Abstract
I ikke-kreftceller, fosforylerte proteiner eksisterer forbigående, blir de-fosforylert av spesifikke fosfataser som terminerer forplantning av signalveier. I kreftformer, kompromittert fosfatase-aktivitet og /eller ekspresjon forekommer og bidra til tumor fenotype. Den ikke-reseptoren fosfatase, PTPN13, har nylig blitt kalt en antatt tumor suppressor. Det redusert uttrykk i brystkreft korrelerer med redusert total overlevelse. Her viser vi at PTPN13 regulerer et nytt signal kompleks i brystkreft består av ErbB2, Src, og EphrinB1. Så vidt vi vet, dette signaliserer komplekset har ikke tidligere blitt beskrevet. Co-immunoutfellingsstudier og lokalisering studier viser at EphrinB1, en PTPN13 substrat, samhandler med ErbB2. I tillegg forbedrer onkogene V660E ErbB2 mutasjon dette samspillet, mens Src kinase formidler EphrinB1 fosforylering og påfølgende MAP kinase signalering. Redusert PTPN13 funksjon for enda bedre signalering. Foreningen onkogene kinaser (ErbB2, SRC), et signaltrans ligand (EphrinB1) og en fosfatase tumor suppressor (PTPN13) antyder at EphrinB1 kan være et aktuelt terapeutisk mål i brystkreft husing ErbB2 aktiverende mutasjoner og redusert PTPN13 uttrykk.
Citation: Vermeer PD, Bell M, Lee K, Vermeer DW, Wieking BG, Bilal E et al. (2012) ErbB2, EphrinB1, Src kinase og PTPN13 signale Komplekse Regulerer MAP kinase signalnettverk i Human Kreft. PLoS ONE 7 (1): e30447. doi: 10,1371 /journal.pone.0030447
Redaktør: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Canada
mottatt: 04.08.2011; Godkjent: 16 desember 2011; Publisert: 18 januar 2012
Copyright: © 2012 Vermeer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av 7R01DE018386-03 fra National Institutes of Health /National Institute of Dental og kraniofaciale Forskning og staten South Dakota translasjonell Cancer sub-award 3SB161. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ErbB2 (Her2) forsterkning /over-uttrykk forekommer i 20-30% av brystkrefttilfeller som resulterer i aggressiv svulst atferd og dårlig prognose [1], [2]. ErbB2 aktivering via hetero dimerization med andre familiemedlemmer eller homo-dimerisering med seg selv (når det uttrykkes ved høye nivåer) initierer intracellulære signaler som kulminerer i transkripsjon av mange gener som regulerer spredning, overlevelse, differensiering, invasjon og metastasering. På denne måten spiller ErbB2 en nøkkelrolle i iscenesetter en aggressiv brystkreft fenotype [3]. Fremme av målrettede terapier slik som trastuzumab, et humanisert anti-ErbB2-antistoff, forbedrer overlevelse av HER2 brystkreftpasienter [4], [5]. Men de fleste pasientene ikke svare på trastuzumab (62-74%), husing
de novo
motstand; de som svarer nytte sterkt med en økt sannsynlighet for å overleve over fem år eller gjenværende tumor gratis. Dessverre, 25% av disse i utgangspunktet reagerer pasientene senere mislykkes terapi [6] – [9]. Som
de novo
motstand, stier som fører til ervervet trastuzumab motstand fortsatt uklare [10], [11]. Mens betydelige fremskritt har blitt gjort i å forstå rollen av ErbB2 i brystkreft initiering og progresjon, den overveldende motstand mot trastuzumab behandling antyder at flere signalveier finnes som omgå ErbB2-antistoff-mediert blokade. Karakterisere disse banene, og enda viktigere, de proteinene som initierer dem, vil definere nye mål for terapeutisk intervensjon som kan re-sensitiv HER2 pasienter til trastuzumab og bedre overlevelse.
I tillegg til forsterkning /over-uttrykk, polymorfismer i ErbB2 ved kodon 655 (innenfor transmembrandomenet) er forbundet med øket utvikling av brystkreft i visse populasjoner, noe som tyder på at endringer i ErbB2 kodende sekvensen kan også ha funksjonelle konsekvenser forbundet med kreft [12] – [14]. ErbB2 kodende sekvenser kan påvirke assosiasjoner med partnerproteiner og deretter endre ErbB2-mediert intracellulær signalering. Dermed som trastuzumab motstand, identifisere disse banene vil være avgjørende for å definere behandlingsformer som blokkerer eller omgå dem, bedre overlevelse.
Mens dominerende pro-onkogene funksjoner som beskrevet for ErbB2 kinase i brystkreft forekommer ofte i fast svulster, endringer i fosfataser også oppstå og fungere som tumor suppressors. For eksempel, ikke-reseptor protein tyrosin fosfatase, PTPN13 (også kjent som FAP1, PTPL1, PTPLE, PTPBAS, PTP1E, PTP-BL er musehomolog) [15] – [17] har nylig blitt kalt en antatt tumor suppressor. PTPN13 er en multi-modul inneholdende fosfatase. Sine fem PDZ protein-protein interaksjons domener megle assosiasjoner med mange cellulære proteiner, og som sådan, foreslår at PTPN13 mutasjoner kan endre en rekke ulike cellefunksjoner [18], [19]. PTPN13 mutasjoner er i virkeligheten blitt identifisert i kolorektal [16], hode og hals [20] og lever-kreft [17], [21]. Viktigere, redusert PTPN13 uttrykk i brystkreft korrelerer med redusert total overlevelse [22]. Videre fant vi tidligere at redusert PTPN13 uttrykk synergizes med en aktivert ErbB2 transmutasjon (mNeuNT) styrke tumorvekst og invasjon
in vivo product: [23]. Mens i mennesker forsterkning /overekspresjon av ErbB2 er onkogen, i dyr aktive transmembrane ErbB2-mutasjoner er nødvendig for tumorvekst. Dermed våre
in vivo
musestudier nødvendiggjøre bruk av mNeuNT, en konstitutivt aktiv trans ErbB2 mutasjon. Imidlertid funnet at humane ErbB2-polymorfismer kan påvirke utbredelsen brystkreft antyder at studiet av transaktiverende ErbB2-mutasjoner hos dyr (i fravær av amplifisering /over-ekspresjon) kan vise seg fordelaktig i sammenheng med sykdom hos mennesker. Mens en studie av Zhu
et al.
Antyder at PTPN13 regulerer ErbB2 funksjon direkte av de-fosforylering ErbB2 signal domene [24], har vi ikke funnet at i vårt system som tyder på at PTPN13 og aktivert ErbB2 alene kan ikke konto for den forbedrede nedstrøms signalering, tumorvekst, invasjon og tydelig i vår publiserte studier [23]. Vi har derfor en hypotese om at flere modifikatorer fungere i PTPN13 /ErbB2 synergi observert. Vi videre begrunnet at en PTPN13 fosfatase underlaget med signalkapasitet kan være en slik kandidat molekyl. Derfor analyserte vi EphrinB1 [25].
EphrinB1 tilhører en familie av ligander som binder og aktiverer Ef reseptor tyrosin kinaser. Efrin ligander er unike, innbinding og aktivere signalering fra sine beslektede reseptorer, og selv bli fosforylert og initiere egne signalkaskader. Dette Efrin bestemt egenskap som kalles «omvendt» signaliserer. «Reverse» signaliserer følgende Ef reseptor engasjement utgjør den konvensjonelle signalveien. Men Ephrins er promiskuøse i sine foreninger og signalering oppstår følgende ikke-Ef reseptor interaksjoner [26], [27]. Denne typen Efrin signalering er ikke-konvensjonelle.
Gitt at EphrinB1 er en fosfatase substrat av PTPN13, redusert PTPN13 uttrykk eller funksjonelle PTPN13 mutasjoner (som begge forekommer i solide tumorer) sannsynlig resultere i økt EphrinB1 fosforylering og påfølgende signalering. I sammenheng med brystkreft hvor redusert PTPN13 uttrykk korrelerer med dårlig overlevelse, definerer banene aktivert i fravær av PTPN13 kan identifisere viktige mål for terapeutisk intervensjon og forbedre overlevelse. Således hypotese vi at synergien mellom reduksjonen PTPN13 og økt ErbB2 aktivering som driver tumorvekst og invasjon medieres via EphrinB1 og videre at EphrinB1-mediert signalisering er forbedret i brystkreft med kompromittert PTPN13 uttrykk. Her beskriver vi en roman sammenheng mellom ErbB2 og EphrinB1. Ekspresjon av et aktivert ErbB2 mutant eller over-ekspresjon av villtype-ErbB2 (som i HER2 brystkreft), sammen med nedsatt PTPN13 ekspresjon eller funksjon, forbedrer ikke bare kompleksdannelse, men også fører til EphrinB1 fosforylering og tilhørende nedstrøms signalering. I denne rapporten karakteriserer vi dette komplekset, signaler formidlet fra den, og dens relevans for brystkreft. I tillegg viser vi at dette komplekset finnes i andre epitelceller og foreslår at signale fra komplekset spiller en funksjonell rolle i andre solide tumorer også.
Resultater
PTPN13 tap oppstår i epiteliale kreft
redusert PTPN13 uttrykk korrelerer med redusert total overlevelse ved brystkreft [22]. Vi lurte på om denne sammenhengen eksisterte på tvers av alle typer bryst kreft eller om det var spesifikke for en bestemt subtype. Derfor analyserte vi en genekspresjon utvalg fra 200 tidlig stadium brystkreft og 7 normale bryst prøver for PTPN13 med særlig vekt på subtype spesifisitet. Mens Her2, Luminal A, B Luminal brystkreft og normale bryst prøver å uttrykke relativt høye nivåer av PTPN13, basal-lignende (BL) tumorer uttrykker signifikant lavere nivåer av PTPN13 mRNA (figur 1 A, p = 0,00044 for basal vs. normal). Sammenligninger av de andre undertypene med normal bryst var ikke signifikant. Men mens PTPN13 mRNA nivåer ved HER2, Luminal A og Luminal B brystkreft er ikke annerledes enn normalt bryst, dataene ikke eliminere muligheten for at PTPN13 funksjonelle mutasjoner forekommer i disse undergrupper som kan resultere i en fenotype lik den som finnes i sin fravær.
(A) Relativ PTPN13 mRNA uttrykk for PTPN13 i molekylært karakteriserte brystsvulster. Basal-lignende (BL) brystkreft PTPN13 uttrykk er redusert i forhold til det normale bryst (p = 0,00044 for basal vs. normal). (B) Western blot-analyse av brystkreftcellelinjer. MDA-MB231, MDA-MB468, HCC1143, HCC1954 er brystkreftcellelinjer med BL brystkreft egenskaper. Den BT474-cellelinjen har de Her2 /ErbB2-overuttrykkende brystcanceregenskaper. MCF7 og T47D er brystkreftcellelinjer med luminal egenskaper. HEK293-celler overuttrykkende PTPN13 tjente som en positiv kontroll. (C) BL brystkreftcellelinjer, MDA-MB231 og MDA-MB468, uttrykker lav eller høy PTPN13 henholdsvis ble analysert ved western blot. (D) HEK293 celler stabilt slått ned for EphrinB1 (sh EphrinB1) eller kontroll ble analysert ved western blot. (E) MDA-MB468-celler ble transient transfektert med et plasmid shRNA målretting PTPN13 (shPTPN13) eller et ikke-tie shRNA-konstruksjon (ikke-demping) og analysert ved hjelp av western blot for de angitte proteiner. (F) HaCaT-celler, en human keratinocytt-cellelinje, og UM-SCC84 celler, en HPV-negative hode og hals squamous cell carcinoma cellelinje stabilt slått ned for PTPN13 (sh PTPN13) eller styrelinjer ble analysert ved hjelp av western blot. (G) HaCaT-celler som stabilt slått ned for PTPN13 (sh PTPN13) eller over-uttrykke HPV16 E6 proteinet (PHV16 E6) eller kontroll ble analysert ved hjelp av western blot for fosforylert EphrinB1, fosforylert ERK1 /2, total ERK1 /2, og GAPDH.
Vi har også undersøkt PTPN13 protein uttrykk i sub-type definert brystkreft cellelinjer [28]. Mens PTPN13 uttrykk varierte mellom cellelinjene, tre av fire av de BL cellelinjer testet utstilt nesten fraværende PTPN13 protein (figur 1B). BL svulster utgjør en heterogen gruppe av kreft, men generelt er aggressive svulster med en dårlig prognose [29]. Dermed våre funn er i samsvar med de av Revillion
et al
samkjøre redusert PTPN13 uttrykk og dårlig total overlevelse [22]. Disse dataene støtter hypotesen om at tapet av PTPN13 uttrykk konsekvenser svulst fenotype og foreslår at PTPN13 spiller en rolle i å regulere epitelproliferasjon, migrasjon og /eller invasjon i BL brystkreft.
PTPN13 tapet øker fosforylert EphrinB1 og ERK1 /2
PTPN13 fem PDZ domener megle foreninger med mange proteiner, inkludert EphrinB1 [19]. Etter binding PTPN13 de-fosforylerer EphrinB1, slå av omvendt signale [18], [19]. For å teste effekten av redusert /borte PTPN13 på EphrinB1 fosforylering, vi undersøkt to BL brystkreftcellelinjer: MDA-MB231, uttrykker nesten umulig å oppdage PTPN13 protein, og MDA-MB468, uttrykker endogen PTPN13 protein (figur 1B). Som forventet lav PTPN13 uttrykk (MDA-MB231) korrelerer med økt EphrinB1phosphorylation mens endogen PTPN13 uttrykk (MDA-MB468) korrelerer med lav fosfor-EphrinB1 (figur 1C). Disse dataene er konsistent med EphrinB1 være en PTPN13 fosfatase substrat og foreslå at redusert PTPN13 uttrykk i BL brystkreft cellelinjer øker fosforylering av EphrinB1.
Gitt EphrinB1 evne til å signalisere, vi videre spurt om fosforylert EphrinB1 korrelert med økt nedstrøms signalering. Molekylær analyse av BL brystcarsinomer viser at mange genproduktene i BL klynge er forbundet med MEK /Erk aktivering, således valgte vi å analysere fosforylering status av ERK1 /2 i disse BL cellelinjer [30] – [33]. Vi fant at redusert /fraværende PTPN13 uttrykk (MDA-MB231) korrelerer med økt fosforylering av ERK1 /2 (figur 1C); mens endogene PTPN13 uttrykk (MDA-MB468) korrelerer med redusert ERK1 /2 fosforylering. Disse dataene antyder at EphrinB1 aktivering (fosforylering) signaler via MAP kinase veien. For å teste dette, vi stabilt slått ned EphrinB1 i HEK293 celler, valgt på grunn av deres enkle transfeksjon forhold til brystkreftcellelinjer. Knock-down av EphrinB1 resulterer i fremtredende dempning av fosforylert ERK1 /2 (figur 1D) var i overensstemmelse med EphrinB1-mediert ERK1 /2 aktivering. Til sammen dataene tyder på at fravær av PTPN13 resulterer i forbedret EphrinB1 aktivering og samtidig ERK1 /2 fosforylering.
Som en ytterligere test, endogen PTPN13 ble midlertidig slått ned i MDA-MB468 celler (shRNA-mediert , shPTPN13). Som spådd, PTPN13 knock-down økt fosforylering av EphrinB1 samsvar med PTPN13 regulering av EphrinB1 fosforylering (figur 1E) [25]. Videre økte EphrinB1 assosiert med ErbB2 i lysatene fra shPTPN13 celler som tyder på at fosforylerte EphrinB1 kollegaer lettere med ErbB2 i forhold til ufosforylerte EphrinB1. Overraskende, PTPN13 knock-down påvirket ikke ERK1 /2 fosforylering, noe som tyder på at enten EphrinB1 signaliserer ikke via MAP kinase sti i MDA-MB468 celler eller som av signalanlegget er modulert i disse cellene via ekstra (som ennå udefinerte) komponenter.
Tidligere forsøk fra vårt laboratorium til over-express PTPN13 har vært mislykket som sin økt uttrykk resulterer i celledød, og dermed begrense vår evne til å analysere nedstrøms effekter [34]. Derfor var vi ikke i stand til å teste effekten av over-uttrykke PTPN13 i MDA-MB231 celler som mangler endogen uttrykk. Imidlertid, gitt dens innvirkning på EphrinB1 fosforylering i brystkreftceller, spekulert vi at en reduksjon i PTPN13 ekspresjon eller funksjon kan være en vanlig og, enda viktigere, en nøkkel endring i andre epiteliale kreftformer. For å teste dette konseptet, vi banket ned PTPN13 i en human keratinocyte cellelinje (HaCaT celler) og analysert dens innvirkning på signale. Redusert PTPN13 uttrykk faktisk forbedret EphrinB1 og ERK1 /2 fosforylering (figur 1F, HaCaT). Tilsvarende knock-down av PTPN13 i hode og nakke plateepitelkarsinom cellelinje, UM-SCC84, resulterte i økt EphrinB1 og ERK1 /2 fosforylering (figur 1F, UM-SCC84). Viktigere, tidligere studier fokusert på humant papillomavirus (HPV) -associated hode og nakke kreft viser at HPV16 E6 oncoproteinet binder og er rettet mot PTPN13 for degradering [34], [35]. Således HPV-positive celler tjente som en ytterligere test av funksjonen av PTPN13 i cellulær signalisering i forbindelse med
viralt
-mediert kreft. Dermed har vi analysert tidligere preget mus mandel epitelceller stabilt uttrykk HPV16 E6 eller de stabilt slått ned for PTPN13 [34], [35]. Faktisk, HPV16 E6 uttrykk forbedret EphrinB1 og ERK1 /2 fosforylering, i samsvar med redusert /borte PTPN13 uttrykk. Videre knock-down av PTPN13 i mus mandel epitelceller viste en lignende effekt (shPTPN13, figur 1G). Samlet utgjør disse data tyder på at redusert PTPN13 uttrykk forbedrer EphrinB1 og ERK1 /2 fosforylering i epitelceller. Oppdagelsen av at høy risiko HPV-virus har utviklet en mekanisme for å eliminere mobil PTPN13, understreker videre viktigheten av PTPN13 regulatoriske funksjoner kritiske i cellulære signalveier. Dataene tyder på at PTPN13 uttrykk kan være interessant å vurdere i mange, om ikke alle, solide tumorer.
ErbB2 co-immunpresipitatene og co-lokaliserer med EphrinB1
Dataene ovenfor tyder på at redusert /tapte PTPN13 øker EphrinB1 aktivering som deretter kan modulere nedstrøms fosforylering av ERK1 /2. har tidligere vist vårt laboratorium som redusert /borte PTPN13 synergizes med ErbB2, poten MAP kinase signaliserer [23]. Således vi lurt enten EphrinB1 fosforylering og den resulterende ERK1 /2 signalering skjer i en ErbB2-mediert, ikke-konvensjonell måte. Derfor spurte vi om EphrinB1 forbinder med ErbB2 og fullført co-nedbør og samlokalisering studier. Vi fant ut at EphrinB1 og ErbB2 co-utfelling (figur 2A) fra lysatene stammer fra brystkreftcellelinjer samt HaCaT celler. Interessant, knock-down av PTPN13 i HaCaT celler (shPTPN13) forbedret rullegardin av EphrinB1 med ErbB2, igjen tyder på at fosforylerte EphrinB1 kollegaer lettere med ErbB2 enn ufosforylerte staten. I tillegg, i alle tilfeller flere former for EphrinB1 ble trukket ned med ErbB2 (Figur 2A piler). Vi spekulerer disse bandene representerer ulike fosforylerte formene, som foreslått av Xu
et al
. I deres studie, mutasjon av EphrinB1 tyrosinrester resulterer i tap av spesifikk EphrinB1 bånd som tyder på at båndene tydelig ved western blot representerer fosforylerte former av proteinet [36]. Alternativt kan de bandene representerer ikke-glykosylerte eller degradert EphrinB1 som foreslått av Makarov
et al product: [37]. Mens identiteten til disse båndene er udefinert i denne studien, forskjellige EphrinB1 antistoffer bekreftet dets ko-immunoutfelling med ErbB2 (data ikke vist). Viktigere, mens varierende mengder av ErbB2 ble trukket ned på alle lysater ble testet (i samsvar med deres ulike nivåer av ErbB2-ekspresjon), ble en tilsvarende mengde av EphrinB1 knyttet til den. Disse dataene tyder på at det er en grense for hvor mye EphrinB1 som assosieres med ErbB2; mer ErbB2 uttrykk ikke resulterer i økt EphrinB1 forening. Disse data antyder at interaksjonen er strengt regulert.
(A) Western blot-analyse av en human keratinocytt cellelinje, HaCaT-celler (kontroll, så vel som celler slått ned for PTPN13) og brystcancercellelinjer ( MCF7, BT474, HCC1953) immunutfelt (IP) for ErbB2 og immunoblottet (IB) for EphrinB1. Membran ble re-analysert for ErbB2. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B)
En ansikts
confocal bilder av HaCaT celler immunolocalizing overflaten EphrinB (grønn) og total ErbB2 (rød). Kjerner er kontra med DAPI (blå). Scale bar 20 mikrometer. (C) Western blot analyse av brystkreftcellelinjer: T47D, BT474 og MCF7-. (D) HEK293 celler transient transfektert med enten villtype PTPN13 eller C /S PTPN13 mutant analysert ved western blot. (E) HEK293-celler transient transfektert med enten EGFP alene, eller en kombinasjon av EphrinB1, ErbB2 (villtype eller mNeuNT), og PTPN13 (villtype eller C /S mutant) og analysert ved hjelp av western blot. (F)
En face
confocal bilder av celler transfektert i E bearbeidet for immunolocalization av fosforylert EphrinB (grønn) og ErbB2 (rød). Kjerner kontra med DAPI (blå). Scale bar 20 mikrometer.
Co-farging av endogent ErbB2 og endogene, overflate EphrinB i HaCaT celler viser at ErbB2 og EphrinB co-lokalisere på celle-celle veikryss (figur 2B). Surface EphrinB ble lokalisert på reparerte, unpermeabilized celler ved hjelp EphB1-Fc. EphB1-Fc er en kimær bestående av det ekstracellulære område av det EphB1 reseptoren (et beslektet EphrinB reseptor) kondensert til humant IgG
1. Dermed binder EphB1-Fc til overflaten uttrykt EphrinB ligander. Disse interaksjonene er så oppdaget ved hjelp av en anti-human IgG-FITC og celler analysert ved konfokal mikroskopi. Således, mens overflaten farging er ikke spesifikke for EphrinB1alone, vil det tyde på at EphrinB proteiner samtidig lokalisere med ErbB2. Sammen med immunoutfellingsstudier data, disse data tyder på at EphrinB1 assosierer med ErbB2
For å vurdere betydningen av ErbB2 /EphrinB1 samhandling i brystkreft, vi videre analysert: BT474, en Her2 (ErbB2) cellelinje;. T47D, en luminal cellelinje med høy ErbB2 uttrykk; MCF7, en annen luminal cellelinje med lav ErbB2-ekspresjon (figur 1B). Interessant, både T47D og MCF7 celler uttrykker nesten umulig å oppdage PTPN13, mens BT474 celler uttrykker endogen PTPN13 (figur 1B). Immunpresipitasjon for ErbB2 fulgt av western blot analyse for EphrinB1 demonstrerer forbedret EphrinB1 co-IP i T47D celler som korrelerte med høyere nivåer av fosforylert EphrinB1. Dette funnet er i tråd med våre tidligere data som tyder på at fosforylerte EphrinB1 kollegaer lettere med ErbB2. I tillegg T47D-celler demonstrere robust fosforylering av ERK1 /2, som var upåviselig i BT474 og MCF7 celler (figur 2C). Samlet utgjør disse data tyder på at i brystkreftcellelinjer med lav /fraværende PTPN13 uttrykk, og høy ErbB2 uttrykk, er EphrinB1 fosforylering forhøyet så er tilknytningen ErbB2 og korrelerer med forbedret ERK1 /2 fosforylering. Dataene tyder videre på at mangel på virkning på ERK1 /2 fosforylering i shPTPN13 MDA-MB468 celler (figur 1E) kan være på grunn av utilstrekkelig ErbB2-ekspresjon og /eller kompleksdannelse med EphrinB1.
mNeuNT øker kompleksdannelse og signale
Gitt at ErbB2 er en tyrosin kinase og EphrinB1 fosforylering initierer omvendt signalering, vi lurte på om ErbB2 phosphorylates EphrinB1. I tillegg, gitt sin innvirkning på EphrinB1 fosforylering, vi spekulert i at PTPN13 regulerer denne aktiveringen. For å undersøke dette ble både villtype PTPN13 (PTPN13
vektprosent), så vel som en fosfatase null mutant (PTPN13
C /S) testet. I tillegg er våre tidligere funn viser at en konstitutivt aktiv ErbB2 trans mutant (V660E, heretter kalt mNeuNT) synergizes med tap av PTPN13 og øker MAP kinase signal og invasiv vekst, mens villtype (endogen) ErbB2 ikke [23]. Derfor er både mNeuNT og villtype-ErbB2 (wt ErbB2) ble også testet. Gitt deres lav endogen ekspresjon av PTPN13, enkel transfeksjon og robust ekspresjon av transfiserte PTPN13, ble HEK293-celler anvendt for disse studiene (figur 2D). I disse forsøkene HEK293 celler ble transient transfektert med ErbB2 (enten villtype eller mNeuNT), hvete EphrinB1 og PTPN13 (enten villtype eller C /S mutant) og analysert ved western blot.
Kontrolllysatene (EGFP) viser at EphrinB1 co-immunopresipitater med ErbB2 men det EphrinB1 er ikke fosforylert ERK1 og /2 ikke er aktivert (spor 1, figur 2E). Ekspresjon av hverken villtype (felt 2, figur 2E) eller C /S PTPN13 (felt 4, fig 2E) endrer disse parametrene i nærvær av over-uttrykte ErbB2 wt og EphrinB1. I kontrast, øker uttrykk for mNeuNT med EphrinB1 ikke bare mengden av EphrinB1 assosiere med det, men også fører til EphrinB1 og ERK1 /2 fosforylering (baner 3 og 5, figur 2E). HEK293-celler uttrykker endogent små ErbB2 (data ikke vist); i tillegg er anti-ErbB2-antistoffet anvendt for immun utfelling gjenkjenner både villtype-ErbB2 og mNeuNT. Således, mens ko-IP-studier ikke kan skille mellom EphrinB1 assosiert med endogen ErbB2 eller mNeuNT, at dataene understøtter en forening mNeuNT. Mens vi tidligere har demonstrert at mNeuNT ekspresjon alene øker ERK1 /2 fosforylering [23], våre funn at ekspresjon av PTPN13
C /S er ikke i stand til å redusere EphrinB1 og ERK1 /2 phosphoryaltion, antyder at EphrinB1-mediert revers signalisering også bidrar til ERK1 /2 fosforylering (figur 2E, spor 5, piler). I tillegg, ekspresjon av villtype PTPN13 (felt 3, fig 2E), men ikke C /S PTPN13 mutant (felt 5, fig 2F), reduserer mengden av fosforylert EphrinB1 og P-Erk -1/2, også i overensstemmelse med EphrinB1 fosforylering påvirker MAP kinase-signalering.
Disse biokjemiske data ble bekreftet av immunolocalization studier av fosforylert EphrinB (figur 2F, grønn) og ErbB2 (Figur 2F, rød). Bare uttrykk for mNeuNT resultater i fosforylert EphrinB stede på celleoverflaten (figur 2F, paneler 3 og 4, indikerer gul uttrykk samlokalisering av fosforylert EphrinB og ErbB2). Videre har bare villtype PTPN13 reduserer mengden av fosforylert EphrinB på celleoverflaten (figur 2F, sammenlign gul og grønn mellom panelene 3 og 4). Samlet utgjør disse data tyder på at, 1) mNeuNT forbinder med EphrinB1 og denne foreningen er forbedret med EphrinB1 fosforylering, 2) fosforylert EphrinB1 korrelerer med fosforylering av ERK1 /2 og 3) at PTPN13 de-fosforylerer EphrinB1 i denne sammenheng.
mNeuNT co-immunpresipitatene med og aktiverer Src
ErbB2-mediert signalering skjer direkte via sin kinase aktivitet eller ved rekruttering av Src inn en signale kompleks [38]. Videre, etter binding til sin beslektet Ef reseptor, phosphorylates Src EphrinB1 [25]. Siden både villtype-ErbB2 og mNeuNT inneholde et villtype-tyrosin kinase domene, vi antatt at den forbedrede EphrinB1 fosforylering og MAP kinase signale tydelig i sammenheng med redusert /tapt PTPN13, omfatter Src. Derfor må vi først satt ut for å finne ut om Src forbinder med ErbB2, som foreslått av litteraturen [38]. HEK293-celler ble transient transfektert med villtype-ErbB2 eller mNeuNT og testet. Mens co-IP aktivert Src med villtype ErbB2 var nesten umulig å oppdage, aktiveres Src forbundet med mNeuNT (figur 3A). Den anti-aktiverte Src antistoffet gjenkjenner Src tyrosin 416 (pSrc-Y416) når fosforylert, et nettsted som fremmer Src aktivitet [39], [40]. Disse dataene antyder at mNeuNT forbinder med aktivert Src.
(A) HEK293 celler transient transfektert med enten villtype ErbB2 eller mNeuNT og analysert ved western blot. (B) HEK293-celler transient transfektert med en kombinasjon av EphrinB1, mNeuNT, og PTPN13 (villtype eller C /S mutant) ble behandlet med eller uten PP2 og analysert ved western blot. (C) utransfekterte HEK293 celler behandlet med økende doser av saracatinib og analysert ved western blot for ekspresjon av endogent aktivert Src, total Src, fosforylert EphrinB1 og immunopresipitert EphrinB1.
Src formidler EphrinB1 fosforylering
Både mNeuNT og Src er kinaser, som begge kan fosforylerer EphrinB1. I tillegg mNeuNT fortrinnsvis assosierer med aktivt Src (figur 3A). Derfor testet vi om aktivert Src (heller enn mNeuNT) formidler EphrinB1 fosforylering. HEK293-celler ble transient transfektert med mNeuNT, EphrinB1 og enten villtype eller mutant (C /S) PTPN13 og analysert ved hjelp av western blot. I samsvar med ovennevnte data, mNeuNT co-IPS med aktivert Src og EphrinB1 fosforyleres (figur 3B, fil 1); PTPN13
C /S forbedrer EphrinB1 fosforylering (figur 3B, spor 3). For å teste hvilken rolle Src i EphrinB1 fosforylering ble transfektert celler behandlet med PP2, en potent Src-hemmer. Xu
et al
tidligere vist at behandling med en mikrometer PP2 effektivt blokkerer Src-mediert EphrinB1 fosforylering mens behandling med 25 um PP2 resultater i cellen avløsning [36]. Således, i denne studien for å sikre effektiv Src-hemming, ble cellene behandlet med 10 uM PP2 for en kort tid (4 timer). I mNeuNT, EphrinB1 og villtype PTPN13 transfektert lysater, redusert PP2 behandling mengden av aktivert Src forbundet med mNeuNT og demper EphrinB1 fosforylering (figur 3B, spor 2). Lysater av mNeuNT, EphrinB1 og PTPN13
C /S transfekterte celler ble tilsvarende påvirket av PP2 som tyder på at EphrinB1 fosforylering i mNeuNT, Src, PTPN13 kompleks medieres via Src. Samlet utgjør disse data tyder på at Src, snarere enn mNeuNT, phosphorylates EphrinB1 og videre støtter publisert litteratur og våre egne funn som PTPN13 er ansvarlig for de-fosforylering EphrinB1 i dette komplekset.
PP2 er en Src-familie kinase inhibitor, blokkerer aktivering av Lek, Fyn, HCK og Src. I tillegg er de eksperimenter utført ved bruk av PP2 benyttet HEK293-celler overuttrykkende PTPN13, ErbB2 og EphrinB1. Derfor, for å mer selektivt hemme Src og for å teste sin funksjon på fosforylering av endogent EphrinB1, vi også analysert saracatinib (AZD-0530, for tiden i kliniske studier [41] – [44]) på ikke-transfekterte celler. HEK293-celler ble behandlet med saracatinib (0, 0,25 uM eller 1,0 uM) og analysert ved hjelp av western blot. Saracatinib behandling med hell hemmet Src aktivering og en doserespons var tydelig. I tillegg, ved den høyeste dosen, var det en reduksjon i mengden av EphrinB1 fosforylering (figur 3C) var i overensstemmelse med en rolle for Src ved formidling EphrinB1 fosforylering.
EphrinB1 immunpresipitater med ErbB2 på en måte som ikke krever extra eller C-terminal PDZ motiv
Våre data tyder på at reguleringen av ErbB2 /EphrinB1 kompleks kan megle signaler viktige i brystkreft. Gitt at ErbB2 og EphrinB1 samhandle, kan begrunnelsen utforming av lavmolekylære inhibitorer for å blokkere deres tilknytning være av terapeutisk verdi. Dermed ble ErbB2 og EphrinB1 mutanter genereres for å definere domener nødvendig og tilstrekkelig for deres tilknytning.
ErbB2 inneholder to store ekstracellulære domener som vi utpekt ligandbindende domener 1 og 2. ErbB2 ekstracellulære mutanter slettet av enten ligandbindende domene 1 (Δ 1-174 LBD1) eller begge domenene 1 og 2 (Δ 1-487 LBD2) ble generert. ErbB2 er PDZ bindende domenet ble slettet i en tredje mutant (Δ 1251-1255 PDZBD) (figur 4A). Alle ErbB2-mutanter, herunder full lengde villtype-proteinet, ble HA kodet ved N-terminusen. Konstruksjonene ble transfektert inn HEK293 celler og analysert for tap av co-IP med endogen EphrinB1.
