Abstract
Polysialic syre (PSA), en α2,8- bundet homopolymer av N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac), er utviklingsmessig regulert og dens ekspresjon er tenkt å være begrenset til noen få vev hos voksne. Nylig viste vi at to humane patogener uttrykt et derivat av PSA som inneholder de-N-acetyl sialinsyreresiduer (NeuPSA). Her viser vi at en epitop identifisert av den anti-NeuPSA monoklonalt antistoff, SØM 3 (SØM 3-reaktivt antigen eller S3RA), er uttrykt i humane melanomer, og også intracellulært i en human melanomcellelinjen (SK-MEL-28), en human T-celle leukemicellelinje (Jurkat), og to neuroblastom cellelinjer (CHP-134 og SH-SY5Y). SØM 3-binding indusert apoptose i de fire cellelinjene som ble testet. Den uvanlige intracellulære fordeling av S3RA var lik den som er beskrevet for de PSA polysialyltransferases, STX og PST, som også kommer til uttrykk i de fire cellelinjene som ble brukt her. Interessant, undertrykkelse av PST mRNA uttrykk ved transfeksjon av SK-MEL-28 celler med PST-spesifikke kort interfering RNA (siRNA) resulterte i redusert SØM tre bindende. Resultatene antyder videre studier av anvendeligheten av antistoffer som SØM 3 som terapeutiske midler for visse ondartede sykdommer
relasjon:. Steirer LM, Moe GR (2011) et antistoff mot De-N-acetyl sialinsyre Inneholder-Polysialic Acid Identifiserer en intracellulær Antigen og induserer apoptose i human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (11): e27249. doi: 10,1371 /journal.pone.0027249
Redaktør: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 18 august 2011; Godkjent: 12 oktober 2011; Publisert: 09.11.2011
Copyright: © 2011 Steirer, Moe. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av NIH NIAID tilskuddet antallet AI064314 (www.niaid.nih.gov/Pages/default.aspx), NIH NCRR stipend tall CO6 RR-16226 og S10RR025472 (www.ncrr.nih.gov), Barnas Hospital Branches, Inc. ( www.childrenshospitalbranches.org), NIH NHLBI T-32 5T32DK078514-09 (grants.nih.gov/training/nrsa.htm), Swim Across America San Francisco Bay Area (www.swimacrossamerica.org), og Jennifer Leigh Wells Family (www.moonlight4meningitis.com/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
PSA modifikasjon ser ut til å være begrenset til noen animalske proteiner og kapselpolysakkaridene av neuroinvasive bakterier
Neisseria meningitidis
gruppe B (NMB) og
E. coli
K1 [1]. Hos mennesker har PSA blitt vist å være til stede på neural celleadhesjonsmolekyl (NCAM) [2], synaptisk celle adhesjonsmolekyl 1 [3], alfa-underenhet av den spenningsfølsomme natriumkanal [4], integrin alfa-5-underenheten [ ,,,0],5] scavenger receptor CD36 [6], neuropilin-2 [7], og PSA polysialyltransferases ST8Sia2 og ST8Sia4, også kjent som STX og PST, henholdsvis [8]. NCAM er den mest tallrike polysialylated protein, spesielt under fosterutvikling, og rollen til polysialylation i NCAM funksjon er den mest fullstendig undersøkt [9]. NCAM polysialylation blokker klebende egenskaper NCAM å tillate cellemigrasjon og modulere andre NCAM funksjoner [9]. Hos voksne mus, er PSA ekspresjonen begrenset til noen få vev i hjernen som oppviser synaptisk plastisitet, slik som luktelappen og hypothalamus [9] og kan ha en rolle ved T-celle utviklingen [10]. Noen humane tumorer, inkludert astrocytom [11], småcellet og ikke-småcellet lungekarsinom [12], multippelt myelom [13], neuroblastom [14], rhabdomyosarkom [15] og Wilms tumor [16] uttrykkelig PSA og den relative nivået av PSA-ekspresjon i enkelte kreftformer har vært assosiert med dårlig prognose [12], [17].
i løpet av utvikling av vaksiner for å forebygge sykdom forårsaket av NMB, vi oppdaget at et murint monoklonalt antistoff (mAb ) SEAM 3, som ble produsert av immunisering med en N-propionyl derivat NMB kapselpolysakkarid (N-Pr Mbps) -basert vaksine [18], anerkjente PSA antigener som inneholdt de-N-acetylert neuraminsyre (NEU) rester [19] , [20], [21]. Tilstedeværelsen av Neu rester i den N-Pr Mbps-tetanus toksoid-vaksine var en utilsiktet side produktet som resulterer fra ufullstendig re-N-acylering. Deretter viste vi at neuraminsyre holdige PSA (NeuPSA), inkludert fullt de-N-acetylert PSA, var immunogen og fremkalte antistoffer som var beskyttende mot NMB og NMC stammer [19].
Selv om NeuPSA hadde ikke blitt beskrevet tidligere i mennesker, kortere Neu-inneholdende sialinsyre-antigener (NeuSia), for eksempel gangliosidene var blitt rapportert å være tilstede i visse humane tumorer og kreftcellelinjer [22], [23], [24]. NeuSia antigener uttrykt i humane svulster inkluderer NeuSia varianter av mono- og disialylogangliosides GM3 og GD3 [22], [23], [24], [25], [26], henholdsvis. Hakomori og medarbeidere viste at NeuSia GD3 uttrykt i den humane epitel karsinomcellelinje A431 er en sterk aktivator av epidermal vekstfaktor-reseptor-kinase i Triton X-100-behandlede celler [27], [28]. Resultatet tyder på at NeuSia GM3 derivatet kan ha en rolle i aktivering av reseptor-trasé som fremmer cellevekst. Ved hjelp av radioaktive merkingseksperimenter i melanomcellelinjer, Varki og medarbeidere viste at N-acetyl-gruppene i gangliosidene GD3 og GM3 slått over raskere enn foreldre molekyler, noe som tyder på eksistensen av NeuSia-inneholdende gangliosider i disse celler [25]. Nylig Popa et al isolert og strukturelt preget NeuSia holdig GD3 fra primære humane melanoma svulster [26]. Siden noen kreftceller uttrykker NeuSia antigener, det reist spørsmål om hvorvidt de lengre NeuPSA-modifiserte antigener blir også uttrykt av humane kreftceller. I det følgende, undersøkte vi reaktiviteten av SØM 3 med normal human hud, primære humane melanom tumorer og flere humane kreftcellelinjer, inkludert leukemi, melanom, og neuroblastom-celler, og den funksjonelle aktiviteten til SØM 3 mot disse kreftcellelinjer.
Resultater
Spesifisitet av mAb SØM 3
Vi har tidligere vist at SØM 3 er reaktiv med en rekke Neu-holdig oligosialic syre (OSA) /PSA derivater [18], [19], [20]. For å definere det spesielle ved SØM 3 med hensyn til NeuOSA /PSA-antigener sannsynlighet for å bli uttrykt naturlig (dvs.. N-acetyl-inneholdende derivater), har vi fremstilt delvis de-N-acetylerte derivater av OSA ved mild basebehandling av rensede oligosakkarider som har en polymeriseringsgrad (DP) på 2, 3, og 4. den gjennomsnittlige mengden Neu ble bestemt ved anvendelse av en modifisert resorcinol assay som kan måle mengden av neuraminsyre (Neu) og N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) i PSA [19] . Etter mild base behandling, oligosakkarider inneholdt omtrent 25% Neu, og det var en viss nedbrytning av de lengre oligosakkarider slik at trimeren inneholdt både dimerer og trimerer, og den inneholdt tetramer dimerer, trimerer og tetramerer. Den relative evne av oligosakkaridene til å inhibere binding av SØM 3 til den nominelle N-Pr Mbps antigen ble bestemt ved hjelp av ELISA. Resultatene er oppsummert i tabell 1. Konsentrasjonen av oligosakkarid som kreves for å inhibere SØM 3-binding representerer øvre grenser ettersom preparatene inneholder en blanding av kortere oligosakkarider i tillegg til den lengste angitt med DP. Dessuten betyr tallet gitt for DP ikke ta hensyn til den mulige effekten av å redusere C2 karbonylgruppen av den reduserende ende rest, som er nødvendig for å hindre degradering i løpet av basebehandling. Gitt disse betraktninger, oligosakkarider med en DP på 4 var de beste inhibitorer av SØM 3-binding. Evnen av oligosakkaridene til å inhibere SØM 3-binding ikke ble påvirket ved å inkubere dem ved pH 5 uten eller med exoneuraminidase ved 37 ° C i 48 timer (data ikke vist). Behandlingene berike oligosakkaridene for kjeder som har Neu ved den ikke-reduserende ende [19]. SØM tre binding ikke ble hemmet av nærstående MCPS (ie. Poly α2,9 N-acetylneuraminsyre) enten ved full N-acetylert eller inneholder de-N-acetylert rester (tabell 1). Tatt sammen, konkluderer vi med at SØM 3 gjenkjenner oligo eller polysialic syrederivater som har en DP på 4 eller større, hvor omtrent hver fjerde rest er Neu, som kan være plassert ved den ikke-reduserende ende eller på de indre stillinger av polymeren (figur 1 ).
Immunhistokjemisk (IHC) farging av normal menneskelig hud og primære melanom svulster
i normale vev, de-N-acetyl GD3 ble rapportert å være uttrykt «på lave nivåer i noen blodkar, infiltrerende mononukleære celler i huden og tykktarm og til moderate nivåer i huden melanocytter «[22]. Høyere nivåer ble uttrykt i melanomer [22]. PSA-NCAM er allment uttrykt i endodermal, mesodermal, ectodermal og neuro-ectodermal stammer vev på ulike stadier av fosterutviklingen, men uttrykk hos voksne er begrenset til noen få områder av hjernen som viser neuro-plastisitet [29]. For å avgjøre om antigener reaktive med SØM 3 ble uttrykt i normale menneskelige hud og primære melanomer, utførte vi IHC på frosne og formalinfiksert parafin vevsprøver. MAb R24 ble brukt til å markere GD3. Chammas et al., Har rapportert at formalin behandling av vevsprøver kan resultere i modifikasjon av de-N-acetyl GD3 aminogrupper med formaldehyd, noe som resulterer i et tap av reaktivitet med anti-de-N-acetyl-GD3 mAb [22]. Dessuten har IHC-farging for tilstedeværelse av GD3 i formalinfikserte parafin innleiret vev prøvene blitt beskrevet som å være følsom overfor tap av anti-GD3-reaktivitet som et resultat av antigen gjenoppretting [30]. Vi fant de respektive fargemønstre observert for hver mAb testes da stort sett uavhengig av hvilken metode som ble anvendt for fremstilling av prøvene, med unntak av at farging ble redusert til en viss grad i frosne, ufikserte prøvene sammenlignet med parafin innebygd, formalin-fikserte vev. Dessuten var det mer vanskelig å få tak i store, ubrutte deler av vev i den ufestede prøver. Siden fikse prøvene resulterte i overlegen bevaring av vevet struktur og større følsomhet av flekker, er bare resultatene som oppnås ved hjelp av faste vev vist.
IHC farging av fast normal menneskelig hud viser at SØM 3 markerer cellene i plateepitel epitel og infiltrerende lymfocytter (figur 2A), mens den negative kontroll irrelevant muse-IgG2b og IgG3 mAb viste ingen reaktivitet. I motsetning til anti-GD3 mAb var reaktivt bare med antigener tilstede i et par melanocyttene i normal hud (figur 2A, f.eks angitt med pil). SØM tre flekker syntes å være i stor grad cytoplasma med en særegen kornete utseende. SØM 3 binding til antigener tilstede i normal hud kunne bli inhibert med mer enn 90% når den mAb ble pre-inkubert med N-Pr Mbps (50 ug /ml). N-Pr Mbps er det polysakkarid antigen som brukes til å fremstille SØM 3 [18]. Resultatet viser at SØM 3 binding ble mediert av antistoffbindingssete.
IHC analyse av SØM 3 og anti-GD3-binding til normal human hud (A) og et primært melanom (B). Formalinfiksert normal human hud (A) og primært melanom (B) ble inkubert med irrelevant IgG2b sømmer 3, SØM 3 med et polysakkarid-inhibitor N-Pr Mbps, irrelevant IgG3, og anti-GD3 mAb R24 som angitt. Binding ble påvist ved hjelp av DAB, som produserer et brunt bunnfall. Kontra ble utført ved hjelp av hemotoxylin. Pilen i den mikrofotografi av SØM 3-binding til normal hud viser et eksempel på SØM 3 merking av en infiltrerende lymfocytter og for den anti-GD3-mikrobilde, et melanocytt. Referanse barer = 40 mikrometer.
Den mørke farging av melanom prøven som følge av SØM tre binding (figur 2B) viser at S3RA antigener ble uttrykt i svulsten. Som med normal hud, ble SØM tre binding til antigener i melanom prøven hemmet med løselig N-Pr Mbps (figur 2B). Den intense farging av melanom prøven antyder at S3RA ble uttrykt i høyere nivåer i tumoren sammenlignet med normale epitelceller. Alle tumorceller i den delen, som hadde dimensjoner på omtrent 1 cm x 2 cm, ble farget. I motsetning til anti-GD3 mAb oppviste heterogen binding til tumorvevet med noen celler merket med mAb, mens andre viste ingen farging (figur 2B).
I tillegg til det eksempel primære humane melanom vist i figur 2B , en rekke 12 mindre primære humane melanoma prøver tatt fra huden, esophageal, parotid og endetarmssvulster ble evaluert for SØM 3 og irrelevant IgG2b reaktivitet ved IHC. Alle melanoma prøvene i rekken var reaktive med SØM 3 mens den irrelevant mAb IgG2b viste ingen reaktivitet (data ikke vist). Intensiteten av fargingen som følge av SØM 3 binding i melanom tumor matrisen var som i eksempelet vist i Figur 2B. Prøver på normal hud tatt fra områder som grenser til noen av melanomer som ble inkludert i prøven matrisen oppviste det samme mønster av SØM 3 reaktivitet som er vist på figur 2A med normal hud (data ikke vist).
Expression av S3RA i kreftcellelinjer
Siden de-N-acetyl sialinsyre-inneholdende derivat av disialyloganglioside GD3 har blitt rapportert å være tilstede i melanomcellelinjer [24] samt i primære, humane tumorer [26 ], og vi fant ut at SØM tre var reaktiv med primære melanomer (figur 2B), utførte vi flowcytometri for å måle SØM tre binding med fire humane kreftcellelinjer som uttrykker ulike Sia-inneholder antigener (tabell 2).
figur 3 viser binding av underklasse-matchet irrelevant mAb IgG2b forhold til søm 3, anti-CD3 mAb R24 og anti-NCAM (CD56) mAb binding til SK-MEL-28 melanom og SH-SY5Y neuroblastom celler i fravær og nærvær av Triton X-100 behandling, som angitt. Porter som definerer celler som var positive for binding ble definert ved bruk av subklasse matchende isotype-kontroller, og er angitt på hvert histogram er vist i figur 3. I fravær av detergent, 29% av SK-Mel-28-celler var positive for SØM 3-binding sammenlignet med 80% for anti-GD3 og 3% for irrelevant mAb. Imidlertid, når cellene ble gjort gjennomtrengelig for mAbs av detergent behandling, var 82% av SK-MEL-28-celler positive for SØM 3-binding, og den relative fluorescensen øket mer enn ti ganger. Den prosentvise anti-GD3-positive celler økte svakt til 92%. Binding av anti-NCAM mAb var sammenlignbar med irrelevant mAb lgG1 i nærvær eller fravær av detergent, og derfor er N-CAM ikke uttrykt i SK-MEL-28-celler. For SH-SY5Y-cellelinje, ble 20% av de ikke-vaskemiddel behandlede celler positive for SØM 3-binding, som økte til 96% i nærvær av detergent (figur 3). Dessuten økes den relative fluorescensen av mer enn 10 ganger. Større enn 85% av SH-SY5Y celler var positive for anti-NCAM og mindre enn 21% for anti-GD3 bindende både intakte eller permeabilized celler. Resultatene er oppsummert i tabell 3 for de fire cellelinjer viser at prosentandelen av celler som var positive for SØM 3-binding, og den midlere fluorescens av cellene var variabel blant de cellelinjene som ble testet. Men de intakte celler av hver cellelinje var hovedsakelig negative for SØM 3-binding. I motsetning til nesten alle celler av hver cellelinje inneholdt intracellulære søm 3-reaktive antigener (S3RA). Den dominerende intracellulære fordeling av S3RAs ikke svarer til fordelingen av GD3 eller PSA-NCAM, som var hovedsakelig lokalisert på celleoverflaten. Resultatet antyder at S3RAs ikke ble de-N-acetyl Sia derivater av enten GD3 eller PSA-NCAM, eller at de intracellulære motstykker av disse molekylene ikke er reaktive med de respektive mAb’er.
SK-MEL-28 og SH -SY5Y celler var enten ubehandlet for å detektere overflatebinding (øvre panel i hvert sett av to plater), eller behandlet med Triton-X-100 for å påvise intracellulære bindings (nedre panel) ved strømningscytometri. Celler ble inkubert med 5 pg /ml av hvert primært antistoff, etterfulgt av inkubasjon med 2 ug /ml Alexa Fluor 488-konjugert sekundært antistoff. Irrelevant muse-IgG2b, IgG3, og IgG1 mAbs ble anvendt som negative kontroller for SØM 3, anti-GD3, og anti-NCAM, henholdsvis, og ble anvendt for å bestemme grunnlinjen fluorescens. Binding ble påvist ved hjelp av Guava EasyCyte strømningscytometer. Gates brukes til å definere celler positive for binding er indikert på toppen av hvert histogram.
For å demonstrere spesifisitet binding, faste og permabolized Jurkat eller SK-MEL-28 celler ble inkubert med SØM 3 i fravær og nærvær av N-Pr Mbps inhibitor. I motsetning til de prøvene faste vev er imidlertid de relativt høye konsentrasjoner av SØM 3 (5 ug /ml) i kombinasjon med det oppløselige N-Pr Mbps inhibitor produsert tvetydige resultater. I noen forsøk ble det observert delvis hemning, men i andre polysakkaridet inhibitor hadde enten ingen effekt eller resulterte i en økning i binding. Det er mulig at de variable virkninger av tilsetning av N-Pr Mbps til binde reaksjon resulterte fra tilbøyelighet til NeuPSA derivater som er tilstede i N-Pr Mbps forberedelse til å danne aggregater som er for store til å unnslippe permeablized celler eller at cellene har reseptorer for NeuPSA som også binder seg til N-Pr Mbps.
fluorescens mikroskopi.
Immuno-fluorescens mikroskopi (IFM) ble brukt til å undersøke den cellulære plasseringen av søm 3-reaktive epitoper i vaskemiddel ubehandlet og behandlet SK-MEL-28 og CHP-134-celler (figur 4). Resultatene av strømningscytometri bindingsforsøk med SK-MEL-28-celler ikke behandlet eller behandlet med rengjøringsmiddel (figur 3) antydet at SØM 3 reaktive epitoper hadde en cellulær lokalisering som var forskjellig fra GD3 og PSA-NCAM. I samsvar med disse resultatene, bare et delsett av SK-MEL-28 og CHP-134-celler ikke behandlet med vaskemiddel var reaktive med SØM 3 ved IFM (rød fluorescens i figur 4). Som vist i figur 4, SK-MEL-28-celler som var mest reaktive med SØM 3 ble «avrundet» celler med forholdsvis kondensert kjerne-DNA slik som vist med DAPI farging. Langstrakte cellene var mindre reaktive med SØM 3 (sammenlign SK-MEL-28-celler i lys-mikroskopi vist i figur 4 med IFM). I motsetning til anti-GD3 merkede alle celler (grønn fluorescens som vist i figur 4). Når imidlertid SK-MEL-28-celler ble behandlet med vaskemiddel, alle cellene var positive for SØM 3-binding (figur 4). I de detergent-behandlede celler, ble SØM 3 reaktivitet dispergert gjennom hele cytoplasmaet i granule-lignende strukturer (figur 4, eksempelvis indikert ved en pil). Anti-GD3 reaktivitet var preget av en diffus mønster av flekker med flekker av konsentrert reaktivitet i både ubehandlede og vaskemiddel-behandlede celler (figur 4). Det var en viss grad av samlokalisering tydelig i sammensatte bilder av SØM 3 og anti-GD3-stemplet celler (gul i figur 4), men klare forskjeller også. Således SØM 3 reaktivitet ikke var direkte korrelert med GD3 annet enn tilfeldig lokalisering til membranen i fravær eller nærvær av vaskemiddel og ekspresjon av S3RAs var begrenset til en undergruppe av celler.
Lys mikrografer av SK-MEL- 28 og CHP-134 viser den generelle form av celler med kjerne-DNA er angitt i blått. Anti-NeuPSA mAb søm 3-binding (i rødt) til SK-MEL-28 og CHP-134-celler ikke behandlet eller behandlet med Triton X-100 for å permeablize cellene, ble sammenlignet med anti-GD3 og -PSA i grønt, som antydet . Subcellulære lokalisering av S3RA i SK-MEL-28 celler med Golgi (giantin, golgin 97 og Tuba) og ER (calnexin) markører vises i bunnpanelet i gult. Pilene viser granulære vesikulær-lignende strukturer med relativt intens SØM tre flekker. Referanse barer = 20 mikrometer.
I CHP-134 celler, søm 3-reaktive epitoper (rød fluorescens i figur 4 CHP-134 celler som indikert) ble i hovedsak lokalisert til grensene for kontakt mellom cellene. PSA-antigener, som påvist med anti-PSA mAb 2-1-B [31] (grønn fluorescens i figur 4 som indikert), ble også plassert hovedsakelig i områder av celle-celle-kontakt. Selv om den fluorescens som skyldes SØM 3 binding var lavere, både den relative intensitet og fordeling av fluorescens som skyldes anti-PSA-binding ble lik den i SØM 3 i intakte celler som vist med gul farge som følge av overlagring av rød og grønn fluorescens i det sammensatte bildet (figur 4). Dette var en indikasjon av sømmen 3-merket antigen blir plassert på celleoverflaten. Videre ble SØM tre merking korrelert med anti-PSA merking (Manders «koeffisient for grønn = 0,998) og i mindre grad med anti-NCAM merking (Manders» koeffisient for grønne = 0,642; mikrografer ikke vist) i enten fravær eller nærvær Triton X-100. Imidlertid, når cellene ble behandlet med vaskemiddel var det mindre overlapping mellom SØM 3 og anti-PSA merking (antydet med forholdsvis større mengde av rød fluorescens i vaskemiddel behandlede komposittmikrograf) som tyder på at det var en brøkdel av antigener gjenkjent av mAb i felles og distinkte antigener innregnes separat.
Siden i SK-MEL-28 celler flertallet av antigener reaktive med SØM tre ble plassert i kornet lignende strukturer inne celler, utførte vi IFM hjelp markører for Golgi og endoplasmatiske retikulum ( eR) for å avgjøre om SØM 3 reaktivitet ble assosiert med de spesielle subcellulære organeller. Golgi markører inkludert giantin og golgin-97 for cis /mediale og trans-Golgi membraner, henholdsvis, og Tuba, et multifunksjonelt protein som antas å være involvert i regulering av celle kryss og endocytiske handel [32] fra Golgi-avledet vesikler i cytoplasma [33] . Calnexin, en molekyl anstand protein ble anvendt som en ER markør [34]. Som vist ved tilstedeværelse eller mangel på gul fluorescens i sammensatte bilder, SØM 3 var hovedsakelig ko-lokalisert med Golgi og ER (som vist i figur 4) markører. Ko-lokalisering ble analysert ytterligere ved hjelp av Jacop [35] i bilde J. Alle de Golgi og ER-markører ble funnet å ha høy colocalization for markøren i forhold til sømmen 3 (Manders «koeffisienter for grønn alt større enn 0,92) med åpenbare fordeling av S3RAs utsiden av organeller i tillegg. Den nærmeste generelle colocalization var mellom SØM 3 og Tuba, som vist i figur 4. Således NeuPSA antigener påvises ved å bruke SØM 3 var hovedsakelig lokalisert inne celler og forbundet med Golgi, ER og cellulær matrix, men var også til stede på overflaten av subpopulasjoner av hver cellelinje.
uttrykk for polysialyltransferases PST og STX i kreftcellelinjer
neuroblastom cellelinjer CHP-134 og SH-SY5Y var kjent for å uttrykke høye nivåer av PSA i form av PSA -NCAM, mens Jurkat og SK-MEL-28 celler ble ikke kjent for å uttrykke PSA eller NCAM. Siden NeuPSA er sannsynlig å være avledet fra PSA, målte vi uttrykk for α2,8 polysialyltransferases ST8Sia2 (STX) og ST8Sia4 (PST) mRNA i de fire cellelinjer ved kvantitativ PCR. SH-SY5Y-celler er blitt vist å uttrykke både STX og PST [36], og ble anvendt for sammenligning av STX og PST uttrykk i de andre cellelinjer. Ved hjelp av absolutt kvantifisering, vi fast bestemt på STX uttrykk var høyest i SH-SY5Y celler, med 1,2 × 10
6 kopier /1 × 10
7 eksemplarer av GAPDH (figur 5). CHP-134 uttrykt tilsvarende nivåer av STX, mens SK-MEL-28 celler uttrykte nesten 100 ganger mindre og Jurkatceller uttrykte nesten 1000 ganger mindre STX. SH-SY5Y celler uttrykte minst mulig PST forhold til de andre tre cellelinjer, med 9,0 × 10
2 kopier /1 × 10
7 eksemplarer GAPDH. CHP-134, SK-MEL-28, og Jurkat-celler uttrykte 60, 140, eller 550 ganger mer PST, respektivt, sammenlignet med SH-SY5Y celler (Figur 5).
1 pg av total RNA fra hver cellelinje ble revers-transkribert til cDNA, og deretter anvendt som templat i den QRT-PCR-reaksjonen. De mRNA kopiantallet av STX, PST, og GAPDH bestemmes fra en standardkurve for serielt fortynnede standarder er vist i grafen som mål-mRNA-kopier pr 10
7 GAPDH mRNA-kopier. Feilfelt er SEM av tredoble målinger fra tre uavhengige populasjoner av hver cellelinje.
Avhengighet av SØM 3 reaktivitet med SK-MEL-28 celler på uttrykk for polysialyltransferase PST
for å fastslå at SØM 3 er reaktivt med et antigen som er avledet fra PSA, undersøkte vi hvorvidt inhibering av ekspresjonen av polysialyltransferase PST mRNA i SK-MEL-28-celler med PST-spesifikk liten interfererende RNA (siRNA) vil resultere i en reduksjon i SØM 3-positive celler ved flow cytometri. Negativ kontroll kryptert siRNA eller PST spesifikk-siRNA ble transfektert inn i SK-MEL-28-celler, og etter 72 timer var den relative mengde (RQ) av PST Liggende ble signifikant redusert (P 0,0001) i celler transfektert med PST siRNA (RQ = 0,124) sammenlignet med celler transfektert med negativ kontroll siRNA (RQ = 1) (figur 6).
SK-MEL-28-celler ble transient transfektert med 50 nM siRNA i 72 timer i tre eksemplarer, og deretter total-RNA fra hvert cellelinjen ble revers-transkribert til cDNA og anvendt som templat i den QRT-PCR-reaksjonen. Relativ kvantifisering ble bestemt ved å bruke den komparative CT metode, normalisert til GAPDH-mRNA.
I dette forsøk, bare den undergruppe av celler transfektert med siRNA og utarmet av pre-eksisterende PSA-derivater ville være forventet å vise avdøde reaktivitet med SØM 3 hvis antigenet er reaktivt med mAb var avhengig av aktiviteten av PST. Til tross for disse begrensninger, i tre separate forsøk med to utført i tre eksemplarer, brøkdel av sømmen 3-positive celler ble signifikant redusert i celler transfektert med PST siRNA sammenlignet med celler transfektert med egge siRNA (tabell 4). Resultatet viser tydelig at antigenene gjenkjent av SØM 3 i SK-MEL-28 celler var avhengig uttrykk for PST.
Cytotoksisk funksjonell aktivitet av SØM 3 mot kreftceller
funksjon av S3RA i celler er ikke kjent. For å bestemme hvilken virkning interfererer med funksjonen av S3RA uttrykt på celleoverflaten kan ha, ble celler inkubert over natten med SØM 3 ved mAb konsentrasjoner som anvendes i bindingsstudier som er beskrevet ovenfor. Under mikroskopisk undersøkelse, cellene oppviste egenskapene til gjennomgår apoptose (data ikke vist). Basert på denne initiale observasjon, anvendte vi to uavhengige analyser for å måle effekten av SØM 3 på levedyktigheten av de fire cellelinjer: flowcytometri med ViaCount reagens og et laktat dehydrogenase (LDH) slipper assay. Den første er basert på membranen permeable og tette DNA-bindende fluorescerende fargestoffer og LDH analysen på utgivelsen av LDH som følge av tap av membranintegritet. Resultatene for konsentrasjonsavhengig effekt av SØM 3 på levedyktigheten av de fire cellelinjer etter 16 timers inkubering ved hjelp av LDH-analyse er vist i figur 7A. Renset SØM 3 var cytotoksisk mot de fire cellelinjene som ble testet, men effekten var variabel for hver cellelinje. Jurkat-celler som var mest følsomme overfor søm 3-mediert antistoffavhengig cytotoksisitet (ADC), mens SK-MEL-28-celler var den minst følsomme. Omtrent 45% av Jurkat-celler og 25% SK-MEL-28, CHP-134, og SH-SY5Y celler ble drept ved den høyeste SØM tre testede konsentrasjon. SØM 3-mediert cytotoksisitet ut til å flate ut på et fast brøkdel av celler. For eksempel, ADC mot Jurkat og SH-SY5Y-celler mediert ved SØM 3 nærmer seg et maksimum ved ca. 10 ug /ml SØM 3 med bare en marginal økning i å drepe 20 mikrogram /ml (figur 7A). Resultatene kan reflektere det faktum at både antall celler og mengden av S3RA uttrykt av cellene var variabel mellom cellelinjer (se tabell 3), og at mengden av antigen forblir relativt konstant i populasjonen av celler i løpet av de 16 timer tidsperiode. Resultater tilsvarende de som er vist i figur 7A, ble oppnådd ved bruk av Guava ViaCount analyse (data ikke vist). For å demonstrere spesifisitet SØM 3 ADC aktivitet, forsøkte vi å hemme drepe med løselig N-Pr Mbps. Men hemming forsøket ble gjort til skamme fordi løselig N-Pr Mbps ble tatt opp av levende celler resulterer i en markant økning i uttrykket av S3RA (BT Hagen og GR Moe, upublisert).
(A), antistoff avhengig cytotoksisitet av SØM 3 mot SK-MEL-28, CHP-134, SH-SY5Y, og Jurkat-celler som målt ved hjelp av LDH-frigivelse assay. Hver cellelinje ble inkubert med økende konsentrasjoner av SØM 3 i 16 timer. LDH-frigjøring ble målt og prosent cytotoksisitet ble bestemt ved bruk av spontan frigivelse og maksimal frigivelse etter behandling med Triton X-100. (B), Analyse av SØM 3-mediert apoptose mot SK-MEL-28 melanomceller ved strømningscytometri. SK-MEL-28-celler ble inkubert med et irrelevant mAb IgG2b (5 ug /ml), DMSO, 0,1 uM Staurosporin, eller 5 pg /ml SØM 3 i 12 eller 24 timer. Cellene ble deretter farget med fluorescensmerkede annexin V og propidiumjodid og fraksjonen av levende (åpne søyler), apoptotiske (kryss-skraverte søyler), og døde celler (svarte søyler) ble målt ved strømningscytometri.
SØM tre binding induserer apoptose i Jurkat og SK-MEL-28 celler
for å finne ut om SØM 3 cytotoksisitet resultat av apoptose av Jurkat og SK-MEL-28 celler, sammenlignet vi effekten av SØM tre bindende cellene til virkningen av staurosporin, er en generell kinase-inhibitor som er en klassisk induserer apoptose [37]. I det eksempel som er vist i figur 7B, ble SK-MEL 28 celler ble inkubert i 12 og 24 timer med irrelevant mAb, DMSO, staurosporin, eller skjøt 3, og antall levende, apoptotiske og døde celler ble kvantifisert ved anvendelse av en strømningscytometrisk analyse som målte utseendet av fosfatidylserin på celleoverflaten gjennom annexin V-binding og DNA-innhold ved propidiumjodidfarging. Som vist i figur 7B, behandling med SØM 3 eller staurosporin økte prosenten av apoptotiske og døde celler etter 12 timer og 24 timer sammenlignet med de IgG2b og DMSO kontroller, respektivt. Resultatene for Jurkatceller inkubert med 10 mikrogram /ml SØM 3 var lik de som er vist for SK-MEL 28 celler i figur 7B (data ikke vist).
Diskusjoner
Lite er kjent om ekspresjonen av de-N-acetyl sialinsyre-inneholdende antigener i normale eller syke humane vev. Studier publisert til dags dato har presentert bevis for ekspresjon av gangliosider GM3 og GD3 inneholdende Neu i noen cancercellelinjer og Neu-inneholdende GD3 i primære humane melanom tumorer [23], [24], [26]. Vårt laboratorium har vist at NmB belastninger og protozoan parasitt
Leishmania store
uttrykke NeuPSA [19], [20], [38], [39], som ikke hadde blitt beskrevet tidligere for enhver organisme.
