene som resulterer i 50% inhibering av cellepopulasjonen etter 48 timer med behandling ved å bruke GraphPad PRISM software (GraphPad Software, Inc.).
JC-1-farging
JC-1 (5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid) er et lipofilt fluorescerende kationisk fargestoff som brukes til å vurdere mitokondriemembranpotensialet (ΔΨm) i celler [34]. Intakt ΔΨm viser negativ ladning, slik at JC-en fargestoff å gå inn i mitokondrie matrise der det akkumuleres danner aggregater som fluoresce rød mens den mitokondrielle membranen kollapser i apoptotiske celler, og dermed JC-1 kan ikke akkumuleres i mitokondriene i disse cellene, der det forblir i cytoplasma i monomere form som fluoresce grønt. Nedgangen i forholdet rød til grønn fluorescens fra fargestoffet er en indikasjon på nedsatt ΔΨm av celler. Etter behandling av curcumin og emodin i nærvær eller fravær av TGF-β i 48 timer, ble den JC-1 inneholdende medium (slutt JC-1-konsentrasjonen -5 ug /ml) tilsatt til cellene, etterfulgt av inkubasjon i 20 minutter ved 37 ° C. Deretter ble cellene vasket en gang med PBS, og fluorescensen ble målt ved eksitasjon: 485; utslipp: 535 for monomer form (grønn fluorescens) og eksitasjon 550; utslipp 600 for aggregatene (rød fluorescens), ved hjelp av Perkin Elmer enspire flerplateleser. Forhold av rød til grønn fluorescens ble analysert og plottet mot aktuelle behandlingsforhold.
sårtilheling analysen
Endringer i migrasjon av celler ved behandling ble studert ved hjelp sårheling analysen. Cellene ble dyrket som et monolag i en 48 brønners plate og ved 100% konfluens; en ripe ble gjort på monolaget. Cellene ble forsiktig vasket og behandlet med curcumin og emodin i nærvær eller fravær av TGF-β og holdt i serumfritt medium. Cellemigrering inn i såret overflate ble undersøkt ved mikroskopi. Bilder av skrape ble tatt ved 4X forstørrelse umiddelbart etter tilsetningen av emodin og etter 48 timer. Omfanget av migrasjon i hver prøve ble målt som arealet dekket av cellene i 48t bruker Tscratch analyse programvare [35] og uttrykt som prosent av kontroll.
Matrigel invasjonen assay
Livmorhalskreft celle invasjon ble vurdert ved Boyden analyse ved bruk av Transwell kamre (8 um porestørrelse; Costar, MA, USA). Chambers ble belagt med 100 ul matrigel og inkubert over natten. Serum-sultet Siha (25000) og HeLa (50.000) celler ble sådd i de øvre kamrene i Matrigel-belagte brønner (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) som inneholder 100 mL DMEM pluss ønsket behandling. Curcumin eller emodin inneholdende DMEM med eller uten TGF-β, supplert med 10% FBS ble plassert i de nedre kamre, og cellene ble tillatt å migrere gjennom filteret i 48 timer. Celler som ikke klarte å migrere ble fjernet fra den øvre overflaten av kamrene ved å skrape med en bomullspinne. Celler som ble overført gjennom matrigel og membranen barriere mot den nedre membranen ble fiksert i 100% metanol og farget med 2% krystallfiolett. Bilder av de fargede cellene ble tatt på 10X forstørrelse. Graden av invasjonen ble uttrykt som prosent av kontroll utledet fra absorbansen til krystallfiolett frigjort ved lysering av cellene med 10% eddiksyre ved 595nm.
cellesyklusanalyse
propidiumjodidfarging og strømnings cytometri ble brukt for å vurdere cellesyklusen fordelingsprofil. De behandlede celler ble vasket med PBS-EDTA og deretter høstet ved å bruke 0.25% Trypsin EDTA og suspendert i cDMEM. Cellene ble deretter vasket med PBS og sentrifugert ved 1200 rpm ved 4 ° C i 5 minutter, og resuspendert i 300 ul PBS, fiksert med 0,7 ml 70% etanol over natten. Fikserte celler ble sentrifugert ned, vasket med 0,1% FBS inneholdende PBS og deretter suspendert i 300 mL propidium jodid (2 ug /ml), fargeløsning med RNase A (200 pg /ml) i mørke, inkubert ved 37 ° C i 1 time. Data fra 10.000 celler ble samlet for hver prøve. Datainnsamling og analyse ble utført på en flowcytometer (Beckman Coulter cellelaboratorium Quanta).
SBE og TOPFlash luciferase reporter analysen
Celler (30000 /brønn) ble sådd i 96 brønners plater og co -transfected med SBE4-Luc reporter konstruksjon, som inneholder fire eksemplarer av Smad bindingssetet (GTCTAGAC) klonet inn PBV-Luc indikasjon på nedstrøms transcriptional aktivering av TGF-β signalveien (Addgene plasmid 16495) [36] eller TOPFlash, en luciferase reporter fra β-catenin-mediert transcriptional aktivering, med 7 TCF /LSF bindingsseter oppstrøms av luciferase (Addgene plasmid 12456) [37] og PRL-TK (Renilla luciferase) plasmid bruker PEI (for SBE luciferase konstruere) og lipofektamin 2000 (for TOPFlash luciferase konstruksjon) i henhold til produsentens instruksjoner, i serum og antibiotika gratis DMEM. Seks timer etter transfeksjon, ble mediet skiftet, og cellene ble behandlet med curcumin og emodin i nærvær eller fravær av TGF-β i cDMEM. Etter 24 timer ble cellene lysert og firefly og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble analysert [38].
Protein isolasjon og western blotting
Celler ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) 48t etterbehandling , og totalt protein ble ekstrahert etter skraping og oppsamling av cellene i radio immuno nedbør assay (RIPA) lyseringsbuffer [20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM natriumklorid, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre, 1 mM β-glycerofosfat, 1% Triton X-100 , 2,5mM natriumpyrofosfat, 1 mM natriumortovanadat, 0,5% natrium-deoksycholat, 1 mM fenyl- metan sulfonylfluorid, 20 mM natriumfluorid, 1% protease inhibitor], inkubert i 1 time og sentrifugert. Totalt celle-protein i supernatanten ble beregnet ved hjelp av Bradford-analysen, og 30μg av protein ble underkastet SDS-PAGE separasjon etterfulgt av overføring til polyvinylidenedifluoride membran. Membranen ble inkubert med primære antistoffer mot TGF-β-reseptor I, TGF-β reseptor II, P-Smad2, Smad2, P-Smad3, Smad3, Smad4, β-catenin, GSK3P, P-GSK3p (ser9), N-cadherin , Pin1, sneglen, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2, P15, p16, P21, p27, CDK6 (1: 1000 fortynning), eller β-Actin (1: 10.000 fortynning) over natten, etterfulgt av inkubasjon med et HRP- konjugert sekundært antistoff. Proteinbånd ble oppdaget ved hjelp av en forbedret chemiluminescence deteksjon kit og visualisert ved hjelp av Versa Doc bildeanalysesystem (Bio-Rad).
Statistisk analyse
To tailed uparet t-test eller to- veis analyse av varians ble benyttet for statistisk analyse av de ubehandlede og behandlede prøver eller som angitt. P-verdiene 0,05, 0,001 0.01and er indikert med «* » ** «og» *** «, henholdsvis.
Resultater
Curcumin og emodin indusere cytotoksisitet i nærvær eller fravær av TGF- β i menneskelige livmorhalskreftceller
Vi har testet effekten av ulike konsentrasjoner av curcumin og emodin på viabilities menneskelivmorhalskreftceller og IC
50 verdier beregnet fra disse dataene er oppført i tabell 1. curcumin var relativt mer cytotoksisk til humane livmorhalskreftceller analysert i denne studien (tabell 1), og det ble brukt på 15 pm i Siha og 25 mikrometer i HeLa-celler, mens emodin ble brukt på 40μM i Siha og HeLa celler for videre eksperimenter. Siden sekresjon av TGF-β inn i stroma er ofte observert i løpet av de avanserte stadier av livmorhalskreft, [18], vi ønsket å studere effekten av disse forbindelser i nærvær av TGF-β. I samsvar med vår tidligere rapport, redusert 5 ng /ml TGF-β cellepopulasjonen [39] og hemmet mitokondriemembranpotensialet i Siha celler (Fig. 1A og C), mens HeLa-celler forble upåvirket (Fig. 1 B og D). Curcumin og emodin ble funnet å inhibere cellevekst (Fig. 1A og B) som observert av Resazurin reduksjon assay i nærvær og fravær av TGF-β i disse celler. Nedgangen i mitokondriemembranen potensialet (fig. 1C og D) forårsaket av curcumin eller emodin som analysert ved JC-1 fargestoff fluorimetri var signifikant i Siha og HeLa-celler. Men denne effekten var uavhengig av TGF-β i HeLa men var ikke signifikant i nærvær av TGF-β i Siha-celler (fig. 1C og D). Disse resultatene tyder på at selv om TGF-β redusert cellevekst og mitokondriemembranpotensialet i Siha men ikke i HeLa-celler, det gjorde ikke påvirke curcumin eller emodin hemming av vekst og mitokondriemembranpotensialet i disse cellene.
Siha (A) og HeLa (B) celler ble behandlet med 15 og 25 pm curcumin, henholdsvis eller 40 uM emodin i nærvær (TGF-β) eller fravær (UT) av 5 ng /ml TGF-β i 48 timer og analysert med hensyn på cellelevedyktighet av Resazurin reduksjon metode. Prosentvis cellelevedyktigheten ble beregnet ved normalisering av absorbansen av behandlete prøver mot DMSO-kontroll (n = 3, middelverdi ± S.E.M.). Curcumin eller emodin behandlet Siha (C) og (D) HeLa-celler i nærvær (TGF-B) og fravær (UT) av TGF-β ble analysert for JC-1-aktivitet ved anvendelse av en fluorimetrisk metode som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene ble plottet som gangers endring av midlere fluorescensintensitet (MFI) i forhold til DMSO-kontroll (n = 3, middelverdi ± SEM).
Siden 5 ng /ml TGF-β ikke hadde noen vesentlig virkning på cellenes levedyktighet eller mitokondriemembranpotensialet i HeLa-celler, enten det er en forskjellig konsentrasjon av TGF-β ville ha lik eller ulik respons ble undersøkt. I denne forbindelse ble HeLa-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av TGF-β og dens virkning på dets signal ble bestemt ved å analysere aktiviteten av TGF-β-responsive SBE-Luc reporter-konstruksjonen, i en utlesning analysen. Det ble observert at 2,5 ng /ml TGF-β signifikant induserte SBE luciferase-aktivitet, men det var ingen signifikant forskjell i graden av induksjon med økning i konsentrasjonen (fig. 2A). Videre ble HeLa-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av TGF-β i nærvær eller fravær av curcumin eller emodin testet for endringer i cellenes levedyktighet og mitokondriemembranpotensialet. Forskjellige konsentrasjoner av TGF-β hadde ingen signifikant effekt på cellelevedyktighet (Fig. 2B) eller mitokondriemembranpotensialet (figur 2C.), Og det ikke påvirke inhiberingen av cellenes levedyktighet (fig. 2B) eller mitokondriemembranpotensialet (fig. 2C) av curcumin og emodin i disse cellene. Disse resultater indikerer at mangel på respons fra HeLa-celler til TGF-β mot cellenes levedyktighet og mitokondriemembranpotensialet var uavhengig av konsentrasjonen, og også TGF-β ikke påvirke den vekstinhibitoriske aktivitet av curcumin eller emodin.
HeLa-celler (A) transfektert med SBE ildflueluciferase og TK-Renilla luciferase konstruksjoner ble behandlet (6H stolpe transfeksjon) med 2,5, 5, 10 og 20 ng /ml TGF-β og analysert for luciferaseaktiviteten 24 timer etter behandling. Transfeksjonseffektiviteten ble normalisert ved å beregne det relative forholdet mellom ildflue luciferase-aktivitet for å Renilla, og resultatene ble plottet som gangers endring i forhold til den ubehandlede kontroll. HeLa-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TGF-β i nærvær og fravær av curcumin eller emodin og analysert med hensyn på cellelevedyktigheten ved Resazurin reduksjonsmetoden (B), og mitokondriemembranpotensialet ved å analysere JC-1-aktivitet (C) ved anvendelse av en fluorimetrisk metode etter 48h som beskrevet i materialer og metoder (n = 3, middelverdi ± SEM).
Curcumin og emodin hemme cellevekst, migrering og invasjon i nærvær eller fravær av TGF-β i Siha og HeLa-celler
TGF-β er kjent for å påvirke proliferasjon og migrering under karsinogenese [40]. Vi fant at TGF-β indusert G
0 /G
1 arrest i Siha, men ikke i HeLa-celler (fig. 3A) og effekt av curcumin og emodin på cellesyklusprofil under disse betingelser ble ytterligere analysert. Curcumin indusert G
2 /M arrest i Siha celler betydelig, mens emodin effekt på G
2 /M-fasen var ikke statistisk signifikant, selv om arrest var synlig (P-0.08). Tilstedeværelsen av TGF-β hadde ingen betydelig innvirkning curcumin effekt; mens emodin-mediert delvis G
2 /M rest ble funnet å bli spist opp av TGF-β. Men både curcumin og emodin øket under G
0 /G
en populasjon (indikativ for apoptose), i nærvær og fravær av TGF-β betydelig i HeLa-celler (fig. 3A). Videre, som observert ved sårheling assay, TGF-β indusert migrasjon i begge Siha og HeLa-celler og curcumin og emodin ble funnet å hemme migreringen selv i nærvær av TGF-β (fig. 3B og C). Videre invasjon analyse ved bruk av Matrigel belagt Transwell innstikk indikerte at TGF-β indusert invasjon i begge Siha og HeLa-celler, og curcumin og emodin inhiberte både basal og av TGF-β indusert invasjon i disse cellene (fig. 4). Disse resultatene tyder på at curcumin og emodin indusere henholdsvis G
2 /M arrest i Siha og apoptose i HeLa-celler,. De hemmer signifikant migrering og invasjon av Siha og HeLa-celler, og er også i stand til å motvirke TGF-β indusert migrering og invasjon i disse cellene.
Siha og HeLa (A) celler ble behandlet med curcumin eller emodin i nærvær eller fravær av TGF-β i 48 timer og underkastet cellesyklusanalyse ved hjelp av flow cytometri. Prosentvis fordeling av ulike faser av cellesyklusen ble plottet på Y-aksen mot de angitte behandlingsbetingelsene på X-aksen. Siha (B) og HeLa (C) celler ble sådd i et sammenflytende monolag. 16h etter såing, ble en ripe laget av en mikro spiss, og egnet behandling ble gitt i serumfritt medium. Ripet overflate ble fotografert på 0h og 48t etter behandling. Graden av migrering i hver prøve ble målt som arealet dekket av cellene i 48 timer ved hjelp av TScratch programvare og representert som prosentvis endring i forhold til DMSO-kontroll (B) (n = 3, middelverdi ± SEM).
Siha (25000) og HeLa (50000) celler sådd ut på Boyden kammer belagt med Matrigel, ble behandlet med curcumin, emodin og /eller TGF-β i 48 timer. Post behandling ble cellene farget som beskrevet i materialer og metoder, og avbildes med mikroskop (A). Kvantifisering av invaderte celler (B og C) ble utført ved å avlese absorbans av krystallfiolett ved 595nm. Prosentvis invasjon ble beregnet som gangers endring i forhold til ubehandlet kontrollgruppe (n = 3, middelverdi ± SEM)
Curcumin og emodin inhibere TGF-β signalveien i Siha og HeLa-celler
for å undersøke hvorvidt disse forbindelser vil inhibere TGF-β signalering, TGF-β indusert SBE luciferaseaktivitet i Siha og HeLa-celler ble analysert og funnet å bli inhibert av både curcumin og emodin (fig. 5A og B). Å forstå hvis TGF-β signalering inhiberes ved å påvirke ekspresjon av dens reseptorer, studerte vi effekten av disse forbindelsene på ekspresjon av TGF-β reseptorproteiner. Som observert ved Western blotting, både i Siha og HeLa-celler, curcumin og emodin betydelig ned regulert ekspresjon av TGF-β reseptor II, mens TGF-β-reseptor I ble nedregulert bare i HeLa-celler, og i mindre grad (fig. 5C og D). Selv om både Siha og HeLa-celler oppførte seg på samme måte, effektene var mer uttalt i HeLa celler og så de ble valgt for videre studier. I denne forbindelse, ble ekspresjonen av Smad proteiner ved behandling med disse forbindelsene i nærvær og fravær av TGF-β analysert ved western blotting. TGF-β er kjent for å betydelig induserer fosforylering av Smad2 og Smad3 fra 15 minutter til én time av behandlingen [41, 42], og således fosforyleringen av Smad2 og Smad3 proteiner ble analysert i HeLa-celler forbehandlet med curcumin og emodin i 48 timer, og deretter behandlet med TGF-β i 30 min. TGF-β indusert fosforylering av Smad2 og Smad3 signifikant (fig. 6A). Curcumin og emodin inhiberte signifikant induksjon av fosforylering av Smad2 og Smad3 i HeLa-celler (Fig. 6A). Videre, siden endringer i ekspresjon av nedstrøms mål for TGF-β og effektorer knyttet til EMT er generelt observert ved 24 til 72 t [42], var det av interesse å studere effekten av samtidig behandling av curcumin eller emodin med TGF-β etter 48h av TGF-β behandling på nøkkelspillere, nedstrøms mål og effektorer av TGF-β signalveien. Ved 48h inkubasjon også, ble TGF-β funnet å indusere fosforylering av Smad2 /Smad3, og ekspresjon av Smad4 proteiner og deres basal samt TGF-β-indusert ekspresjon ble nedregulert av curcumin og emodin, mens total Smad2 og Smad3 ekspresjon forble upåvirket (fig. 6B). Således ble det fastslått at curcumin og emodin ned regulere TGF-β signalveien ved å nedregulere TGF-β reseptor II, P-Smad2, P-Smad3 og Smad4.
Siha (A) og (B) HeLa-celler transfektert med SBE ildflueluciferase og TK-Renilla luciferase konstruksjoner og behandlet med curcumin og emodin i nærvær eller fravær av TGF-β, ble undersøkt for luciferase-aktivitet. Transfeksjonseffektiviteten ble normalisert ved å beregne det relative forholdet mellom ildflue luciferase-aktivitet for å Renilla, og resultatene ble plottet som gangers endring i forhold til den ubehandlede kontroll. Representative forsøk er det vist en annen uavhengig eksperiment ga lignende resultater. Totale cellelysater fra Siha (C) og HeLa (D) celler behandlet med curcumin eller emodin i nærvær eller fravær av TGF-β i 48 timer og ble utsatt for immunblotting med TGF-β reseptor I (TGFRI), TGF-β reseptor II ( TGFRII) eller β-Actin (lasting kontroll) antistoffer. En representant blot er vist og verdiene som vises representerer densitometrisk analyse av proteinbåndet med hensyn til p-Actin og lignende resultater ble bekreftet i en annen uavhengig eksperiment.
Totalt cellelysater av HeLa-celler forbehandlet med curcumin og emodin i 48 timer, og ble behandlet med TGF-β i 30 minutter ble utsatt for immunblotting med P-Smad2 og P-Smad3 proteiner (A). Totalt cellelysat av HeLa-celler behandlet med curcumin eller emodin, i nærvær eller fravær av TGF-β i 48 timer ble utsatt for immunblotting med P-Smad2, P-Smad3, Smad2, Smad3, Smad4 og β-Actin (lasting kontroll) antistoffer ( B). En representant blot er vist og verdiene som vises representerer densitometrisk analyse av proteinbåndet med hensyn til p-Actin og lignende resultater ble bekreftet i en annen uavhengig eksperiment.
Curcumin og emodin påvirker nedstrøms spillere og effektbokser av TGF-β signalveien
er Smad-transkripsjonsfaktorer komplekser kjent for å regulere CDK6 hemmer p21 [5]. Vi har observert at ekspresjon av p21 og CyclinD1 ble funnet å bli indusert av TGF-β, men ble nedregulert ved curcumin og emodin behandling (Fig. 7A). TGF-β-indusert migrering fremmes ved Pin1 [10], og som forventet, curcumin og emodin ned regulert Pin1 signifikant (fig. 7A). Vi fant at curcumin og emodin betydelig ned regulert ekspresjon av p15, p16, CDK6, p27 selv om curcumin ikke kunne hemme p16 i nærvær av TGF-β (fig. 7B). Bax til Bcl-2-forhold antyder mottakelighet av cellene til celledød [43], og det er opp regulert ved curcumin og emodin behandling (Fig. 7C).
