Abstract
Vi her viser et nytt forhold mellom mennesket p14ARF oncosuppressor og MDM2 oncoprotein. MDM2 overekspresjon i ulike kreftcellelinjer fører p14ARF reduksjon indusere sin degradering gjennom proteasome. Effekten krever ikke ubiquitin ligase aktiviteten av MDM2 og fortrinnsvis forekommer i cytoplasma. Interessant, behandling med inhibitorer av PKC (Protein Kinase C) reaksjonsveien og bruk av p14ARF fosforylering mutanter viser at ARF fosforylering kan spille en rolle i MDM2 mediert degradering ARF forsterkende våre tidligere observasjoner om at ARF fosforylering påvirker dens stabilitet og biologisk aktivitet. Vår studie avdekker en ny potensielt viktig mekanisme som ARF og MDM2 kan motvirke hverandre under tumorigent prosessen
Citation. Vivo M, Matarese M, Sepe M, Di Martino R, Festa L, Calabrò V, et al. (2015) MDM2-mediert Nedbrytning av p14ARF: En ny mekanisme for å kontrollere ARF nivåer i kreftceller. PLoS ONE 10 (2): e0117252. doi: 10,1371 /journal.pone.0117252
Academic Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, TYSKLAND
mottatt: 23 juni 2014; Godkjent: 19 desember 2014; Publisert: 27 februar 2015
Copyright: © 2015 Vivo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Legge Regionale (Regione Campania) no 5/2007 til AP og GLM og Progetto «Campania Research in Experimental Medicine» (CREME). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kunnskap om mekanismene som styrer ubalanse mellom tumor dempere og onkogener, er avgjørende for å forstå patogenesen og utviklingen av kreft.
Blant de viktigste kreftdempere, p14ARF (mus p19ARF) (Alternativ Lese Frame) ser ut til å spille en viktig rolle, er dens direkte bidrag til kreft i stor grad vist i løpet av de siste årene [1,2].
ARF er involvert i onkogen sjekkpunkt ved sensibiliserende begynnende kreft celler til å gjennomgå vekst arrest eller apoptose. Det er økende bevis for at ARF signale er kompleks, og involverer p53-avhengige eller uavhengige trasé sikter hovedsakelig på besøksforbud unormal cellevekst og på å opprettholde genomisk stabilitet. Oppdagelsen av en mengde ARF interactors og den observasjon at også viral, gentoksisk, hypoksisk og oksidativt stress aktiverer en ARF respons, tyder på at ARF har en bredere rolle for å beskytte cellen [3]. Primære celler i normale forhold opprettholde ARF ved lave nivåer; imidlertid, når cellene blir stimulert av onkogene fornærmelser, dets konsentrasjon i cellen, øker drastisk. Dette fenomenet er vanligvis ledsaget av en parallell forstyrrelse av den hemmende interaksjonen mellom MDM2 og p53, noe som resulterer i akkumulering av transkripsjonelt aktive p53 som stimulerer enten apoptose eller cellesyklus-stans [4, 5]. Den sterke ARF effekt på celleproliferasjon krever at cellene skal ha utviklet mekanismer som raskt kan redusere ARF intracellulære nivåer når aktiviteten er ikke mer nødvendig. Imidlertid er de mekanismene som regulerer ARF omsetningen bare nylig kommer til å bli belyst. ARF nedbrytning er avhengig, i det minste delvis, på proteosomet og, selv om ARF mangler lysin-rester i sin sekvens, kan den gjennomgå N-terminale ubiquitinering uavhengig av MDM2 og p53 [6]. Ganske nylig, en bestemt ubiquitin ligase for ARF kalt ULF ble identifisert [7]. På den annen side er det bevis på at ARF kan nedbrytes
in vitro
av 20S-proteasomet i fravær av ubiquitinering, og at denne prosessen kan motvirkes ved TBP-1 (Tat Binding Protein 1), et multifunksjonelt komponent av regulatoriske subenhet av proteasome [8]. Videre har REG γ proteasome vært innblandet i ubiquitin-uavhengig regulering av p19ARF omsetning, støtter ideen om at ubiquitinering kan ikke nødvendigvis innblandet i ARF omsetning [9].
Interessant, vi og andre nylig vist at etter PKC (proteinkinase C alfa) aktivering, ARF nivåene øker [10, 11]. Videre er en punktmutasjon som mimicks fosforylering i den konserverte Thr8 induserer ARF opphopning hovedsakelig i cytoplasma og inhiberer den biologiske aktivitet [11].
Hittil synes ARF subcellulære lokalisering for å spille en viktig rolle i dets stabilitet og biologiske funksjoner, men i ikke utvetydig måte. Det ser ut til at nukleolært lokalisering av ARF kan tjene for sitt lagring eller stabilisering [12,13]. I nucleolus foruts ARF en stabil struktur takket være sin tilknytning til B23 /NPM, mens i nukleoplasma er det utsatt for en raskere omsetning. I noen tilfeller, er økningen i ARF nivåer fører til MDM2 å flytte til nucleolus [14, 15] og dette har vært knyttet til p53 stabilisering. Andre rapporterte at, selv om nukleolært lokalisering av ARF bevirker dens stabilisering, er det ikke nødvendig å regulere ARF aktivitet mot p53 [16, 17]. Interessant nok er det blitt rapportert at ikke-nukleolære former av ARF er utsatt for rask nedbrytning av proteasomet, med MDM2 spiller en rolle i modulering av dette fenomen, selv med mekanismer langt fra å være helt klarlagt, [18]. MDM2 har mangefasetterte roller i protein degradering. Faktisk, bortsett sine godt beskrevet rolle som E3-ubiquitin ligase, er MDM2 stand til shuttle p63 til cytoplasma medier sin interaksjon med proteiner spesielt involvert i omsetningen [19]. Videre MDM2 er blitt vist å mediere proteasom-avhengig men ubikvitin-uavhengig nedbrytning av p21Waf1 /Cip1 [20] og av Retinoblastoma protein [21]. Mer nylig har det blitt rapportert at MDM2 kan samhandler med komponenter av 19S proteasome [22] hevder et bredere syn på virkningsmekanismen. Vi her undersøke om en ny innbyrdes forholdet mellom ARF og MDM2 der MDM2 ser ut til å være innblandet i reguleringen av ARF omsetning formidling sin degradering gjennom proteasome.
Resultater
MDM2 overekspresjon fører p14ARF nedbrytning gjennom proteasome
for å analysere potensialet involvering av MDM2 i reguleringen av p14ARF protein stabilitet vi overexpressed en MDM2 uttrykk plasmid i ulike menneske- og musecellelinjer som er tilstede eller mangler påvisbare nivåer av p53 og /eller MDM2. Som fig. 1 viser, p14ARF endogene nivåer i både H1299 og HeLa-celler lineært avta når økende mengder av MDM2 ekspresjonsplasmid ble transfektert (fig. 1, A og B). Real-Time PCR-analyse på RNA hentet fra MDM2 transfekterte HeLa og H1299 celler viser ingen vesentlige endringer i den relative mengden av ARF mRNA (Fig. 1C) indikerer at MDM2 effekt oppnås ved post-transkripsjonsnivået. Videre MDM2 overekspresjon også resulterer i reduksjon av eksogent uttrykt ARF protein i en rekke humane og musecellelinjer (Fig. 1D, E og F) uavhengig av p53-status, som indikerer at MDM2 påvirker ARF proteinstabilitet i et p53-uavhengig måte. Viktigere, reduksjon av endogene MDM2 intracellulære nivåer av siRNA fører til en økning av ARF endogene nivåer i både HeLa og H1299-celler, noe som ytterligere bekrefter at endogen MDM2 kan styre p14ARF overflod (fig. 2). Vi undersøkte derfor ARF proteinstabilitet i nærvær eller fravær av MDM2 overekspresjon etter eksponering for cycloheximide for å blokkere proteinsyntesen. På de angitte tidspunkter etter eksponering for medikamentet, ble cellene høstet og ekstraktene ble analysert ved Western Blot. Fig. 3A og B viser at endogen p14ARF halveringstid senkes følgende MDM2 overekspresjon.
A H1299 celler var mock transfektert (første felt) eller transfektert med økende mengder MDM2 uttrykk plasmid (0.3-0.6-0.9 mikrogram). Effekt på p14ARF intracellulære nivåer ble vurdert ved Western Blot på hele protein lysatene probet med anti-ARF og, som kontroll, med anti-MDM2 og anti-actin. B HeLa-celler ble mock transfektert eller transfektert med MDM2 uttrykk plasmid (0,3-0,6 mikrogram) og analysert som i
A
. C Real Time relativ kvantifisering av ARF uttrykk i H1299 og HeLa celler. -Celler ble transfektert ved elektroporering med plasmid MDM2 (4×10
6 celler /2,5 ug av MDM2 ekspresjonsplasmid) og underkastet RNA-ekstraksjon og QRT-PCR-analyse. ARF RNA-nivåer ble normalisert forhold til 18s RNA. Verdiene i diagrammet representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Standardavvik er vist. D U2OS, E H1299 og F MEF p53
– /- MDM2
– /- celler som ble transfektert med en fast mengde p14ARF uttrykke plasmid (0,3 ug første felt) alene eller sammen med økende mengder av MDM2 uttrykkende plasmid (0,3 -0.6-0.9 mikrogram). Effekt på p14ARF nivåer ble vurdert ved Western Blot på hele protein lysatene, probet med anti-ARF eller anti-Xpress (for å påvise eksogent uttrykt ARF) og, som kontroll, med anti-MDM2 og anti-actin. Western Blot vist er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. ARF bandet intensiteter ble kvantifisert av Image J programvare, aktin normalisert og uttrykt som fold berikelse i forhold til ubehandlede prøvene vilkårlig satt til 1 (se Materialer og metoder for detaljer).
H1299 og HeLa-celler ble behandlet med enten MDM2 eller negativ kontroll rettet siRNA (10 nM endelig konsentrasjon), og etter 72 timer inkubasjon, samlet og analysert ved Western blot og og QRT-PCR som beskrevet i materialer og metoder.
En halv -Life analyse i nærvær eller fravær av MDM2 overekspresjon. HeLa-celler ble mock transfektert eller transfektert med MDM2 uttrykk plasmid (0,6 mikrogram). 24 timer etter, cykloheksimid ble tilsatt, og cellene ble høstet ved de indikerte tidspunkter. Lysater ble analysert ved hjelp av Western Blot med anti-ARF, anti-actin og anti-MDM2. B Plottet viser halveringstiden analyse av ARF i nærvær eller fravær av MDM2 overekspresjon. Band intensiteter ble kvantifisert av Image J programvare og aktin normalisert før de ble plottet i grafen. Mengden av protein ved forskjellige tidspunkter er uttrykt som prosent av totalt protein, dvs. proteinmengden ved t0. Hver profil representerer gjennomsnittet av tre uavhengige transfeksjoner og Western Blot eksperimenter. Standardavvikene er også vist. C U2OS-celler ble transfektert med en fast mengde p14ARF ekspresjonsplasmid (0,3 ug) og økende mengder av MDM2 ekspresjonsplasmid er angitt (0,3-0,6 ug). 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 10 uM MG132 (sporene 4-6) eller DMSO (sporene 1-3). Nivåer av p14ARF ble analysert ved Western Blot på hele protein lysates, analysert med anti-ARF, og som kontroll, med anti-MDM2 og anti-aktin.
neste spurt om proteasome er involvert i MDM2-mediert p14ARF degradering. For å utforske denne hypotesen, transfektert vi U2OS celler med et fast beløp på p14ARF og økende mengder av MDM2 og behandlede celler med proteasominhibitor MG132. Western Blot i fig. 3C viser konsekvent at behandling med proteasominhibitor motvirker MDM2 effekt, angir proteasome som den endelige effektor av MDM2 handlingen på ARF.
ARF nedbrytning av MDM2 krever protein-protein interaksjon
fysisk interaksjon mellom p14ARF og MDM2 har vært gjenstand for inngående studier og flere samvirkende domener har blitt identifisert i p14ARF som bidrar til bindingen til MDM2 [14, 17, 23, 24]. Derfor bestemte vi oss for å analysere hvilke områder av ARF er nødvendig for å observere MDM2 effekt på p14ARF. Dermed har vi gjort bruk av to forskjellige ARF delesjonsmutanter ARF
1-65, som omfatter ekson 1β av p14ARF og ARF
65-132, tilsvarende ARF exon 2. Co-immunoprecipitation i U2OS celler viste at ARF
1-65 mutant er i stand til å samhandle med MDM2 mens den beholder bare ekson 2 (ARF
65-132) er ikke (fig. 4A), bekrefter en viktig rolle ekson 1β i bindende MDM2 [23, 24]. De to ARF delesjonsmutanter ble deretter transfektert sammen med økende mengder av MDM2. Som fig. 4B og C viser tydelig den aminoterminale halvdel av p14ARF (ARF
1-65) vises nedbrutt av MDM2 overekspresjon, mens den C-terminale halvdel (ARF
65-132) ikke påvirkes, som støtter en rolle bindingen mellom proteiner i MDM2 mediert ARF degradering.
en U2OS celler ble transfektert med lik mengde (1 mikrogram) av MDM2 og enten 3xFlagARF
1-65 eller 3xFlagARF
65-132 uttrykke plasmider, som angitt. Like mengder protein ekstrakt ble immunopresipitert med anti-MDM2 antistoff og avslørt av Western Blot med anti-MDM2 og anti-Flag å avsløre ARF. B U2OS-celler ble transfektert med 0,3 pg av 3xFlagARF
1-65 (som uttrykker ekson 1β av p14ARF) (første felt) alene eller sammen med økende mengder av MDM2 ekspresjonsplasmid (0.3-0.6-0.9 ug). Nivåer av p14ARF ble analysert ved hjelp av Western Blot på hele protein lysatene, probet med anti-ARF og, som kontroll, med anti-MDM2 og anti-actin. C U2OS-celler ble transfektert med 0,3 pg av 3xFlag ARF
65-132 plasmid (som uttrykker exon 2 av p14ARF) (første felt) alene eller sammen med økende mengder av MDM2 ekspresjonsplasmid (0.3-0.6-0.9 ug). Nivåer av p14ARF ble analysert ved hjelp av Western Blot på hele protein lysatene probet med anti-ARF og, som kontroll, med anti-MDM2 og anti-actin. D U2OS celler ble transfektert med en mikrogram av både ARFΔ
2-14 /82-101 og MDM2 uttrykk plasmid som angitt. Like mengder av proteinekstrakt ble immunopresipitert med anti-ARF-antistoff og avdekket ved Western Blot med anti-MDM2 og anti-ARF. E U2OS celler ble transfektert med 0,3 mikrogram ARFΔ
2-14 /82-101 og økende mengder MDM2 uttrykk plasmid er angitt (0,6-0,9 mikrogram). Nivåer av endogene p14ARF ble analysert ved Western Blot på hele protein lysates probet med anti-ARF, og som kontroll, med anti-MDM2 og anti-aktin.
Videre analyserte vi kapasiteten MDM2 til indusere nedbrytning av en ARF sletting mutant (ARFΔ
2-14 /82-101) mangler atom /nukleolære lokaliseringssignaler [14]. Interessant, viser denne mutant en utbredt cytoplasmisk lokalisering [14] og beholder evnen til å binde (fig. 4D), og bli nedbrutt av MDM2 (fig. 4E).
Bortsett den vel etablerte rollen som en ubikvitin-ligase MDM2 kan påvirke protein omsetningen også gjennom en ubiquitin uavhengig mekanisme som induserer direkte sammenslutning av target proteiner med proteasome [22]. For å skille mellom disse muligheter, analyserte vi effekten av en MDM2 mutant som mangler de ubiquitin ligase ringfingeren domene (MDM2
1-441) (Fig. 5A) [25] på eksogent uttrykt ARF nivåer. Interessant nok er denne mutant i stand til å indusere ARF degradering når overuttrykkes (fig. 5B), noe som indikerer at MDM2 ubiquitin ligase domene av MDM2 er unnværlig for den observerte effekt på ARF. Deretter analyserte vi effekten av en MDM2 sletting mutant (MDM2Δ
150-230) (Fig. 5A) som, mangler både import (NLS) og eksport (NES) kjernelokaliseringssignaler, viser en utbredt cytoplasma lokalisering [25 ]. Når overuttrykt i U2OS celler, induserer denne mutant degradering av eksogent uttrykt ARF (fig. 5C) som indikerer at ARF degradering ikke krever MDM2 lokalisering i kjernen. Co-immunoutfellingsstudier forsøk tyder på at begge MDM2 mutanter er i stand til å binde ARF, forsterkende forestillingen om at bindingen mellom de to proteinene kunne spille en rolle i den observerte effekten (fig. 5D).
A Ordningen indikerer MDM2 mutanter som er beskrevet i denne figuren [25]. B U2OS celler ble transfektert med et fast beløp på p14ARF uttrykke plasmid (0,3 mikrogram) og økende mengder MDM2
1-441 uttrykker plasmid (0.3-0.6-0.9 mikrogram). Nivåer av p14ARF ble analysert ved hjelp av Western Blot på hele protein lysatene probet med anti-ARF og, som kontroll, med anti-MDM2 og anti-actin. C U2OS celler ble transfektert med et fast beløp på p14ARF uttrykke plasmid (0,1 mikrogram) og økende mengder MDM2Δ
150-230 uttrykker plasmid (0.5-1-1.5-2-2,5-3 mikrogram). Nivåer av p14ARF ble analysert ved hjelp av Western Blot på hele protein lysatene probet med anti-ARF og, som kontroll, med anti-MDM2 og anti-actin. D U2OS celler ble transfektert med lik mengde (1 mikrogram) av p14ARF uttrykke plasmid og MDM2
1-441 eller MDM2Δ
150-230 uttrykker plasmid. Like mengder protein ekstrakt ble immunopresipitert med anti-ARF antistoff og avslørt av Western Blot med anti-MDM2 og anti-ARF.
Den MDM2-mediert ARF nedbrytning skjer hovedsakelig i cytoplasma
bevis for at en MDM2 mutant, ute av stand til å lokalisere i kjernen, induserer ARF degradering, sammen med den observasjon at en ARF mutant viser en dominerende cytoplasma lokalisering (ARFΔ
2-14 /82-101) er utsatt for MDM2 -mediert degradering, føre til forslaget om at MDM2 indusert ARF degradering på MDM2 overekspresjon kan forekomme i cytoplasma. Dette fikk oss til å bekrefte evne MDM2 å degradere ARF i celler behandlet med Leptomycin B (LMB), kjent for å blokkere MDM2 skyt til cytoplasma [26]. For dette formål ble U2OS celler transfektert med en fast mengde av ARF behandlet eller ikke med Leptomycin B i nærvær eller fravær av ektopisk MDM2. Som vist på fig. 6A, Leptomycin B-behandling ikke bare bestemmer opphopning av ARF, men enda viktigere, motvirker MDM2 virkning på ARF, sterkt indikerer at tvunget atom MDM2 lokalisering hindrer dens evne til å påvirke p14ARF omsetning.
A U2OS-celler ble transfektert med 0,5 ug av ARF ekspresjonsplasmid alene (spor 1, 2) eller i kombinasjon med 1 ug av MDM2 ekspresjonsplasmid (sporene 3, 4). 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med Leptomycin B (kolonnene 1 og 3) eller metanol (kolonnene 2 og 4). Totale celleekstrakter er blitt underkastet Western Blot og analysert med anti-ARF, anti-MDM2 og anti-actin-antistoffer. B HeLa-celler ble transfektert med økende mengder av MDM2 ekspresjonsplasmid (1 og 1,5 ug). 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med enten DMSO, TPA eller Bisindolylmalemide og analysert med anti-ARF, anti-MDM2 og anti-actin-antistoffer i Western Blot. C HeLa-celler ble transfektert med PKCα siRNA eller negativ kontroll siRNA (siRNActrl). 48 timer senere ble cellene narretransfekterte eller transfektert med økende mengder av MDM2 uttrykkende plasmid hvor indikert (0,6 og 0,8 ug plasmid-DNA). Totalt celle-ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western blot med anti ARF, anti-MDM2 og anti-actin-antistoffer. D U2OS-celler ble transfektert med 0,3 ug av enten ARFT8A eller ARFT8D alene (først baner) eller i kombinasjon med økende mengder av MDM2 ekspresjonsplasmider (0.3-0.6-0.9 ug). 24 timer etter transfeksjon celle ekstrakter ble utsatt for Western Blot med anti ARF, anti-MDM2 og anti-aktin.
MDM2 mediert ARF nedbrytning hindres ved PKC aktivering.
Vi har nylig viste at TPA (en kjent aktivator av signaltransduksjon enzym PKCα) behandling resulterer i en økning av cytoplasmatiske ARF bassenget [11]. Her adressert vi om PKC aktivering kan påvirke MDM2-mediert ARF degradering. For dette formålet behandles vi HeLa-celler, transfektert med økende mengder av MDM2, med enten TPA eller Bisindolylmalemide (Bim, en inhibitor av PKC-aktivering). Fig. 6B viser at Bim behandling, som forventet, induserer en reduksjon av ARF. Interessant, MDM2 overekspresjon ytterligere senker ARF nivåer sammenlignet med kontroller. Motsatt TPA behandling hovedsakelig motvirker MDM2 indusert nedbrytning av p14ARF, noe som tyder på at PKC veien ikke skal aktiveres for å oppnå effektiv MDM2-mediert ARF degradering. For ytterligere analyse av PKC rolle i MDM2 mediert ARF degradering, ble U2OS-celler behandlet med enten PKC α spesifikk siRNA eller kontrollere siRNA og transfektert med økende mengder av MDM2 (Fig. 6C). Overekspresjon av MDM2 i SI-ctr utarmet celler induserer ARF degradering som forventet. Interessant, observerer vi en reduksjon av ARF nivåer på PKC uttømming i fravær av MDM2 overekspresjon (sammenlign felt 5 med spor 2). Dette er i samsvar med den observasjon at PKC aktivering induserer en økning på ARF protein nivåer og PKC inaktivering fører til en reduksjon av ARF nivåer (Vivo et al., 2013 og 6B fig.). Vi har faktisk observert at også MDM2 nivåer er negativt regulert av PKC utarming, (sammenlign kjørefelt 5 med spor 2). Viktigere, i samråd med våre tidligere eksperimenter, MDM2 overekspresjon i PKC utarmet celler kan likevel redusere ARF protein nivåer (sammenlign felt 5 med baner 6 og 7).
For å gå dypere inn i potensielle rolle ARF fosforylering i MDM2 mediert ARF degradering, har vi gjort bruk av to punkt mutanter, det ARFT8D og ARFT8A hvori treonin 8 har blitt erstattet, for å etterligne, henholdsvis, et fosforylert og et ikke-fosforylert form av ARF [11]. Interessant, defosforylert form av ARF (T8A mutant) er meget ustabil, med en relativt kort halveringstid, mens den T8D vises gående anriket i det cytoplasmatiske rommet [11].
Begge mutanter ble transfektert i celler sammen U2OS med økende mengder av MDM2. Interessant, vises det fosfo-mimetiske T8D mutant mer motstandsdyktig mot MDM2 mediert degradering, mens den T8A mutanten synes mer fornuftig til MDM2 virkning (fig. 6D og 1D), noe som bekrefter at fosforylering utøver en beskyttende rolle på ARF.
Dette resultatet hevet hypotesen om at den rådende nukleære lokaliserings av ARF (T8A og WT-proteiner) kan være et resultat av en effektiv klarering fra defosforylert, og således ustabilt, ARF protein fra cytoplasma. For å utforske denne hypotesen, ble U2OS celler transfektert med villtype eller mutante proteiner behandlet med MG132 og ARF subcellulære fordeling ble analysert ved immunfluorescens. Som vist i fig. 7A og B vi observerte, ved MG132 behandling, en konsekvent økning av ARF cytoplasmatisk farge i både WT og T8A transfekterte celler, noe som ytterligere antyder at ARF degradering prevalent forekommer i cytoplasma. Tilsvarende Western Blot av kjernefysiske og cytoplasmatiske ekstrakter av U20S celler, transfektert og behandlet som ovenfor, viser en konsekvent økning av både WT ARF og ARFT8A proteinnivåer i cytoplasma rommet på proteasomhemmingen (Fig. 7C).
En U2OS-celler ble transfektert med 1,5 ug av enten vekt eller mutanter ARF uttrykker plasmider. 16 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med enten DMSO eller 10 uM MG132 i 5 timer og underkastet IF med anti-ARF antistoff. Representative bilder som viser ARF og ARF mutanter subcellulære lokalisering i U2OS celler med eller uten MG132 behandling vises. Bilder ble tatt med et Nikon fluorescens mikroskop ved lignende eksponeringsforholdene. B Histogrammet, som representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, rapporterer prosentandelen av transfekterte celler som viser hver lokalisering mønster. Standardavvikene er også vist. C Western blot-analyse av like mengder av både cytoplasmiske (30 ug) og kjerne (6 pg) protein ekstrakter av transfekterte U2OS celler behandlet eller ikke med MG132. Effektivitet av cellefraksjonering ble sjekket med anti-Lamin A /C og anti-tubulin antistoffer. Normaliserte ARF bandet intensiteter, som vist nedenfor hver tilsvarende band, er uttrykt som fold berikelse i forhold til ubehandlede prøvene vilkårlig satt til 1 (se Materialer og metoder for detaljer).
Diskusjoner
betydningen av den funksjonelle interaksjonen mellom MDM2 og ARF kom ut fra den opprinnelige oppdagelse at ARF har potensial til å fungere som en tumor suppressor ved binding til og inhibering av p53 antagonist MDM2. Denne kunnskapen ble forsterket og videreutviklet gjennom årene selv med kontroverser for den rolle ARF nukleolært lokalisering i denne prosessen [16, 17, 27]. På den annen side, er betydningen av denne interaksjonen er klart fra den observasjon at inaktiveringen /dereguleringen av p53-MDM2-ARF aksen er viktig i utviklingen av de fleste humane cancere. Forbløffende nok MDM2 overekspresjon og p14ARF tap korrelerer med en mer aggressiv fenotype i primære humane lungesvulster underliggende en invers sammenheng mellom de to i humane tumorer [28]. På den annen side, tidligere observasjoner peker til en kontroversiell virkning av MDM2 handling på p14ARF: ble det vist at tap av MDM2 kan enten undertrykke [29] eller gjenopprette [14] evne til murin p19 ARF å indusere p53-uavhengig cellesyklus-stans . Således, avhengig av sammenhengen (celletyper, oppstrøms signaler, ekspresjonsnivået), kan MDM2 oppføre seg enten som en mediator eller inhibitor av p14ARF funksjon på celleproliferasjon [28]. Uansett, den første «oppgang» i vår måte å se på MDM2 /ARF forholdet kom ut fra den observasjon at en kort ARF mutant (aa2-29) dukket opp betydelig stabilisert seg etter å kneble av MDM2 eller overekspresjon av MDMX (en MDM2 relatert, forstyrrer protein), som fører til en modell hvor ARF binding til MDM2 fører, på en eller annen måte, dens selvmord fordi bringer seg selv til degradering ( «skyld ved assosiasjon modell») [18]. Vår studie godt passe inn med disse observasjonene viser at MDM2 intracellulær økning kan faktisk føre til ARF ødeleggelse av proteasome. Vi viser at fysisk interaksjon mellom ARF og MDM2 er nødvendig, men ikke tilstrekkelig for å observere effekten, som ARFT8D mutant er i stand til å samhandle med MDM2 [11], men er ikke degradert. Det faktum at regionen av interaksjon av MDM2 med MDMX (dvs. ringfingeren domene) er unnværlig for denne effekten antyder at, ja, er dette proteinet ikke involvert. På den annen side er den observasjon at ringfingeren /Ubiquitin ligase domene av MDM2 er unnværlig for å påvirke ARF nivåer, antyder at, selv om det ikke kan utelukkes formelt, er ARF ubiquitinering ikke påkrevet [8, 9]. På den annen side, Rodway et al. [18] postulerte en rolle MDM2 i formidling ARF levering til proteasome uten krav for ubiquitinering. Dette kan trolig være mediert av MDM2 direkte interaksjon med proteasome [22]. Spesielt har MDM2 blitt vist å interagere direkte med flere proteasomer subenheter gjennom både N-terminale og C-terminale regioner mens dens sentrale domenet (aa200-300) ser ut til å utøve et negativt regulerende kontroll på bindingen av [22]. Våre MDM2 mutanter (MDM2
1-441 og MDM2Δ
150-230) opprettholde i det minste en av de regionene som kreves for interaksjon med proteasomet og begge er i stand til å indusere ARF degradering. Forbløffende nok vi også observere en mer effektiv ARF reduksjon med MDM2Δ
150-230 mutant, som mangler det sentrale domenet.
Men som ARF ubiquitinering ikke har vært direkte adressert i denne studien, kan vi ikke utelukke intervensjon av ULF [7] eller en hvilken som helst annen ennå uidentifiserte ubiquitin ligase i den observerte effekten. Men mens ULF mediert ARF degradering vises utøves i nukleoplasma, ulike observasjoner i denne artikkelen tyder på at MDM2 effekten oppstår i cytoplasma. For det første, mutasjoner i både ARF og MDM2 som tvinger sin lokalisering i cytoplasma, ikke påvirke MDM2 mediert ARF degradering. Videre Leptomycin B-behandling, som hemmer MDM2 atom eksport, fører ARF akkumulering og motvirker MDM2 degradering effekt på ARF. Til slutt, immunfluorescens eksperimenter viser klart at MG132 behandling resulterer i en økning av ARF nivåer i cytoplasma, sterkt tyder på at, ja, grunnen til at ARF er vanligvis ikke påvisbar i denne subcellulære kammer befinner seg i en hurtigere omsetning.
Det må bemerkes at, siden den første oppdagelsen, ble ARF beskrevet med en utbredt Nucleo /nukleolært lokalisering. Følgelig har det blitt rapportert at en beskyttende rolle på ARF nivåer utøves i den kjerne av B23 /NPM. Dessuten forekommer interaksjon med TBP1, som beskytter ARF fra proteasomet nedbrytning, i kjernen [8].
I den senere tid ARF har blitt rapportert å lokalisere også i cytoplasma, selv om i hovedsak knyttet til mitokondriene, på grunn av sin rolle i autofagi [30]. Interessant nok har cytoplasmatisk farging p14ARF blitt beskrevet i noen krefttyper [28].
Til slutt har vi nylig rapportert at, etter aktivering av PKC, er ARF proteiner fosforylert og akkumuleres i cytoplasma [11].
Her viser vi at aktivering av PKC veien ved TPA motvirker MDM2 handling mens hemming av veien ved enten Bisindolylmalemide behandling eller PKCα rettet siRNA, fører til en reduksjon av ARF nivåer og forbedrer MDM2 mediert ARF degradering. Følgelig T8D ARF mutant som etterligner den fosforylerte status av proteinet, selv om mer til stede i cytoplasma, synes å være mindre sensitiv for MG132 behandling og til MDM2 overekspresjon. Disse data forsterke vår tidligere forslag om at fosforylering utøver en beskyttende effekt på ARF. Det ser ut til at mer enn en transkripsjons uavhengige mekanismer som er involvert i reguleringen av ARF protein, dvs. proteasomet mediert degradering [6-8] og fosforylering.
Samlet våre observasjoner fører til den hypotese at det i et onkogen miljø som MDM2 er overuttrykt, er ARF nivåer holdes lav på grunn av en rask omsetning skyldes MDM2 utløst degradering. Økende ARF nedbrytning og /eller fosforylering kan dermed være felles strategier som en celle orkestrere å raskt kunne unnslippe ARF vekst undertrykkelse funksjoner enten i fysiologiske forhold eller når cellene blir tvunget til å spre seg i løpet av kreft progresjon. Videre forsøk er nødvendig for å avklare de molekylære mekanismene som understreker disse observasjonene og deres relevans for kreftutvikling
in vivo
.
Materialer og metoder
konstruerer
pcDNARF , 3xFlag ARF
1-65, 3xFlagARF
65-132, ARFΔ
2-14 /82-101 ble beskrevet i [8]. pcDNAARFT8A og T8D plasmider ble beskrevet i [11]. pCMVMDM2 vekt, pCMVMDM2
1-441, pCMVMDM2Δ
150-230 ble beskrevet i [31].
Cellekulturer, transfections
U2OS, H1299, HeLa cellelinjer ble kjøpt fra Celle Lines Tilbud (CLS).
MEF
p53 – /- MDM2 – /-
cellelinjen ble beskrevet i [32]. Alle cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (Euroclone, Life Science) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% (volum /volum) CO2 i luft.
Celler ble transfektert bruker Lipofectamine 2000 (Livet Technology) [33] eller med RNAiMAX (Livet Technology) [34] i henhold til produsentens anbefalinger.
for forsøkene beskrevet i fig. 7C, U2OS celler ble transfektert ved elektroporering med Neon Transfeksjon System (Livet Technology) etter produsentens anvisninger.
