Abstract
Innhente rikelig og høy renhet kreft stamceller (cscs) er en viktig forutsetning for CSC forskning. I dag, forskere vanligvis få høy renhet cscs gjennom flowcytometri sortering og utvide dem ved kortsiktig sfære kultur. Men det er fortsatt usikkert om vi kan forsterke høy renhet cscs gjennom langsiktig sfære kultur. Vi har foreslått en matematisk modell ved hjelp av ordinære differensialligninger for å utlede den kontinuerlige variasjon av CSC-forholdet i langtidskultur sfære og beregnede modellparameterne basert på en langsiktig sfære kultur av MCF-7 stamceller. Vi fant at den CSC-forholdet i langtidskultur sfære presentert som gradvis redusert drift, og kan være stabile ved et lavere nivå. Videre fant vi at utstyrt modell parametere kan forklare de viktigste vekstmønster av cscs og differensierte kreftceller i langsiktig sfære kultur
Citation. Peng T, Tsinghua M, Zhenning T, Kaifa W jr J ( 2011) Long-Term Sphere Kultur kan ikke opprettholde en høy andel av kreftstamceller: en matematisk modell og eksperiment. PLoS ONE 6 (11): e25518. doi: 10,1371 /journal.pone.0025518
Redaktør: Sui Huang, Institute for Systems Biology, USA
mottatt: 1 april 2011; Godkjent: 07.09.2011; Publisert: 16.11.2011
Copyright: © 2011 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet av National Natural Science Fund av folke~~POS=TRUNC Kina (nr. 30872517). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i det siste tiåret, mer og mer bevis har vist at svulster stammer fra en undergruppe av celler som har selvfornyende og retninger differensiering evne, heter kreft stamceller (cscs) eller tumor initiere celler (tics) [ ,,,0],1] – [3]. Videre cscs har blitt bekreftet å være opprinnelsen til kreft tilbakefall og metastase [4] – [6]. Derfor har forskning på cscs bli et samlingspunkt for kreftforskning.
Anskaffelse rikelig med høy renhet cscs er en viktig forutsetning for CSC forskning. I 2003, Al-Hajj et al. først rapportert at bare en liten gruppe av brystkreftceller som har en CD44
+ CD24
– /lav fenotype har evnen til å opprettholde tumordannelse [7]. Dermed kan høy renhet cscs fås gjennom flowcytometri sortering. Likevel, den lave andelen cscs blant kreftceller betyr at vi knapt kan få nok cscs for videre eksperimenter umiddelbart etter flowcytometri sortering. Dario Ponti et al. vist at brystkreft celler kan danne mammospheres når de dyrkes uten serum i ikke-festede retter og at denne metoden kan berike CD44
+ CD24
– /lav brystkreft cscs [8]. Videre glioma, tykktarmskreft og andre typer cscs har blitt dyrket ved hjelp av samme metode. Derfor cscs har blitt utvidet gjennom sfære kultur [9] – [12]. Men om langtids sfære kultur kan opprettholde et høyt forhold mellom cscs er uklar.
symmetriske og asymmetriske fordeling er to typer vekstmønstre for cscs [13], [14]. En CSC kan dele inn i enten to identiske cscs gjennom symmetrisk divisjon eller en CSC og en differensiert kreftcelle gjennom asymmetrisk divisjon. Videre kan differensierte kreftceller forvandle seg cscs gjennom epitel-mesenchymale overgang (EMT) [15]. I mellomtiden vil differensierte kreftceller blandet med cscs fra flowcytometri sortering og avledet fra asymmetrisk divisjon også sprer når de dyrkes. Likevel er påvirket av de nevnte prosesser på CSC-forholdet i suspensjon kultur uten serum ukjent.
For å forutsi kontinuerlig variasjon av CSC forholdet i langsiktig sfære kultur, må vi først foreslått en kinetisk modell ved hjelp av ordinære differensial ligninger som anses som den symmetriske og asymmetriske fordeling av cscs, i tillegg til spredning og transformasjon av differensierte kreftceller. Den teoretiske analysen viste at det ville være en stabil forholdet mellom cscs i et langsiktig sfære kultur avhengig av modell parametere og innledende forholdet mellom cscs. For å underbygge vår teoretiske resultat vi utviklet en langsiktig sfære kultur av menneskelig brystkreft MCF-7 stamceller. Basert på eksperimentelle data, ved bruk av en adaptiv Metropolis-Hastings (M-H) algoritme for å gjennomføre en omfattende Markov-kjede Monte-Carlo (MCMC) simulering, vi oppnådd de anslåtte parameterverdier. Ifølge de numeriske simuleringer basert på eksperimentelle data, fant vi ut at den observerte andelen cscs kan bli fanget av vår modell, og at de monterte parametrene hadde eksperimentell betydning.
Materialer og metoder
Modell Beskrivelse
La og betegne populasjonsstørrelser cscs og differensierte kreftceller ved
i langsiktig sfære kultur, henholdsvis. På grunn av at cellene er dyrket på et ikke-klebende fatet og det er tilstrekkelig med næringsstoffer i denne kunstig miljø, kan vi anta at endringene observert i løpet av et kort tidsintervall, si i lengde, er proporsjonale med de populasjonsstørrelse, det vil si, hvor konstantene blir kalt netto fødselsraten eller iboende vekst på befolkningen henholdsvis. Vi ser og som en jevn funksjon av. Deretter dele og formidle til grensen gir følgende differensialligninger:
Fordi vekstmønster av cscs inkluderer symmetrisk og asymmetrisk divisjon [13], [14] og fordi differensierte kreftceller kan forvandle seg til cscs gjennom visse modaliteter , slik som EMT [15], noe differensierte kreftceller og cscs vil oppstå i løpet av spredning av cscs og differensierte kreftceller, respektivt. For å forenkle modellen, definerer vi den asymmetriske fordeling prosessen som en CSC deler seg i en CSC og en differensiert kreftcelle som at den CSC første deler symmetrisk i to cscs og deretter en av dem om til en differensiert kreftcelle. Tar som konverteringsfrekvensen fra cscs til differensierte kreftceller i ferd med CSC spredning og som konverteringsfrekvensen fra differensierte kreftceller til cscs i ferd med spredning av differensierte kreftceller, kan vi bruke følgende matematisk modell for å beskrive interaktiv vekst av cscs og differensierte kreftceller i et langsiktig kuler kultur: (1) der og, og alle parametere er ikke-negative konstanter
Eksperimentell Prosedyre
Cell kultur
Menneskelig brystkreft MCF-7 celler (fra Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences) ble dyrket adherently med DMEM medium (Hyclone), 10% føtalt kalveserum (Hyclone) og 100 U /ml penicillin-streptomycin løsning A. CD44
+ CD24
– /lave cscs fra MCF-7 celler ble oppnådd ved flowcytometri sortering og ble inokulert med 1000 celler /ml i en stamcelle kultursystem for å danne mammospheres som beskrevet tidligere [8]. I ikke-adherente retter, cscs ble dyrket i suspensjon ved anvendelse av serum-fritt DMEM-F12-medium (01:01, Hyclone) supplert med 20 ng /ml EGF (BD Biosciences), 20 ng /ml bFGF (BD Biosciences), 4 mg /ml B27 (Invitrogen) og 100 U /ml penicillin-streptomycin-løsning A. mammospheres ble dissosiert hver 10-12 dager ved enzymatisk spalting med 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning (Invitrogen) ved 37 ° C i 3 minutter og mekanisk spredning. Enkeltceller ble løslatt ved forsiktig pipettering og filtrert gjennom en 70 mikrometer celle sil. Cellesuspensjonen ble sentrifugert ved 500 g i 3 min. Etter supernatanten kastet, ble enkeltceller inokulert med 1000 celler /ml og dyrket for å danne mammospheres i de nevnte forhold.
Flowcytometri.
Flowcytometri sortering og testing ble utført ved hjelp av BD FACSAria II FACS sorter (BD Biosciences) for å plukke ut CD44
+ CD24
– /lav cscs fra MCF-7 heftende celler og detektere CD44
+ CD24
– /lav CSC forholdet i mammospheres. Adherente celler eller mammospheres ble dissosiert enzymatisk og mekanisk som nevnte og filtrert gjennom en 40 um sikt for å lage enkeltcelle-suspensjon. Deretter, i det minste 1 x 10
5-celler ble sentrifugert ved 500 g i 3 min ved 4 ° C, resuspendert i 10 pl av PE-konjugert anti-CD44 (BD Biosciences) og 10 ul av FITC-konjugert anti-CD24 (BD Biosciences) og deretter inkubert ved 4 ° C i mørke i 30 minutter. I mellomtiden ble cellene inkubert med henholdsvis isotype av CD44 og CD24 som negativ kontroll, og PE-konjugert anti-CD44 eller FITC-konjugert anti-CD24 som enkelt positiv kontroll, respektivt. De merkede cellene ble vasket 3 ganger og deretter analysert ved hjelp av FACS-sorter. Hver analyse oppdaget 10.000 celler.
Resultater
Teoretisk analyse av modell (1)
I matematikk, Laplacetransformasjonen er en lineær operator av en funksjon med en ekte argument ( ), og det kan forandre til en funksjon med en kompleks argument, som er definert som. Den inverse Laplacetransformasjonen er gitt av komplekse integrert, der er et reelt tall slik at konturen banen for integrering er i regionen konvergens av. Siden Laplace trans har den nyttige egenskap at mange forhold og operasjoner i løpet av de originaler som svarer til enklere forbindelser og operasjoner i løpet av de bilder, kan den brukes til å løse differensial- og integralligninger. La. Laplace-transformasjonen av differensialligninger (1) er (2) Fra disse ligningene (2) etter noen beregninger, vi obtainwhere er de virkelige røttene av den kvadratiske ligningen for en variabel.
ta den inverse trans av fører til (3) som er løsningene for modellen (1).
Legg merke til det og. Vi kan obtainwhich betyr at andelen av cscs i en langvarig sfære kultur tendens til å være en stabil størrelse. Merk thatUsing (3), har vi (4) og (5) På grunn (4) er enklere enn, vil vi bruke (4) for å estimere modellparametere.
Det er verdt å merke seg at vi kan få steady-state av forholdet ved en enkel algebra metode. Men ved hjelp av algebra metoden, vi kan ikke utlede eksplisitte modellparametrene til vår kunnskap (se vedlegg S1). Dermed har vi fortsatt bruke Laplace transformasjon her for å gjøre hele papiret virker mer konkordant.
Forsøksresultater
CSC forholdet i MCF-7 brystkreft celler var 1,8% (figur 1A), som er i samsvar med den forrige rapporten [16]. Etter strømningscytometri sortering, ble en post-slag-analyse utført for å bestemme renheten av de sorterte cellepopulasjoner. Høy renhet CD44
+ CD24
– /lav cscs hvis forholdet var så høy som 96,2% ble oppnådd (figur 1B). CD44
+ CD24
– /lave cscs fra MCF-7 celler eller enkeltceller fra mammospheres dannet kompakte kuler innen 10-12 dager i suspensjon kultur uten serum. Men sammen med den langsiktige sfære kultur behandling, de observerte CSC prosenter i mammospheres presentert som gradvis redusert drift (figur 1B-G og tabell 1) og til slutt stabilisert seg rundt 1,5%.
(A) CSC forholdet i MCF-7-celler dyrket med serum. (B) Renheten av sortert CSC populasjoner oppdaget etter flowcytometri sortering umiddelbart. (C-G) CSC forholdet i mammospheres dyrket i 52, 84, 117, 150 og 160 dager, henholdsvis.
Modellbasert Estimater
For å beregne prosent~~POS=TRUNC av cscs (tabell 1), ser vi først fastslått at forholdet mellom differensierte kreftceller til å cscs (tabell 1). For å estimere og ansatt vi en adaptiv Metropolis-Hastings (MH) algoritme for å gjennomføre et omfattende Markov-kjede Monte-Carlo (MCMC) simulering (figur 2) beskrevet tidligere [17], [18] og fått de stabile verdier for fire parametere (,,,). Dermed kan vi konkludere med at den iboende vekstrater cscs og differensierte kreftceller er og, henholdsvis, og konverteringsfrekvensene fra cscs til differensierte kreftceller og fra differensierte kreftceller til cscs er og Henholdsvis.
( A) Random serien; (B) histogram. Algoritmen kjørte for 10.000 gjentakelser med en burn-in på 3000 iterasjoner. De første forholdene var
og Selge.
Ved hjelp av de estimerte verdiene, vi plottet beste løsningen ved å tilpasse til de eksperimentelle data (figur 3A). Videre plottet vi den langsiktige utviklingen av, noe som viste at forholdet mellom differensierte kreftceller til cscs vil stabilisere seg rundt 71 etter 200 dager (Figur 3B). Dette betyr at andelen av cscs vil ha en tendens til å være 1,4%.
(A) den beste tilpasning av de eksperimentelle data. (B) Den langsiktige trenden med.
Sensitivity Analysis
Vi brukte lokale følsomhetskoeffisienter (LSC) for å måle følsomhet av parametere, inkludert, og. Som rapportert tidligere [19], [20], vet vi at LSC er definert som graden av variasjon i utformingen funksjonen under små forandringer i hver utforming variabel, noe som kan beregnes ved: (6) Fordi hver parameter har forskjellige dimensjoner å sammenligne følsomhetskoeffisientene for hver parameter, vi standardisere (6) aswhere er endringen rekke parameter.
Ta summen av kvadratene av avvikene (SSD) som design funksjon og øke eller redusere 1% , 2%, 3%, 4% og 5% av hver parameter, vi oppnådd tilsvarende LSCs. Siden det var en LSC etter hver endring av parameteren, var det ti LSCs for hver parameter. Følgelig ble gjennomsnitt og standardavvik for LSCs beregnet for hver parameter (figur 4). Enveis ANOVA ble anvendt for å sammenligne forskjellene, og Tamhane s T2 test ble brukt for multiple sammenligninger på grunn av ulik varians. Vi vet at midlene (716.5037 ± 528.0119) og (925.3620 ± 688.3240) er betydelig større enn de (73,4361 ± 4,8421) og (75,3665 ± 13,7670). Fordi en større følsomhetskoeffisienten tilsvarer en høyere grad av følsomhet, kan vi konkludere med at, og den iboende vekstrater på cscs og differensierte kreftceller, henholdsvis, er de viktige parametre for stabil andel av cscs i et langsiktig sfære kultur.
Diskusjoner
Selv om forskerne vanligvis få høy renhet cscs gjennom flowcytometri sortering og utvide dem på kort sikt ved sfære kultur i et ikke-klebende miljø uten serum [21], den vekst mønstre av cscs og differensierte kreftceller i langsiktig sfære kultur i denne tilstanden er ikke klart. Om vi kan få rikelig med høy renhet cscs gjennom denne metoden er også usikkert. I dette prosjektet har vi først foreslått en matematisk modell for å utlede kontinuerlig variasjon av CSC forholdet i langsiktig sfære kultur. For å estimere modellparametrene, vi deretter utviklet en langsiktig sfære kultur for brystkreft MCF-7 stamceller, ettersom MCF-7 cellelinjen fulgte CSC-modellen og dens CSC markør, CD44
+ CD24
– /lav, ble generelt bekreftet og lett detektert ved strømningscytometri [7] – [8], [22]. Fra eksperimentresultater og numeriske simuleringer, fant vi at forholdet mellom cscs i langsiktig sfære kultur presenteres som gradvis redusert drift og kan være stabil på et lavere nivå. Videre i sammenheng med modell og eksperimentdata, fant vi at utstyrt modell parametere kan forklare den viktigste vekstprosessen cscs og differensierte kreftceller i sfære kultur.
Fra de monterte parametrene i modellen vår, må vi først lagt merke til at den indre veksten av differensierte kreftceller er større enn den iboende veksten av cscs, noe som betyr at selv om dyrket i et ikke-klebende miljø uten serum differensierte kreftceller vil også spre seg og deres vekst hastighet er noe raskere enn for cscs. Ikke desto mindre er forskjellen mellom deres sprednings priser når dyrket i denne tilstand er meget mindre enn i vedheftende kultur. Dette er den viktigste årsaken til vedvarende avtagende forholdet mellom cscs. I mellomtiden, kan dette resultat og den progressive økning i forholdet av differensierte kreftceller også forklare hvorfor den proliferative aktivitet av kulene øker til meget sene subdyrking faser sammenlignet med tidligere passeringer [23]. I mellomtiden, den iboende vekst på cscs, er ca 20 ganger større enn konverteringsfrekvensen fra cscs til differensierte kreftceller, som tyder på at i denne kulturen tilstanden hoved spredning mønster av cscs er symmetrisk divisjon i stedet for asymmetrisk divisjon eller differensiering på en tilhenger kultur miljø med serum [8] – [10], [23]. Dette resultat fører til et høyere forhold av cscs for en komparativ lang tid i denne kulturen. Videre, fordi konverteringsfrekvens på cscs til differensierte kreftceller, er nesten 10 ganger større enn konverteringsfrekvensen av differensierte kreftceller til cscs, betyr dette at den asymmetriske delingen av cscs er større enn transformasjon av differensierte kreftceller til cscs i denne kulturen tilstand, som også støtter den lave andelen cscs på lang sikt sfære kultur. I tillegg, selv om omdannelsen frekvensen av differensierte kreftceller til cscs, er liten, betegner dens eksistens som i denne kulturen tilstand differensierte kreftceller fremdeles kan spontant konvertere til cscs, som er forenlig med de tidligere forsøksresultater [24], og kan bli en viktig grunn til at sfære kultur kan berike cscs [8].
fra vår forskning, inkludert de eksperimentelle data og teoretisk analyse av den matematiske modellen, fant vi at selv om cscs var bare dyrket i et ikke-klebende miljø uten serum det var en drift av CSC tilstand mot en tilsynelatende likevektstilstand i hvilken det var færre enn cscs ved poding. Dette resultatet kan være ett tegn på ikke-genetisk heterogenitet i tumorer fordi det ikke var noen kunstig genetisk endring i hele kulturen prosessen [25]. For å få rikelig med høy renhet cscs av sfære kultur basert på uttrykk for en begrensende forhold av differensierte kreftceller og cscs i (5), foreslår vi følgende reguleringer: skaffe en høyest startforhold på cscs, hemmer differensiering eller asymmetrisk divisjon av cscs og fremme omdannelsen av differensierte celler til kreft cscs, for eksempel ved dyrking med TGF-β å øke EMT [15], [26].
Merk at parametrene estimeringen i denne matematiske modellen ble bare basert på vår eksperimentelle data testing brystkreft cellelinje MCF-7 cscs, som ble dyrket som mammospheres. Således, selv om modellen kan være anvendelig for å forutsi den kontinuerlige variasjon av CSC-forhold i nesten alle slags fast tumor CSC sfære kultur, parametrene kan ikke anvendes i stor utstrekning på grunn av de forskjellige egenskapene hos forskjellige tumorer. I mellomtiden denne forskningen diskutert bare prosessen med dyrking av høy renhet cscs som kuler. Imidlertid kan prosedyren for berikende cscs av kuler kultur være annerledes. I en annen fremgangsmåte, vil en stor mengde av differensierte kreftceller gjennomgår apoptose i de tidlige stadier på grunn av mistilpasning i suspensjonskultur tilstand. Likevel, i vår tilstand, tilpasning til suspensjon kultur miljø kan være grunnen til at differensierte kreftceller øker gradvis [22]. Derfor ville de parametere som beskriver cscs berikelse prosessen også være tydelig i forhold til dette papiret. Videre, selv om vår forenklet modell var gyldig til fange vekst og overgang mønster av cscs kultur (dvs., avslører den mekanisme av strukturell heterogenitet av kreftceller), mer komplisert dynamisk system (f.eks celle nummer /tetthet avhengig vekst og konverteringsfrekvens) kan være mulig å tilpasse disse nyeste funn av cscs [24], [27] – [28]. Vi ønsker å studere disse parametrene og alternative modeller videre i det videre arbeidet.
Hjelpemiddel Informasjon
Vedlegg S1.
Uttalelser av algebra metode for å beregne steady-stete av forholdet.
doi: 10,1371 /journal.pone.0025518.s001 plakater (DOC)
Takk
Vi er svært takknemlig til to anonyme dommere og den faglige redaktør for grundig lesning og verdifull kommentarer som førte til forbedring av vår opprinnelige manuskriptet. Forfatterne ønsker å takke Zhao Bin (førsteamanuensis, engelsk redaktør av kinesisk Journal of Breast Disease), Yu Shicang og Wang bin (MD av Institute of Pathology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Kina) for kritisk lesing av manuskript og ber gi verdifulle råd.
