Abstract
Wogonin er en plante monoflavonoid som er blitt rapportert å hemme cellevekst og /eller indusere apoptose i forskjellige tumorer. Den foreliggende studien undersøkte apoptose-induserende aktivitet og underliggende virkningsmekanismen av wogonin i A549-celler. Resultatene viste at wogonin var en potent inhibitor av levedyktigheten til A549-celler. Apoptotisk proteinendringer detektert etter eksponering for wogonin omfattet redusert XIAP og Mcl-1-ekspresjon, økt spaltet PARP-ekspresjon og økt frigivelse av AIF og cytotchrome C. Western blot-analyse viste at aktiviteten til c-Myc /Skp2 og HDAC1 /HDAC2 trasé, som spiller viktige roller i tumor fremgang, ble redusert. Kvantitativ PCR identifiserte økte nivåer av c-myc mRNA og reduserte nivåer av proteinet. Protein nivåer av Fbw7α, GSK3p og Thr58-Myc, som er involvert i c-myc ubiquitin-avhengige nedbrytning, ble også analysert. Etter eksponering for wogonin, Fbw7α og GSK3p uttrykk redusert og Thr58-Myc uttrykk økt. Imidlertid MG132 var ute av stand til å forhindre c-Myc degradering. De foreliggende resultatene tyder på at wogonin har flere anti-kreft effekter knyttet til nedbrytning av c-myc, SKP2, HDAC1 og HDAC2. Dens evne til å indusere apoptose uavhengig av Fbw7α antyder en mulig bruk i legemiddelresistens kreft relatert til Fbw7 mangel. Videre studier er nødvendig for å finne ut hvilke veier er relatert til c-myc og Fbw7α reversering og om Thr58 fosforylering av c-myc er avhengig GSK3p
Citation. Chen XM, Bai Y, Zhong Yj, Xie Xl, Long Hw, Yang åå, et al. (2013) Wogonin har flere Anti-kreft effekt ved å regulere c-myc /SKP2 /Fbw7α og HDAC1 /HDAC2 Pathways og Induksjon apoptose i Human Lung Adenocarcinoma cellelinje A549. PLoS ONE 8 (11): e79201. doi: 10,1371 /journal.pone.0079201
Redaktør: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina
mottatt: 23 januar 2013; Godkjent: 20 september 2013; Publisert: 12.11.2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi i Guizhou-provinsen, Kina ([2012] 7006 og NY [2011] 3072); Guangzhou Medical College (2012C16); Stiftelsen for Unge Forskere i Guangzhou Educational Committee (2012C118). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for det store antallet kliniske studier som tar sikte på å bedre pasientens overlevelse, forblir lungekreft en ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet over hele verden i både menn og kvinner. Omtrent 85% av alle lungekreft tilfellene er kategorisert som ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som vanligvis diagnostisert ved avanserte stadier [1]. Lunge adenokarsinom, den dominerende histologisk subtype av NSCLC, står for 20-30% av primære lunge krefttilfeller blant pasientene under 45 år, uavhengig av røyking historie [2]. De fleste tilfeller av NSCLC er uegnet for kirurgi og kjemoterapi forblir hjørnesteinen i behandling ved avansert sykdom.
Histone deacetylases (HDACs) er enzymer som fjerner histone acetylering produkter. Denne prosessen komprimerer strukturen av kromatin og undertrykker transkripsjon [3]. HDACs virker på forskjellige nonhistone proteinsubstrater som spiller en rolle i reguleringen av genekspresjon, celleproliferasjon, cellemigrering, celledød og angiogenese [4]. Data fra prekliniske studier har vist at naturlig forekommende og syntetiske histondeacetylase hemmere har potent anticancer aktivitet.
HDAC1 og HDAC2 tilhører klasse I histondeacetylase (HDAC) familie. In vivo disse enzymene danne komplekser med Sin3, Nurd og Co-REST [5]. HDAC1 og HDAC2 også binde seg direkte til DNA-bindende proteiner, slik som YY1, Rb-bindende protein-1 og Sp1 [5].
c-Myc er en transkripsjonsfaktor som er ansvarlig for å regulere en rekke gener som er involvert i cellulær proliferasjon, vekst, differensiering og apoptose [6]. Deregulert c-myc uttrykk er observert hos omtrent 70% av alle humane tumorer [10]. c-Myc ekspresjon er regulert av gentranskripsjon, og er avhengig av mRNA stabilitet og posttranslational kontroll av proteinstabilitet [7] -. [9]
posttranslational regulering av c-Myc kan være mediert av Skp2 (S- fase kinase-assosiert protein 2) og Fbw7 (F-boks og WD gjenta domene-inneholdende 7) [11]. Skp2 og Fbw7 er to forskjellige anerkjennelse subenheter av SCF-type E3 ligase (SCF, Skp1 /Cullin /F-box protein komplekser) som gjenkjenner spesifikke substrater for proteasomal degradering. Regulering av c-myc innebærer fosforylering av c-myc på Thr58, noe som resulterer i Fbw7-mediert proteasomal degradering. Glykogensyntasekinase 3β (GSK3P) er den eneste kinase er kjent for å fosforylere c-Myc ved Thr58 [24].
Skp2 er et lovende mål for begrensning av kreft stamcelle og progresjon av kreft [12], er det overekspresjon er ofte observert i human cancer, og det kan derfor virke som et onkogen. Til støtte for denne hypotesen, er Skp2 blitt vist å gjenkjenne Cyclin-avhengig kinase (Cdk) inhibitorer og tumorundertrykkende proteiner slik som P27 Kip1 (Cyclin-avhengig kinase inhibitor 1B), p57 Kip2 (Cyclin-avhengig kinase inhibitor 1C), p130 ( 130 kDa retinoblastom-assosiert protein) og Tob1 (transducer av erbB-2-en), men ikke c-Myc [13] – [16]. Skp2-formidlet dannelse av ubiquitin fra c-Myc forekommer uavhengig av fosforylering [25].
Fbw7 mangel er antatt å være involvert i legemiddelresistens i humane cancere [22], [23]. Det har blitt vist å bli inaktivert ved mutasjon, delesjon, eller promoter hypermethylation i brystkreft [17], [18], tykktarmskreft [19], [20], og leukemi [21]. Fbw7 uttrykkes som tre forskjellige isoformer (betegnet α, β, og y) er anbragt i den α-kjerne, β-cytoplasma, og γ-kjerne [26], [27]. Så det er ingen antistoffer for disse tre isoformer vi brukte best beskrives og lengste av de tre isoformer Fbw7α, i våre eksperimenter med wogonin.
Wogonin (5, 7-dihydroksy-8-methoxyflavanon) er en naturlig monoflavonoid hentet fra
Scutellaria baicalensis
radix [28] som har blitt anerkjent som en kreft narkotika kandidat med potensielt lav toksisitet [29]. Anticancer aktivitet av wogonin er rapportert forskjellige humane cellelinjer inkludert myelomcellelinje RPMI 8226 [30], leverkreft SK-HEP-1 [31] og SMMC-7721 [32], gliom kreftceller [33], nasofaryngeal karsinom celler [ ,,,0],34], humane brystcancerceller [35], [36] og human cervical carcinoma HeLa-celler [37]. Dens aktivitet er mediert ved induksjon av apoptose og celledifferensiering, og blir regulert av en rekke gener og proteiner [38] – [41]
I denne studien evaluerte vi virkningen av wogonin for celleviabilitet og apoptose. i den menneskelige lunge adenokarsinom epitelial cellelinje A549. Vi vurderte også regulering og funksjon av c-myc /Skp2 /Fbw7α og HDAC1 /HDAC2 trasé involvert i sin apoptotisk effekt.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
Wogonin ble kjøpt fra Guangzhou IDC (Kina) og MG132 (karbobenzoksy-Leu-Leu-leucinal) ble oppnådd fra (Beyotime, Kina). De følgende antistoffer ble anvendt: Fbw7 (Cdc4, H-300) og p-c-Myc (Thr 58) (Santa Cruz, USA); c-myc, GSK3p, AIF (apoptose induserende faktor, Proteintech Group, Inc., USA); HDAC1, HDAC2, Skp2, Survivin, BCL-2 (B-cellelymfom 2), β-Actin (BOOSTER, Kina); MCL-1 (myeloid leukemi celle-sekvens 1), XIAP (X-bundet inhibitor av apoptose protein, BIOSs, Kina); Cytochome c (keygen, Kina); PARP (poly ADP-ribose polymerase, Sino Biological Inc., Kina).
Cell Culture
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinje A549 ble hentet fra Cell Bank of Animal Experiment Center, North skole Region, Sun Yat-Sen University. Cellene som brukes i forsøkene ble opprettholdt i vårt laboratorium i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (Sijiqing, Kina) ved 37 ° C og 5% CO
2.
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid ( MTT) Celle Vaibility Assay
cellene høstet med trypsin ble sådd på 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 per brønn. Etter inkubering over natten, ble kulturmediet fjernet, og cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av wogonin. Etter eksponering til wogonin for 24, 48 eller 72 timer ble cellene inkubert med MTT ved 37 ° C i ytterligere 4 timer. Dette tillot mitokondriell dehydrogenase å konvertere MTT inn uløselige formazankrystaller. Dyrkningsmediet ble deretter kastet, og 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt til hver brønn for å oppløse de formazankrystaller. Absorpsjonen av oppløste formazanforbindelsen ble målt ved 490 nm ved hjelp av en EL340 mikroplateleser (Bio-Tek. Instrumenter, Winooske, VT).
Nuclear Farging
A549 celler ble farget med en DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindole) farging kit (keygen, Kina). Etter eksponering for graderte konsentrasjoner av wogonin i 48 timer ble cellene vasket og inkubert med en DAPI arbeidsløsning (1-2 ug /ml) i 15 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter skylt med metanol og buffer A (60% glycerol i 10 mM fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,6)) ble tilsatt til suspensjonen. A549 celler ble sett ved hjelp av en Eclipse Ti Nikon mikroskop (Nikon, Japan).
Mitokondriell membranpotensialet
mitokondriemembranen potensial (Δψm) av A549 celler ble målt usimg en fluoriserende, lipofilt, kationiske sonde, JC-1 (Beyotime, Kina), i henhold til produsentens anvisninger. I korthet ble cellene eksponert for wogonin inkubert med 1X JC-1-fargeløsning i 20 minutter ved 37 ° C. De ble deretter skylt to ganger med JC-1 flekker buffer og bildene ble tatt med en Eclipse Ti Nikon mikroskop (Nikon, Japan).
apoptose analysen
Celler ble merket med FITC-merket Annexin V og propidiumjodid (PI) ved hjelp av en Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit (keygen Biotech, Kina), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, etter 48 timers eksponering for forskjellige konsentrasjoner av wogonin ble cellene vasket med kald PBS og resuspendert i 1 x bindingsbuffer. Alikvoter av 10
5-celler ble blandet med 5 ul av Annexin V-FITC og 5 ul av PI i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Fluorescens (530 nm) ble oppdaget av flowcytometri (FACS Aria, BD Biosciences, USA) innen en time.
Real-time PCR-analyse
Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp av en SYBR Grønn journalist. A549-celler eksponert for wogonin ble vasket med PBS og total RNA ble renset ved hjelp av RNAiso Plus (TAKARA, Japan). Den resulterende RNA ble først revers transkribert til cDNA ved hjelp av en PrimeScript® RT Master Mix kit (TAKARA, Japan). Genspesifikke primere ble kombinert med SYBR® Premiks Ex Taq ™ (TAKARA, Japan) og amplifisert ved bruk av en ABI 7500 real-time PCR maskin (Applied Biosystems, USA). Alle qPCR reaksjoner ble utført uavhengig på fem prøver. Den relative mRNA uttrykket ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Primersekvensene som brukes er oppført i tabell 1.
Western Blot analyse
Celler ble vasket med PBS ble lysert med RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, natriumortovanadat, natriumfluorid, EDTA og leupeptin, (Beyotime, Kina) supplert med protease inhibitor PMSF (Beyotime, Kina). cytoplasmatiske proteiner ble ekstrahert ved anvendelse av en kjernefysisk og cytoplasmatisk Protein utvinning Kit (keygen Biotech, Kina).
Den løselige proteinkonsentrasjonen ble bestemt med en BCA protein assay kit (Beyotime, Kina). celle~~POS=TRUNC ble kokt i 5 min i lasting buffer og separert på en SDS PAGE-gel. Etter elektroforese ble proteinene overført til en PVDF-membran (Millipore, USA). membranene ble blokkert med fettfri melk, probet med forskjellige primære antistoffer og HRP-konjugerte sekundære antistoffer, og visualisert med forbedret Chemiluminescence (ECL) påvisningsreagenser (Beyotime, Kina).
Statistical Analysis
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 17,0 programvare. Resultatene er uttrykt som middelverdier og standardfeil (gjennomsnitt ± SEM) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans mellom gruppene. Verdier for P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Wogonin hemmer Cell Livskraftig og induserer Cell apoptose
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av en MTT-analyse i forbindelse med DAPI farging. og flowcytometrisk analyse etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av wogonin. MTT-analyse indikerte at wogonin inhiberte cellelevedyktighet i en doseavhengig og tidsavhengig måte (fig. 1B). (Fig. 1C). Dette ble bekreftet av resultatene av flowcytometrisk analyse ved hjelp AnnexinV-PI
(A) Kjemisk struktur av wogonin (C
16H
12o
5, MW: 284,27 ). (B) Cellenes levedyktighet ble analysert ved anvendelse av MTT-analysen. Celler ble inkubert med wogonin i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Stolpene representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 3). (C) Apoptose vurderes av Annexin V /PI farging i A549-celler. Celler ble inkubert med wogonin i konsentrasjoner på 0, 15, 25, 35 ug /ml, i 24 timer, 48 timer og 72 timer. (D) Nuclei farget av DAPI og observert av fluorescens mikroskop. Apoptotiske celler er angitt med piler. *
P
0,05 vs kontrollgruppe, **
P
0,01 vs kontrollgruppe
Sammenlignet med kontrollgruppen, frekvensen av begge. tidlig og sent stadium apoptose øket etter eksponering for alle konsentrasjoner av wogonin. Den totale apoptose grad overstiger 50% i 35 ug /ml-gruppen.
DAPI-farging (fig. 1D), identifiserte kondenseres og spaltes kjerner i celler eksponert for 35 ug /ml wogonin, mens kun klare atomkjerner med blek blå farging ble observert i kontrollgruppen.
Som vist i fig. 2A, Wogonin ble forbundet med en doseavhengig reduksjon i mitokondriene potensial (Δψm) som resulterte i redusert rød fluorescens (JC-1-polymer) og øket av grønn fluorescens (JC-1 monomer). Dette kan ha vært knyttet til nedregulering av Mcl-en så det var ingen åpenbare nedgang i BCL-2 nivåer. Wogonin også fremmet utgivelsen av AIF og cytokrom C inn i cytoplasma gir ytterligere bevis av mitokondrieskade (Fig. 2C). Nedregulering av XIAP, Survivin, og av spaltede fragmenter fra PARP indikerte at fremgangsmåten apoptose fortsatte etter mitokondrier skade (fig. 2B).
(A) Analyse av mitokondriemembranpotensialet (ΔΨm) ved hjelp JC -1 farging etter eksponering for wogonin i 48 timer. En fluorescens mikroskop ble anvendt for å visualisere resultatene. Mitokondriell depolarisasjon ble indikert ved en økning i grønn fluorescens og en reduksjon i antallet røde fluorescens intensitet. (B) Protein nivåer av BCL-2, Mcl-en, XIAP, Survivin og PARP analysert ved western blot. (C) cytoplasmatiske proteiner ble ekstrahert for western blot-analyse av frigjort cytokrom c og AIF. I disse eksperimentene, ble cellene eksponert for wogonin 0, 15, 25, 35 ug /ml i 48 timer. *
P
0,05 vs kontrollgruppe, **
P
. 0,01 vs kontrollgruppe
Wogonin nedregulerer HDAC1 og HDAC2 både mRNA og proteinnivåer
Protein nivåer av HDAC1 og HDAC2 ble nedregulert på en doseavhengig måte etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av wogonin i 48 timer (fig. 3B). Dette resultatet er i samsvar med nedregulering av mRNA påvist ved å vise at qPCR HDAC1 ble redusert med 0,69 ganger og HDAC2 av 0,73-fold, (usikkerheter relatert til brette-endringene var mindre enn 2) (Fig. 3A). Disse endringene kan føre til en tilsvarende økning i histone acetylering og fremme uttrykk for kreft undertrykkende proteiner.
(A) Relative mRNA nivåer av HDAC1 og HDAC2 ble oppdaget ved hjelp av real-time PCR med GAPDH som en intern kontroll. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter.
#
P
0,01 vs kontrollgruppe. (B) Protein nivåer av HDAC1 og HDAC2 analysert ved western blot. I disse eksperimentene, ble cellene eksponert for wogonin 0, 15, 25 og 35 ug /ml i 48 timer. *
P
0,05 vs kontrollgruppe, **
P
. 0,01 vs kontrollgruppe
Wogonin nedregulerer c-myc og Skp2 på protein nivå, og øker mRNA nivå av c-myc
Både c-myc og Skp2 ble nedregulert på proteinnivå etter eksponering for wogonin (0, 15, 25, 35 mikrogram /ml) for 48 h, (fig. 4b). Som vist på fig. 4A, mRNA nivået av Skp2 redusert 0,81 ganger, mens mRNA nivå av c-myc økte omtrent 1,6 ganger (usikkerhet knyttet til fold-endringer både 2). Disse funnene tyder på at en proteasomal degradering sti kan være involvert i reguleringen av c-myc og Skp2. Men som wogonin resulterte i redusert protein uttrykk i Skp2, ytterligere eksperimenter fokusert på proteasome anerkjennelse subenheten, Fbw7α, som retter seg mot c-myc.
(A) Relative mRNA nivåer av c-myc og Skp2 ble oppdaget ved hjelp av real-time PCR med GAPDH som en intern kontroll. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter.
#
P
0,01 vs kontrollgruppe. (B) Protein nivåer av c-myc og Skp2 analysert ved western blot. I disse eksperimentene, ble cellene eksponert for wogonin 0, 15, 25 og 35 ug /ml i 48 timer. *
P
0,05 vs kontrollgruppe, **
P
. 0,01 vs kontrollgruppe
Wogonin Redusert Fbw7α og GSK3p, og økt Thr58- myc på proteinnivået
Protein nivåer av Fbw7α redusert etter eksponering for wogonin, (fig. 5B), men det var ingen tilsvarende reduksjon i mRNA-ekspresjon (fig. 5A). Thr58 fosforylering av c-Myc økes (fig. 5B). Thr58 fosforylering av c-myc er en nødvendig komponent av dens nedbrytning og er mediert av GSK3p. Imidlertid minsket GSK3P uttrykk både på mRNA (0,78 ganger ved 35 ug /ml) (fig. 5A) og proteinnivå (fig. 5B). Disse funnene tyder på at fosforylering av c-myc på Thr58 kan oppstå uavhengig av GSK3p. Dette krever imidlertid videre studier.
(A) Relative mRNA nivåer av Fbw7α og GSK3p ble oppdaget ved hjelp av real-time PCR med GAPDH som en intern kontroll. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter.
#
P
0,01 vs kontrollgruppe. (B) Protein nivåer av Fbw7α, Thr58-Myc og GSK3p analysert ved western blot. (C) Protein nivåer av c-Myc analysert ved western blot. I disse forsøk ble en pM MG132 tilsatt inkubert med eller uten 25 mg /ml wogonin i 48 timer. *
P
0,05 vs kontrollgruppe, **
P
. 0,01 vs kontrollgruppe
Forsøkene ble gjennomført med proteasominhibitor MG132 å videre forstå proteasomal degradering pathway involvert i reguleringen av c-Myc. Resultatene i fig. 5C viser at MG132 var ute av stand til å reversere c-myc degradering indusert med 25 mikrogram /ml wogonin. Videre forskning er derfor nødvendig for å definere den eksakte veien involvert i c-myc degradering.
Diskusjoner
Wogonin er en naturlig forekommende monoflavonoid hentet fra
Scutellaria baicalensis
Radix [28] . Det har blitt rapportert å ha antineoplastisk aktivitet i forskjellige typer av kreft ved induksjon av apoptose og celledifferensiering [30] – [37], og til å bli regulert ved hjelp av forskjellige gener og proteiner [38] – [41]. Det er kjent at c-Myc /Skp2 /Fbw7α og HDAC1 /HDAC2 veier, er forbundet med tumorprogresjon. Her undersøker vi deres rolle i kreft effekter av wogonin i NSCLC A549 celler.
Vi har evaluert første anti-levedyktighet og apoptotiske virkninger av wogonin bruker MTT og Annexin V-PI dobbel flekker analyser. Våre resultater viste at wogonin forårsaket doseavhengig og tidsavhengig inhibering av cellelevedyktighet (IC
50 35 ug /ml ved 48 timer). Den tidlige økning i apoptose hastighet som reaksjon på wogonin forekom i parallell, med annexin V-positive celler gradvis blir Annexin V-negativ.
I IC
50 (35 ug /ml) celler som viste tegn på markert apoptose, i samsvar med de nukleære morfologi endringer sett med DAPI farging.
ekspresjon av apoptose-relaterte proteiner, slik som Bcl-2, Mcl-1, PARP, XIAP, survivin, cytokrom c og AIF ble evaluert for å ytterligere identifisere de apoptotiske virkninger av wogonin på proteinnivået. Resultatene tyder på at wogonin er i stand til å påvirke mitokondriemembranen stabilitet og redusere mitokondrier membranpotensialet (Δψm). Dette ble dokumentert av JC-1 farging, redusert MCL-1 uttrykk og utgivelsen av cytokrom C og AIF inn i cytoplasma. Spaltet PARP og redusert XIAP og survivin uttrykk kan også ha bidratt til utviklingen av apoptose.
HDAC1 og HDAC2 er klasse I HDACs at deacetylate histon og ikke-histonproteinene [5]. De undertrykker genuttrykk, og endre tumor spesifikke proteiner som er involvert i progresjon [4]. Våre resultater viser at mRNA og proteinnivåene av HDAC1 og HDAC2 var både redusert i nærvær av wogonin, noe som indikerer at acetylert histon-proteinet kan fremme ekspresjon av tumor undertrykkende protein og derved hemme tumorprogresjon.
Det innbyrdes forholdet eksisterer mellom c-Myc og Skp2 slik at c-Myc fremmer Skp2 uttrykk, og Skp2 er rettet mot c-Myc for ubiquitin-avhengig nedbrytning [11], [12], [24], [25]. I våre eksperimenter wogonin nedregulert c-Myc og Skp2 på proteinnivået, men mRNA ekspresjon av c-Myc øket 1,6 ganger. Disse funnene tyder på at proteasomal degradering veien kan være relatert til reversering av c-myc. Men siden Skp2 uttrykk redusert, har vi fokusert vår videre eksperimenter på Fbw7α, en annen proteasome anerkjennelse subenheten som er rettet mot c-myc.
Thr58 fosforylering av c-myc er nødvendig for Fbw7α mediert c-myc degradering [24]. Som Thr58 er phophorylated av GSK3p, vi evaluert uttrykk nivåer av Fbw7α, Thr58 c-myc og GSK3p. I disse eksperimentene ble redusert Fbw7α ekspresjon på proteinnivået, men ikke på mRNA-nivå. Thr58 fosforylering av c-Myc øket til en viss grad og GSK3P uttrykk både på mRNA og proteinnivå redusert. Disse resultatene høydepunkt mangel på samsvar mellom Fbw7α mRNA og proteinnivåer, redusert uttrykk av GSK3p og økt fosforylering av c-myc på Thr58.
En tidligere studie viste at fosforylering av Thr58 i A549 celler skjedde uavhengig av GSK3P [42]. Imidlertid er GSK3P den eneste kjente kinase som fosforylerer c-Myc ved Thr58. I våre studier de proteasominhibitor MG132 var ute av stand til å forhindre nedbrytning av c-Myc noe som tyder på at redusert Fbw7α og Skp2 kan være involvert i denne prosess. Men den nøyaktige mekanisme som er involvert krever videre forskning.
Tatt sammen våre funn tyder på at evnen til wogonin til å påvirke forskjellige biokjemiske reaksjonsveier som kan forklare dens aktivitet mot en rekke forskjellige krefttyper. Våre data kan også delvis forklare hvorfor noen gener manglende celler (f.eks de med Fbw7α mangel) er resistente mot wogonin.
