Abstract
På grunn av fremskritt i sekvenseringsteknologi, somatisk muterte kreft antigener, eller neoantigener, er nå lett identifiserbare og har blitt overbevisende mål for immunterapi. Spesielt har neoantigen målrettede vaksiner vist lovende i flere prekliniske og kliniske studier. Men til dags dato har neoantigen målrettede vaksinestudier involvert svulster med eksepsjonelt høye mutasjons byrder. Det er fortsatt uklart om neoantigen målrettede vaksiner vil være bredt aktuelt for kreft med middels til lav mutasjons byrder, som for eksempel kreft i eggstokkene. For å løse dette, vurdert vi hvorvidt et derivat av murine ovarial tumor modell ID8 kan være målrettet med neoantigen vaksiner. Vi utførte hele exome og transkriptom sekvense på ID8-G7 celler. Vi identifiserte 92 somatiske mutasjoner, 39 av disse ble transkribert, missense mutasjoner. For de 17 øverste spådd MHC klasse I bindende mutasjoner, vaksineres vi mus subkutant med syntetiske lang peptid vaksiner som koder den aktuelle mutasjonen. Syv av 17 vaksiner induserte robuste mutasjonsspesifikk CD4 og /eller CD8 T-celleresponser. Imidlertid har ingen av vaksinene forlenget overlevelse av tumorbærende mus i enten profylaktisk eller terapeutisk innstilling. Videre er ingen av de neoantigen-spesifikke T-cellelinjer gjenkjent ID8-G7 tumorceller
in vitro
, noe som indikerer at de tilsvarende mutasjonene ikke gi opphav til
bonafide
MHC-presenterte epitoper. I tillegg bioinformatiske analyse av Kreft Genome Atlas data viste at bare 12% (26/220) av HGSC tilfeller hadde ≥90% sannsynlighet for å huse minst en ekte, naturlig bearbeidet og presentert neoantigen versus 51% (80/158) av lungekrefttilfellene. Våre funn fremheve begrensningene søker neoantigen målrettede vaksiner til tumortyper med middels /lav mutasjons byrder
Citation. Martin SD, Brown SD, Wick DA, Nielsen JS, Kroeger DR, Twumasi-Boateng K, et al. (2016) Lav Mutasjon Burden i Eggstokkreft kan begrense nytten av neoantigen-målrettede vaksiner. PLoS ONE 11 (5): e0155189. doi: 10,1371 /journal.pone.0155189
Redaktør: Ali A. Ashkar, McMaster University, CANADA
mottatt: 1 mars 2016; Godkjent: 25 april 2016; Publisert: 18. mai, 2016
Copyright: © 2016 Martin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All sekvense data er fritt tilgjengelig på NCBI Sequence Les Archive, Tiltredelse nummer~~POS=HEADCOMP: SRP069102. Alle andre data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (SDM, RAH, BHN) (MOP137133, 201110GSD-277623-204857), http : //www.cihr-irsc.gc.ca; United States Department of Defense (RAH, BHN) (OC110435), https://www.defense.gov/; Canadian Breast Cancer Foundation (SDM, RAH, BHN), https://www.cbcf.org, og British Columbia Cancer Foundation (RAH, BHN), https://bccancerfoundation.com. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
somatisk muterte kreft antigener, eller «neoantigener», er attraktive immunterapi mål som nylig har blitt tilgjengelig på grunn av fremskritt i neste generasjons sekvensering (NGS) teknologier [1,2]. I motsetning til cancer /testikler (CT) eller differensiering antigener, som er kodet i den kjønnsceller, neoantigener er begrenset tumor og er ikke uttrykt i tymus eller andre ikke-maligne vev. Derfor høy affinitet neoantigen-reaktive T-celler unnslippe negativ seleksjon i thymus, og on-target /off-tumor toksisitet er minimert. Bidraget av neoantigener til vellykket immunterapi blir stadig tydeligere. Kliniske respons på anti-PD-1 [3] og -CTLA-4 [4,5]-antistoffer har vært forbundet med høy mutasjons belastning, noe som tyder på at neoantigener kan være den mest aktuelle målantigener liggende vellykket immun sjekkpunkt blokade. Videre er det økende bevis for at neoantigen-spesifikke T-celler ofte ligger til grunn for vellykket behandling med tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) [6]. I den første publiserte kliniske studie for å bevisst målrette et NGS-identifisert neoantigen, adoptiv overføring av en nær-klonal befolkning på neoantigen-reaktive T-celler resulterte i regresjon av en metastatisk kolangiokarsinom [7]. Men siden de aller fleste mutasjoner, og dermed neoantigener, er unike for den enkelte pasient, krever terapeutisk målretting av neoantigener en individuell tilnærming [1,2,8-13]. Selv om dette representerte et stort hinder i det siste, slike tilnærminger er stadig mer aktuelt i den moderne tid med personlig onkologi [14-16].
For en mutasjon for å gi opphav til en mutant neoantigen, flere kriterier må være oppfylt : a) mutasjonen må være til stede i et peptid som er behandlet fra den overordnede protein ved intracellulært antigen prosessering maskineri; b) mutant peptid må binde med tilstrekkelig affinitet til MHC; og c) pasientens immunrepertoar må inneholde T-celler med tilstrekkelig affinitet og spesifisitet for det mutante epitop. Som et resultat av disse kriteriene, bare en liten prosentandel av mutasjoner gir opphav til autentisk T-celle-epitoper. For eksempel
i silico
analyse av alle mulige 9mers fra et sett av virus proteom avdekket at en median på 2% (område av 0,07% til 10,4%) av peptider bundet til en gitt HLA allele med en IC50 500 nM [17]. Videre er en annen studie av virale epitoper funnet at bare 8% av peptider som bandt til MHCI med en IC50 100 nM representert autentiske epitoper, noe som betyr at de var naturlig behandlet presenteres på MHCI, og anerkjent av autologe CD8 T-celler [18]. Fra disse data, ville man forutsi at kun en liten andel av mutasjoner gir opphav til autentiske neoantigener. Siden antall av somatiske punktmutasjoner i humane svulster kan variere fra fem størrelsesordener i og mellom tumortyper [19,20], fra perspektivet til neoantigen belastning, noen kreftformer er egentlig mer immunogen enn andre. Faktisk bioinformatiske analyse av kreft Genome Atlas (TCGA) data viste at økt punkt mutasjon og neoantigen byrder er assosiert med økt cytotoksiske T-celle infiltrasjon [21,22], og understreker sammenhengen mellom neoantigen belastning og immun anerkjennelse av svulster.
Flere studier har brukt NGS data å systematisk vurdere anerkjennelse av somatiske punktmutasjoner av CD4 og CD8 tIL. Innledende studier ble utført hos melanom pasienter som hadde respondert på sjekkpunktet blokade eller adoptiv T celleterapi. Alt fra 0 til 3 neoantigener ble anerkjent per pasient [10,13,23,24]. Gitt at melanomer havn en median på 130 ikke-synonyme punktmutasjoner [25] Disse funnene tyder på at kun en mindre andel av mutasjoner gir opphav til autentiske neoantigener. To studier av karsinomer har brukt NGS for å identifisere neoantigen reaktive T-celler på en helhetlig måte forut for en hvilken som helst immunterapi blir administrert. Vår gruppe sekvensert primære og tilbakevendende svulster fra tre HGSC pasienter og identifisert en enkelt neoantigen-reaktive T-celle-klone i TIL fra en pasient; å kombinere data fra alle tre pasienter indikerer at 1,3% (1/79) av mutasjoner ga opphav til autentisk MHCI epitoper [12]. Videre, i en studie av 10 gastrointestinale tumorer skjuler tilsammen 1452 mutasjoner, 18 mutasjoner (1,2% av totalt) ble gjenkjent av CD4 eller CD8 TIL (område = 0-3 per sak) [26]. Således er disse to sistnevnte studier indikerer at omtrent 1% av punktmutasjoner gi opphav til neoantigener som lokke fram spontan TIL responser.
Mens de ovennevnte studier var basert på analyse av pre-eksisterende T celle responser, mens andre har undersøkt i hvilken grad neoantigen-spesifikke T-celle-responser kan være primet ved vaksinasjon. Faktisk, menneskelige vaksine studier viste at T-celle responser kan utløses mot mutasjoner i vanlige driver gener, inkludert punktmutasjoner i KRAS [27] og p53 [28] og til bruddpunkt sekvenser i fusjons oncoproteinet BCR-ABL [29]. Med NGS, kan man utvide denne tilnærmingen utover etablert, delte mutasjoner til hele komplementet av somatiske mutasjoner i et individs svulst (referert til som mutanome). Ved å bruke MHC bindende algoritmer for å mutanome data, kan man designe personlige vaksiner som er rettet mot de best predikerte mutant epitoper i en gitt svulst. Neoantigen-spesifikke vaksiner basert på denne tilnærmingen har vist terapeutisk effekt i murine modeller av melanom, karsinom, og kreftfremkallende-indusert sarkom [30-33]. Men til dags dato har slike pre-kliniske studier rettet svulster som inneholder alt fra 949 til 4285 nonsynonymous mutasjoner [30-33]. I kontrast, humane tumorer inneholde en median på bare 44 ikke-synonyme mutasjoner [20], heve spørsmålet om svulster med middels til lav mutasjons byrder er mottagelig for neoantigen målrettet vaksinasjon.
Høy klasse serøs karsinom ( HGSC) er den vanligste histologiske subtype av eggstokkreft, og langsiktige overlevelse har ikke bedret seg utover 30-40% for de siste 30 årene [34]. I likhet med andre kreftformer, er tilstedeværelsen av tumor-infiltrerende T-celler sterkt forbundet med overlevelse i HGSC [35], som har inspirert innsats for å utvikle immun-baserte behandlinger for denne sykdom [36]. Flere kandidat målet antigener har blitt identifisert, inkludert p53 [37], WT-1 [38], NY-ESO-1 [39], mesothelin [40], og folat reseptoren [41]. Men disse representerer selvantigener, som er underlagt saker av immunologisk toleranse og autoreactivity. Videre terapeutisk målretting av disse antigenene ved hjelp av vaksiner [37,38], eller CAR T-celler [42] har gitt bare sporadiske responser i HGSC hittil. Således er muligheten for å behandle HGSC med neoantigen spesifikke vaksiner overbevisende fra både en immunologisk og klinisk synspunkt. Men i motsetning til svært muterte maligne lidelser som melanom, HGSC har blitt funnet til båtplass en median på bare 40 missense mutasjoner per tumor [25], plassere det svært nær medianen for kreft hos mennesker [20]. Dermed er HGSC en ideell sykdom for å teste anvendeligheten av neoantigen målrettede vaksiner i maligniteter med mellom mutasjon belastning.
For å oppnå dette, har vi utført prekliniske vaksinestudier med et derivat av murine eggstokkreft modell ID8. Den ID8 linjen har blitt brukt mye til å studere biologiske og immunologiske egenskaper ved eggstokkreft [43-45]. Det oppsto ved spontan transformasjon av normal murine eggstokkreft overflaten epitelceller (OSE) celler under serie
in vitro
passasje [46]; Derfor var det ikke ventet å huse det høye antallet mutasjoner funnet i kreftfremkallende-induserte svulster. Selv om de fleste menneskers HGSC antas å oppstå fra de distal egglederen sekretoriske epitelceller [34], gir OSE-avledet ID8 linje opphav til aggressive, spres kreft som er patologisk og histologisk lik menneskets HGSC [43,46]. Linjen er følsom for immun sjekkpunkt blokade [45] og adoptiv T celleterapi [47], noe som gjør det til et attraktivt system for å vurdere nye T-cellebasert immunterapi. Etter å ha utført hele exome og transkriptom sekvensering på et derivat av ID8 linjen, vi evalueres systematisk alle identifiserte nonsynonymous mutasjoner som mål for forebyggende og terapeutisk vaksinasjon. Vi sammenlignet våre funn til 220 mennesker HGSC tilfeller ved hjelp av data fra Kreft Genome Atlas (TCGA). Våre funn tyder på at den relativt lave mutasjon belastning både ID8 svulster og menneskelig HGSC presenterer en stor utfordring for neoantigen baserte vaksiner.
Metoder og materialer
Exome og RNA sekvense
Bibliotek konstruksjon, sekvensering, og bioinformatiske analyser ble utført ved Michael Smith Genome Sciences Centre. Genomisk DNA ble ekstrahert fra dyrkede ID8-G7-tumorceller og normale C57Bl /6 miltceller. DNA ble forberedt for exome valg i henhold til produsentens protokollen med Agilent SureSelectXT Reagens kit HSQ (Cat # G9611A), og DNA ble beriket for exomes Agilent SureSelectXT All Mouse Exon Kit (Cat # 5190-4641). 100bp, parvise end sekvensering ble utført ved hjelp av Illumina HiSeq2000 plattformen. Etter RNA ekstraksjon, ble mRNA beriket hjelp Miltenyi Biotec μMACS mRNA Isolation Kit (Cat # 130-090-276) og konvertert til cDNA ved hjelp av Invitrogen Hevet Dobbelt cDNA Synthesis Kit (Cat # 11917-010). cDNA ble skåret, slutten polert, og ligert til adaptere fulgt av 100bp parvise end sekvense på Illumina HiSeq2000 plattformen.
bioinformatiske analyse
100bp parvise end leser fra exome sekvensering ble kartlagt til murine referanse genom (MM9) med Burrows-Wheeler Aligner (BWA) [48]. Duplikater ble flagget hjelp Picard MarkDuplicates (versjon 1.102), og SNV og indels ble identifisert ved hjelp av Samtools (versjon 0.1.18) pileup og VarFilter [49]. Varianter ble kommentert ved hjelp Annovar [50], og kontrolleres visuelt ved hjelp av Integrated Genomics Viewer (IGV) (versjon 2.3.32) [51]. Alle variantene finnes i dbSNP138 ble fjernet. RNA-seq leser ble justert til et genom-pluss-kryss referanse (MM9) med BWA, og leser som tilordnes til veikryss ble omplassert som store-gapped genomiske justeringer. Leser ble visualisert ved hjelp av IGV å avgjøre om RNA sekvensering leser inneholdt muterte alleler identifisert i exome sekvense data. Bam sekvense filer er tilgjengelig på NCBI sekvens lese arkivet med følgende sjonsnummer: SRP069102. Hvis både RNA og exome sekvenseringsdata inneholdt en variant som ikke var tilstede i C57BL /6 exome sekvensering av data, ble den ansett som en variant tumor-spesifikk mutasjon. Den anslåtte bindende affinitet til H-2Kb og H-2db av muterte peptider ble bestemt ved bruk NetMHCpan2.4 [52].
Mus og tumorcellelinje
C57BL /6 mus ble kjøpt fra Jackson Labs og holdes under patogenfrie forhold. Alle mus protokoller ble godkjent av Animal Care Advisory Committee ved Universitetet i Victoria (tillatelse Nummer: 2011-032 (2)), etter Canadian Council for Animal Care retningslinjer. Adoptiv celle overføring av splenocytter fra kvinnelige OT-I transgene mus (Jackson Labs) som inneholder T-celler gjenkjenner kylling ovalbumin (OVA)
257-264 epitop SIINFEKL ble brukt som positive kontroller for tumorbærende eksperimenter [53]. Mus mammary tumor virus MMTV /
neu
OT-I /OT-II
transgene mus ble brukt som verter i tumorbærende eksperimenter [54]. Disse musene er tolerante til SIINFEKL epitop grunn uttrykk for OT-I epitop (SIINFEKL) merket på
neu
genet i mammary epitelvev. ID8 kreftceller [46] ble sjenerøst donert av legene. Paul Terranova og Katherine Roby i 2001 og endret i huset for å uttrykke SIINFEKL epitop merket til rotte
neu
onkogen. ID8-G7 tumorceller [47] ble dyrket i høy glukose DMEM (Hyclone: SH30022.01) supplert med 5% FBS (Gibco: 12483-020), 2 mM L-glutamin (Hyclone: SH30034.01), 100 U /ml Penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Hyclone: SV30010), 50 mikrometer β-mercaptoethanol (Sigma: M6250), og 1X Insulin Transferrin Selen (ITS) (Corning: 354351).
Vaksinasjoner
Seks til tolv uker gamle hunn C57Bl /6 villtype (WT) eller MMTV /
neu
OT-i /OT-II
mus ble bedøvet og subkutant inokulert i flanken ved hjelp av en 27 gauge nål. Hver inokulering besto av 25-50 ug av peptid (ProImmune) eller 100 ug av kylling ovalbumin (OVA) (Sigma cat # A5503) og 10 ug poly (I: C) (Amersham: 27-4732) blandes til en total av 300 mL i sterile PBS (Gibco: 20012-027). For terapeutiske vaksineforsøk, mus fikk daglige vaksinasjoner på dag 3-6 dager etter tumorinokulasjon. For alle andre vaksinasjonsforsøk, mus fikk daglige vaksinasjoner på dager -28 til -25 og -7 til -4 med enten svulst implantering eller ofring av mus på dag 0.
Tumor-bærende mus eksperimenter
ID8-G7-tumorceller ble løsnet fra platene ved hjelp av trypsin, vasket 3 ganger i steril PBS, og re-suspendert i steril PBS ved 10
7 celler /ml. Cellesuspensjonen (10
6-celler i 100 ul) ble injisert i bukhulen til hver mus. Musene ble overvåket og avlives ved første tegn til oppblåst mage på grunn av ascites opphopning. På obduksjon alle mus med oppblåst mage inneholdt svært spredte svulster. For adoptive overføringsforsøk ble OT-I transgene mus avlivet, og miltceller ble behandlet ved å trykke splenocytter gjennom en 100 pm nylonfilter, å lysere røde blodceller med ACK lyseringsbuffer (Lonza: 10-548E), og telling av levende splenocytter ved trypan blue-farging . OT-I splenocytter (10
5-celler i 100 ul) ble injisert i halevenen til mottaker mus, etterfulgt av vaksinering med 100 ug OVA og 10 ug av poly. (I: C) i fire etterfølgende dager
IFN-y og IL-2 ELISPOT-analyser
I tråd med miata retningslinjer [55], ble ELISPOT-analyser utført ved hjelp av validerte, standard operasjonsprotokoller. Vaksinert hunnmus ble avlivet ved hjelp av isofluorane, og miltene ble umiddelbart behandlet i en enkelt cellesuspensjon ved å trykke inn 100 um skjermer i komplett RPMI (RPMI + HEPES (Bibco: 22400-089) supplert med L-glutamin, β-merkaptoetanol, penicillin og streptomycin , natriumpyruvat (Hyclone: SH30239.01) og 10% FBS). Røde blodceller ble lysert ved hjelp av ACK lysebuffer, og ferske splenocytter ble regnet med en Guava cytometer hjelp Viacount (Cat #: 4000-0130). Splenocytter ble fortynnet til 5 x 10
6 eller 10
7 levende celler /ml (vanligvis mellom 75-85% av splenocytes var levedyktig) i fullstendig RPMI. ELISPOT-plater (MSIP, Millipore: MSIPS4W10) ble belagt med 10 ug /ml anti-muse IFN-γ (mAb an18, Mabtech: 3321-3-1000) eller IL-2 (Mabtech: 3441-2H) fangst-antistoff og inkubert over natten ved 4 ° C. Platene ble vasket og blokkert i 2 timer ved 37 ° C, 5% CO
2 med komplett RPMI. Innen 2 timer etter mus blir ofret, 5 x 10
5 til 10
6 levende, behandlet splenocytter ble tilsatt til hver brønn og stimulert med 0,002 til 20 ug /ml av de angitte peptider, media alene, 5 ug /ml Concanavalin A (Sigma C5275) som positiv kontroll, eller suspensjoner av 10
5 tumorceller /brønn. Kulturer ble inkubert i 20 timer ved 37 ° C og 5% CO
2. Platene ble vasket, 1 ug /ml biotinylert sekundært antistoff (anti-IFN-γ: mAbR4-6A2, Mabtech: 3321-6-250, eller biotinylert anti-IL-2: Mabtech: 3441-2H) ble tilsatt, og platene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Platene ble utviklet ved hjelp av Vector Labs «Vectastain ABC Elite kit (Cat #: PK-6100) og Vectastain AEC substrat reagens (Cat #: SK-4200) i henhold til produsentens protokoll og scoret med en automatisert plateleser (AID) med forhåndsinnstilte parametre som er validert gjennom flere eksperimenter.
Intracellulær cytokin farging (ICS) og celle sortering
Mus ble vaksinert og avlives som beskrevet ovenfor. Friske miltceller (2 x 10
6 celler /1 ml /brønn) ble inkubert med 20 ug /ml mutant beslektet peptid, eller mediene alene, i 24 brønners plater. For ICS, ble splenocytter inkubert i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO
2. GolgiPlug (BD: 51-2301KZ) ble tilsatt, og cellene inkubert i ytterligere 11 timer. Cellene ble deretter behandlet i henhold til produsentens protokoll med foxp3 /transkripsjonsfaktor Farging Set (eBioscience, Cat #: 00-5523). I korthet ble cellene høstet og farget i 30 minutter med festbar levedyktighet fargestoff (0,5 pl /1 ml prøve) (eF780, eBioscience: 65-0865-18), vasket og farget i 30 minutter med overflate antistoffer (CD4-V450 1/200, BD: 560468, CD8-PE 1/500, Tonbo biovitenskap: 50-0081-U100, MHCII-FITC 1/200, eBiosciences: 1250166), faste og permeabilized, og farget i 30 minutter med IFN-γ antistoffer (IFN-y -APC 1/200, eBiosciences: 17-5743). Analytisk flowcytometri ble utført på en BD FACSCalibur flowcytometer og analysert ved hjelp av FlowJo (vX.07). For cellesortering, ble cellene høstet fra 24 brønners plater etter 24 timers stimulering med peptid. Cellene ble filtrert gjennom et 40μm nylonfilter, farget med levedyktighet dye-eFluor780 (0,5 mL /1 ml oppløsning), vasket og farget med overflate antistoffer (CD4-V450 1/200, CD8-V500 1/50, BD: 560 776; MHCII -FITC 1/200, 41BB-PE 1/100, BioLegend: 107105, OX40-APC 1/100, BioLegend: 119409). Celler ble sortert ved hjelp av en BD Tilstrømningen celle sorter, og sorterte cellene ble utvidet i 100U /ml IL-2 (eBiosciences: 34-8021). I fullstendig RPMI
neoantigen prediksjon i TCGA lungekreft og HGSC datasett
TCGA mutasjon merknadsfilene ble analysert, og HLA-alleler ble spådd fra RNA-seq data for HGSC, lunge adenokarsinom (LUAD), og lunge plateepitelkarsinom (LUSC) svulster som tidligere beskrevet [21]. SNVs ble ytterligere filtrert ved å kreve i det minste en lese i RNA-seq bam fil å ha den muterte basen. Samtools v0.1.17 ble brukt til å trekke ut leser dekker mutasjon området fra de indekserte Bam-filer, og en tilpasset python script sjekket for det muterte basen. Epitop spådommer ble utført for alle 8-11mer peptider i forhold til autolog
HLA-A
allel (er) med NetMHCpan v2.8 [52]. En IC50-verdi på 100 nM ble anvendt som terskelen for å ringe høye affinitet epitoper [18]. Siden bare
HLA-A
alleler ble kalt på grunn av utfordringer i ringer entydig
HLA-B Hotell og
C
alleler fra 50bp sekvense data fra TCGA, verdier ble multiplisert med 3 på kontoen for tre HLA loci (
HLA-A
,
B
,
C
). For å beregne sannsynligheten for at en pasient med et gitt antall forutsagte neoantigener inneholdende minst en autentisk neoantigen, søkte vi resultatene av en studie som viser at bare 8% av peptider som binder MHCI med IC50 100 nM viste seg å være autentisk (ie. 92% var ikke ekte) [18]. Vi beregnet sjansen for en pasient som inneholder 0 immunogene mutasjoner ved hjelp av ligning 0.92
N, der «N» er lik antall spådd neoantigener. Trekke fra en, vi ankom prosent sannsynlighet for en pasient med N spådd neoantigener inneholder minst en autentisk neoantigen.
Resultater
Identifisering og validering av tumorspesifikke mutasjoner i ID8-G7 svulst linjen
med mål om å studere en eggstokkreft modell med en neoantigen repertoar ligner menneskelige svulster, undersøkte vi en variant av ID8 svulst linjen (ID8-G7). Fordi ID8 linjen ble generert av
in vitro
serie passasje, det var ikke forventet å huse det høye antallet mutasjoner funnet i kreftfremkallende-induserte svulster. Men siden transformasjonsprosessen skjedde helt
in vitro Hotell og i fravær av immunologisk press, vi tenkte det kunne ha gitt opphav til neoantigener med unaturlig høye MHC slektskap. I motsetning til dette ID8-G7 linje gjennomgikk en runde med
in vivo
passasje i en syngen (C57Bl /6), immunkompetente mus [47], som skulle ha resultert i et repertoar av neoantigener som mer ligner tumorer fra immunkompetente kreftpasienter på eggstokkene. Selv om dette kan ha eliminert uttrykk for noen immunogene, unnværlig mutasjoner (dvs. passasjer mutasjoner), bør eventuelle vesentlige driver mutasjoner har blitt beholdt. For å gi en positiv kontroll antigen, uttrykker ID8-G7 linje CD8 T-celle-epitop SIINFEKL som et chimerisk konstruksjon med rotte
neu
protein (Neu
OT-I /OT-II) [47] . Som vert brukte vi
MMTV /neu
OT-I /OT-II
transgene mus, som er tolerant for SIINFEKL [54]. Etter intraperitoneal injeksjon i
MMTV /neu
OT-I /OT-II
mus, gir ID8-G7 svulst linje opphav til aggressive, spres kreft, preget av omfattende ascites [47]. Imidlertid kan nær komplett tilbakegang av avansert sykdom oppnås ved adoptiv overføring av SIINFEKL spesifikke CD8 T-celler (OT-I T-celler), demonstrere følsomheten ID8-G7 svulster til immunologisk kontroll [47]. Dermed blir ID8-G7-modellen gitt et godt kontrollert system for evaluering neoantigener som mål for immunterapi.
Exome sekvensering ble utført på genomisk DNA fra både ID8-G7 tumor cellelinje og C57Bl /6 murine splenocytter. I tillegg ble RNA-seq utført på ID8-G7 tumor linje. Exome sekvense generert 127 millioner leser som tilordnes til referansen musegenomet, noe som resulterer i et gjennomsnitt på 89-fold dekning. Parvise end RNA-seq generert 158 millioner kartlagt leser (sekvense bam-filer er tilgjengelig på NCBI sekvens lese arkivet med følgende tilgangsnummer: SRP069102). Etter å ha fjernet varianter stede i enten kontroll mus genomet eller dbSNP138 identifiserte vi 92 ikke-synonyme tumor-spesifikke koding varianter (fig 1). Av disse 42 varianter var til stede i minst ett les innenfor RNA-seq data, som indikerer at de var transkribert (S1 tabell). Vi utelatt non-sense mutasjoner, da disse ikke var forventet å gi opphav til T-celle-epitoper. Dette gjorde 39 ikke synonymt, transkribert, missense eller innsetting /sletting (Indel) varianter (fig 1). Aminosyresekvensene omfatter mutasjonene ble spørres hjelp epitop prediksjon programvare (NetMHCpan2.4 [52]). Ved hjelp av en avslappet cutoff av IC50 1500 nM, identifiserte vi 17 mutasjoner forutsagt å gi opphav til minst en MHCI bindende epitop, og disse ble avansert til vaksinasjonsforsøk (tabell 1). En ekstra forutsagte MHCI binding mutasjon (i genet 1110021LRik) kunne ikke evalueres på grunn av vanskeligheter syntetisering av det tilsvarende peptid. Alle de målrettede mutasjoner kvalifisert som mellom affinitet bindemidler, som deres spådd IC50 score varierte 103-1160 nM (tabell 1).
Mutasjoner ble identifisert ved hele exome sekvensering, og uttrykket ble vurdert ved hjelp av RNA-seq. Epitop prediksjon ble utført med NetMHCpan2.4 [52]. Fra og med 92 mutasjoner i genomisk DNA, 17 mutasjoner innenfor peptider spådd å binde MHCI (IC50 1500 nM) ble avansert til senere eksperimenter
Hver mutasjon som ble funnet i et peptid spådd til å binde seg til. H-2Kb eller H-2 dB med en IC50 1500 nM ble kommentert. For hver mutasjon er den aminosyresubstitusjon, forutsagt høyeste bindende epitop, binding stillingen, binding H-2-allelet, den RNA-seq lese telle støtte den muterte og villtype-allel, og 29mer-peptidet som brukes for vaksinasjon.
Induksjon av mutasjon-reaktive T-celler av peptid vaksinasjon
for å finne ut om noen av de 17 forutsagte neoantigener var immunogene, ble naive C57Bl /6 mus vaksinert med 29mer peptider med det muterte rester i den sentrale stilling. Ved å anvende 29mer-peptider, ble intracellulært antigen prosessering potensielt fremstille en hvilken som helst mutasjon bærende epitop av 15 aminosyrer eller mindre. Hver gruppe av mus ble vaksinert med en av de 17 muterte peptider og 10 ug poly (I: C) i fire etterfølgende dager som tidligere beskrevet [56], etterfulgt av ytterligere fire daglige inokulasjoner tre uker senere. T-celle-responser ble evaluert ved IFN-γ ELISPOT. Dette vaksinasjon fremkalte sterke T-celle-responser til 29mer-peptider som koder for SIINFEKL, samt mutant Spas1, et godt karakterisert svulst neoantigen fra TRAMP-C2-tumormodell [57] (S1 Fig). Når den brukes til å målrette ID8-G7-tumor-spesifikke mutasjoner, vaksinering fremkalte T-celle responser til 11/17 mutante peptider (fig 2). For disse 11 muterte peptider, ble kryss-reaktivitet med villtype (WT) versjon av peptidet bestemt ved titrering av WT og muterte peptider i IFN-γ ELISPOT-analyser. For 4/11 mutasjoner, T-celler reagert på mutant og WT peptider i samme konsentrasjoner, noe som indikerer en høy grad av kryssreaktivitet (fig 3). For de resterende 7/11 mutasjoner, T-celler viste en 100 ganger høyere følsomhet for den muterte peptidet sammenlignet med WT peptidet. Intracellulær cytokin farging viste at 5/7 av disse svarene er involvert både CD4 og CD8 T-celler (fig 4), med CD4 T-celler dominerende svarene i 4/5 tilfeller. De resterende 2/7 Svarene ble formidlet av CD4 T-celler alene. Således, 7/17 (41%) av muterte peptider fremkalte en mutasjonsspesifikk T-celle-respons etter vaksinasjon, og de fleste reaksjoner ble dominert av CD4 T-celler. Disse syv mutasjoner ble avanserte til videre studier.
Mus (n = 3 pr gruppe) ble vaksinert daglig på dag 0-3 og 21-24 med mutant 29mer peptider (50 mikrogram, en peptid per gruppe) og poly (I: C) (10 ug). På dag 28 ble musene avlivet, og splenocytter (10
6 celler /brønn) ble stimulert i duplikat med mutante 29mer-peptider (20 ug /ml) eller media, og vurdert av IFN-y ELISPOT. Positive kontrollmusene ble vaksinert med en 29mer peptid (lang SIINFEKL) omfatter den kjente OVA
257-264 epitop. A. Elleve av 17 mutante peptider fremkalte robuste T-celle responser. Dots representerer reaksjoner i enkelte mus, og barer representerer gjennomsnittet for tre mus. Den stiplede linjen viser terskelen for positivitet (3 x maks bakgrunn for splenocytes i media alene bestemt post-hoc). B. Representant ELISPOT brønner fra 3 mus vaksinert med mutant Cul2 peptid og stimulert i to eksemplarer med mutant Cul2 peptid eller media alene.
Mus (n = 2 per gruppe) ble vaksinert som i figur 2. På dag 28 ble musene avlivet, og miltceller (5 x 10
5-celler /brønn) ble stimulert i duplikat med titrerte konsentrasjoner av mutant eller villtype 29mer-peptider i IFN-y-ELISPOT brønner. Prikker og barer representerer gjennomsnittet og rekke tiltak, henholdsvis.
Mus (n = 2 per gruppe) ble vaksinert som i figur 2. På dag 28, splenocytter ble høstet fra vaksinerte mus, inkubert over natten i medier som inneholder de angitte muterte peptider eller mediene alene, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Celler ble separert på levedyktighet og mangel på MHCII uttrykket (aktiverte murine T-celler er MHCII negativ). Prosentandelen av IFN-y-sekresjon CD8 og CD4 T-celler ble bestemt. A. Eksempel på en blandet T-cellerespons (CD8
toppen Hotell og CD4
nederst
) til mutant Dync1h1 29mer peptid versus media alene. B. Oppsummering av data for 7 muterte peptider og den positive kontroll peptidet lang SIINFEKL. Barer og prikker representerer gjennomsnitts og individuelle svar, henholdsvis.
Forebyggende og terapeutiske vaksiner av tumorbærende mus
For å teste om vaksine aktivert mutasjonsspesifikke T-celler kan indusere regresjon av ID8-G7 svulster, mus med tre dager gamle svulster ble vaksinert på fire påfølgende dager med individuelle mutant peptider og poly (i: C). Som forventet, 9/10 positive kontroll mus som gjennomgikk ACT med OT-jeg fulgte etter vaksinasjon med OVA og poly (I: C) forble tumorfrie 80 dager etter tumor implantasjon (fig 5a).
