Abstract
Vi beskriver bruk av «SuperSelective» primere som muliggjør påvisning og kvantifisering av somatiske mutasjoner hvis tilstedeværelse vedrører kreft diagnose, prognose og behandling, i sanntid PCR-analyser som potensielt kan analysere sjeldne DNA-fragmenter som er tilstede i blodprøver (flytende biopsier). Utformingen av disse deoksyribonukleotid- primere inkluderer både en forholdsvis lang «5 «anker sekvens» som hybridiserer sterkt til å målrette DNA-fragmenter, og en meget kort, fysisk og funksjonelt separat, «3» fot-sekvens» som er perfekt komplementær til den muterte målsekvensen , men mistilpasninger villtype-sekvensen. Så få som ti muterte fragmenter med sikkerhet kan detekteres i nærvær av 1.000.000 villtype-fragmenter, selv når forskjellen mellom mutanten og villtype er bare et enkelt nukleotid polymorfisme. Multiplex PCR-analyser som anvender et sett av SuperSelective primere, og et tilsvarende sett med forskjellig fargede molekyl sjømerke sonder kan brukes i situasjoner hvor de forskjellige mutasjoner, selv om det forekommer i forskjellige celler, er plassert i samme kodon. Disse ikke-symmetriske sanntids multipleks PCR-analyser inneholde begrensede konsentrasjoner av hver SuperSelective primer, for derved å muliggjøre den samtidige bestemmelse av hver mutasjon overflod ved å sammenligne dens terskelverdi for å terskelverdien for en referansegenet er tilstede i prøven.
Citation: Vargas DY, Kramer FR, Tyagi S, Marras SAE (2016) Multiplex Real-Time PCR-analyser som måler overflod av ekstremt sjeldne mutasjoner assosiert med kreft. PLoS ONE 11 (5): e0156546. doi: 10,1371 /journal.pone.0156546
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 23 mars 2016; Godkjent: 16 mai 2016; Publisert: 31. mai 2016
Copyright: © 2016 Vargas et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. denne forskningen, ble det åpen tilgang gebyr for publiseringen av dette papiret, og lønningene til alle forfatterne av dette manuskriptet støttes av laboratoriets (Public Health Research Institute, Rutgers University) andel av inntekter fra ikke-eksklusiv lisensiering av molekylære beacons teknologi ved PHRI Properties, Inc., som er en nonprofit aksjeselskap heleid av Rutgers University. Verken PHRI Properties, Inc., eller noen av sine ca 75 molekylære fyrer rettighetshavere, hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. FRK ST, og SAEM motta royalties fra ikke-eksklusiv lisensiering av molekylære beacons teknologi ved PHRI Properties, Inc. de aktuelle lisensierte patenter i USA er: «påvisbart merket Dual Konformasjon oligonukleotidprober, analyser og Kits» 5,925,517; og «Nucleic Acid Detection prober som har ikke-FRET Fluorescence Quenching og Kits og tester, inkludert Slike prober» 6.150.097. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Det har vært en lang søkt lege mål å være i stand til å oppdage på et svært tidlig stadium ytterst sjeldne mutasjoner hvis tilstedeværelse i en klinisk prøve er nyttig for diagnostisering av kreft, bestemmelse prognose, og som angir valg av effektiv terapi [1]. Påvisning og kvantitativ vurdering av relevante somatiske mutasjoner har flere bruksområder, inkludert: (i) påvisning av kreft på en behandle stadium hos pasienter som arver gener som gjør kreft mer sannsynlig; (Ii) påvisning av mutasjoner i godartede kreftceller som tyder på at de nå kan metastasere; (Iii) måling av mengde av kreftceller under behandlingen; og (iv) bestemmelse med hensyn til om medikamentresistente kreftceller har oppstått i løpet av behandlingen, slik at behandlingen kan justeres. En ytterligere mål er å utvikle metoder som gjør multiplex analyser som samtidig kan måle overflod av ulike sjeldne mutasjoner. Dersom slike analyser skulle bli tilgjengelig, kan kreft potensielt bli konvertert fra en ofte dødelig sykdom til en kronisk tilstand som kan administreres av hyppig testing kombinert med individualiserte terapeutiske justeringer.
Spurring dette arbeidet på er erkjennelsen av at kreftceller, uansett hvor i kroppen de befinner seg, deles ofte, gjennomgår apoptose og nekrose, og som en konsekvens, genomiske DNA-fragmenter fra disse kreftceller er til stede i hver enkelt pasients blodplasma [2]. Denne forståelsen har åpnet opp muligheten for at nærværet av sjeldne mutasjoner som indikerer kreft diagnose, prognose og behandling kan påvises og kvantifiseres på et meget tidlig stadium, ved å utføre «flytende biopsier,» anvendelse av DNA isolert fra plasma [3-5] . Utfordringen analyse designere er å finne et middel for selektiv detektering og kvantifisering av disse sjeldne muterte sekvensfragmenter i plasma-DNA, på tross av tilstedeværelsen av tallrike villtypesekvensen fragmenter som stammer fra normale celler i hele kroppen, og til tross for det faktum at forskjellige relevante mutasjoner , skjønt opprinnelse i forskjellige celler, som ofte forekommer i samme eller tilstøtende kodoner. Suksessen med «neste generasjon» sekvensering for påvisning av sjeldne mutant sekvens fragmenter i plasma DNA [6-8], men komplisert og kostbart, har illustrert verdien av denne tilnærmingen.
Molecular diagnostiske analyser basert på eksponensiell amplifikasjon av nukleinsyre målsekvenser, for eksempel polymerase kjedereaksjoner, er billig og tilstrekkelig følsom til å generere signaler fra så lite som et enkelt templat molekyl. Utfordringen er å utforme disse analysene for å være svært selektiv, slik at de gjør det mulig eksponensiell amplifikasjon av muterte DNA-fragmenter, samtidig undertrykke generering av amplikonene fra mye mer rikelig villtype-DNA-fragmenter, selv om den eneste forskjellen mellom den mutante sekvens og villtypesekvensen er en enkeltnukleotidpolymorfi.
Interessante fremgangsmåter utnytter amplifiseringsprimere som er utformet for å være meget selektive. For eksempel nukleotidsekvensene til forsterker ildfast mutasjon apparatet (ARMS) primere [9] er helt komplementære til muterte målsekvenser, men inneholder en «utspørrende nukleotid» ved den 3 «enden som ikke er komplementær til det tilsvarende nukleotid i villtype målsekvenser. De resulterende feilaktige villtype-hybrider er mye mindre sannsynlighet for å muliggjøre syntese av amplikonene, fordi DNA-polymeraser krever en 3»-terminal basepar for å initiere syntese. Her er selektiv mekanisme enzymatisk. På den annen side, to priming-oligonukleotid (DPO) primere [10], MYT primere [11], hårnål primere [12, 13], og passerer primere [14], benytte en annen mekanisme. De også besitter en tennsekvens som er helt komplementære til en mutant mål, men inneholder en intern utspørrende nukleotid som ikke samsvarer med den tilsvarende villtype-sekvensen. Lengden av deres priming-sekvens er valgt slik at under varmebehandlingsbetingelser, perfekt komplementære mutante hybrider er sannsynlig å danne, og er derfor egnet til å føre til dannelse av amplikonene, mens feilaktige villtype hybrider er mye mindre sannsynlig til å danne, og er derfor mye mindre sannsynlig føre til generering av amplikonene. Alternative fremgangsmåter, som involverer PCR-klem [15] eller ved bruk av hårnål oligonukleotid blokkere [16], anvende en blanding som inneholder både konvensjonelle DNA-primere som binder til mutante sekvenser, og «anti-primere» som er utformet for å binde seg selektivt til vill -type sekvenser, for derved å hindre initieringen av villtype-fragment syntese. Men alle disse fremgangsmåter, selv om det generelt anvendelig for påvisning av mutante sekvenser, enten ikke er tilstrekkelig følsom til å påvise ekstremt sjeldne mutanter [12-15], som ikke er kompatible med real-time PCR på grunn av tilstedeværelsen av unaturlige nukleotider i deres sekvens [10], eller har ikke vist seg å aktivere kvantitative bestemmelser i multiplex real-time PCR-analyser når ulike målgrupper mutasjoner forekommer i samme kodon [9, 11, 16].
Denne rapporten beskriver eksperimenter som utforsker utforming og funksjon av «SuperSelective» PCR-primere som muliggjør kvantifisering av sjeldne mutante mål. Betydelig, når disse primere initiere syntese på muterte DNA-fragmenter, de resulterende amplikonene er eksponentielt forsterket med høy effektivitet i etterfølgende varmesykluser, og real-time data gi en vanlig måte for å vurdere den overflod av mutant maler i den opprinnelige prøven. I tillegg beskriver rapporten spesielle design for SuperSelective primere, og modifikasjoner i PCR-format, som gjør det mulig multiplex real-time PCR-analyser skal gjennomføres som måler overflod av ulike mutant mål sekvenser i forhold til overflod av et referansevill typesekvensen til stede i hver prøve.
Materialer og metoder
Grunning og molekylære beacons
SuperSelective primer sekvenser ble undersøkt ved hjelp av Mfold webserveren [17] og OligoAnalyzer dataprogram (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) for å sikre at under analysebetingelser de er usannsynlig å danne interne hårnål strukturer, og er usannsynlig å danne selv dimer eller heterodimerer med de konvensjonelle reverse primere. Primerne ble kjøpt fra Integrerte DNA Technologies; og de forskjellig fargede molekylære beacon prober for å detektere amplikonene ble kjøpt fra Biosearch Technologies (Petaluma, CA).
DNA maler
Plasmider som inneholder
EGFR
sekvenser (enten L858 mutante sekvens eller villtype-sekvensen) ble fremstilt ved å sette inn et 115-basepar-gen-fragmentet inn i en pGEM
®-11Zf (+) vektoren (Promega, Madison, WI). Sekvensene til disse plasmider ble bekreftet ved sekvensanalyse. Humant genomisk DNA som koder for
EGFR
L858R mutasjonen ble isolert fra cellelinje H1975 (CRL-5908, American Type Culture Collection, Manassas, VA) og humant genomisk DNA som inneholdt det tilsvarende villtype-sekvensen ble kjøpt fra Coriell Cell repositories (Camden, NJ). Mutanten og villtype
EGFR
plasmider, og de humane genomiske DNA ble spaltet ved inkubasjon med restriksjonsendonuklease Mse I (New England Biolabs, Ipswich, MA). Den 20 ul fordøyelse blandinger inneholdt 4 ug DNA og 10 enheter av Mse I, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, 100 ug /ml bovint serumalbumin og 10 mM Tris-HCl (pH 7,9). Disse reaksjonene ble inkubert i 120 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av inkubasjon i 20 minutter ved 65 ° C for å inaktivere endonuklease.
Plasmider inneholdende
BRAF
sekvenser (enten V600E mutant sekvens, den V600R mutant sekvens, eller villtype-sekvensen) ble anskaffet fra Integrated DNA-teknologi, og ble fremstilt ved å sette inn et 200-basepar-gen-fragmentet inn i pIDTSmart Amp vektorer.
BRAF
plasmider ble fordøyd ved inkubasjon med restriksjonsendonuklease Sca I (New England Biolabs). Den 20 ul fordøyelse blandinger inneholdt 4 ug DNA og 10 enheter av Sea I, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, 1 mM ditiotreitol, og 50 mM Tris-HCl (pH 7,9). Disse reaksjonene ble inkubert i 120 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av inkubasjon i 20 minutter ved 80 ° C for å inaktivere endonuklease.
PCR-analyser
Monoplex sanntids polymerase kjedereaksjoner ble utført i 30 ul volum inneholdende 50 mM KCI, 3 mM MgCl
2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 pM dGTP, 250 uM dTTP, 1,5 enheter AmpliTaq Gold-DNA polymerase (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 120 nM av hver primer, og 1x SYBR
® Grønn (ThermoFisher Scientific) for overvåking amplicon overflod under kjedeforlengelse stadium av hver termisk syklus.
Duplex real -Tid polymerase kjedereaksjoner ble utført i 30-ul volum inneholdende 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl
2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 250 pM dGTP, 250 uM dTTP , 1,5 enheter av Platinum Taq DNA polymerase (ThermoFisher Scientific), enten 500 nM (symmetrisk PCR) eller 60 nm (ikke-symmetrisk PCR) av hvert
BRAF
SuperSelective primer, 1000 nM av den konvensjonelle
BRAF
vanlig revers primer, og 300 nM av hver molekyl lykt for overvåking av overflod av hver type fragment under glød fasen av hver termisk syklus.
Triplex sanntids-polymerase kjedereaksjoner inneholdt de samme reagenser så dupleks reaksjoner, bortsett fra at de inneholdt 60 nM av hver
BRAF
SuperSelective primer, 60 nM av
EGFR
SuperSelective primer, 1000 nM av den konvensjonelle
BRAF
felles revers primer, og 500 nM av den konvensjonelle
EGFR
revers primer. Vi utnyttet
EGFR
villtype plasmider som referanse genet mål i disse modell triplex analyser, siden de var tilgjengelig i vårt laboratorium.
Alle presiseringer ble utført i 200-ul hvit polypropylen PCR rør (USA Scientific, Ocala, Florida) i en IQ5 spektrofluorometriske termosykler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Reaksjonsblandingene ble inkubert i 10 minutter ved 95 ° C for å aktivere AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (monoplex reaksjoner) eller ble inkubert i 2 minutter ved 95 ° C for å aktivere platina Taq DNA-polymerase (multipleks reaksjoner), etterfulgt av 55 eller 60 sykluser bestående av 95 ° C denaturering i 20 sekunder, 60 ° C gløding i 20 sekunder og 72 ° C kjedeforlengelse i 20 sekunder.
Resultater
SuperSelective primere er oligodeoksyribonukleotider som har som funksjon i en PCR-analyse er blitt delt i to deler [10, 14, 18]. Funksjonen til effektivt å binde seg til et gen av interesse er tildelt en relativt lang 5′-sekvens segment (som vi kaller «anker»), og funksjonen til selektivt å binde seg til en nærliggende subsekvens innenfor det genet som inneholder mutasjonen av interesse, og deretter initiere syntesen av et amplikon, er tilordnet en separat, kort 3 «sekvens segment (som vi kaller «fot»). Foten inneholder en «utspørrende nukleotid» som er komplementær til det tilsvarende nukleotid i mutanttargetsekvensen, men ikke samsvarer med det tilsvarende nukleotid i villtype-target-sekvensen. I SuperSelective primere, er ankeret skilles fra foten av en ekstra, relativt lang, deoksyribonukleotidsubstratet sekvens segment (som vi kaller «bro»). Broen er valgt slik at det sikres at det ikke danner sekundære strukturer og er ikke komplementære til de «mellomliggende sekvens» i malen molekylet som forbinder ankeret målsekvensen til foten målsekvensen. Følgelig, når primeren blir hybridisert til et mal-molekyl, broen sekvens i primeren og det intervenerende sekvens i malen danne en enkelt-trådet «boble» som funksjonelt skiller effektiv dannelse av ankeret hybrid fra dannelsen av foten hybrid . De resulterende primere er bifunksjonelle: Under varmebehandlingsbetingelser, det lange 5 «gjør det mulig for ankeret sekvens primeren å bindes effektivt og selektivt til den genomiske regionen av interesse er til stede i de target DNA-fragmenter, mens den korte 3»-fot-sekvens (som besitter den utspørrende nukleotid ), fordi den er forankret til ankersekvensen av broen sekvens, er i stand til å danne en svak (perfekt komplementær) hybrid med mutanten målsekvensen; men på grunn av sin korte lengde, er usannsynlig å danne en vesentlig svakere (umake) hybrid med det tilsvarende villtype-sekvensen foten.
Figur 1A viser et eksempel på en SuperSelective primer er bundet til dets mutant målsekvens. Denne spesielle primer er designet for å selektivt forsterke DNA-fragmenter som inneholder
BRAF
V600E enkeltnukleotidpolymorfi, hvis tilstedeværelse i celler predisponerer pasienter til arvelig nonpolyposis tykktarmskreft [19, 20]. Vi refererer til denne primer som «
BRAF
V600E 24-14 /14-5: 1: 1″, som indikerer at ankeret sekvensen er 24 nukleotider lang, er broen sekvens 14 nukleotider lang (over fra en intervenerende sekvens i malen som også er 14 nukleotider langt), og foten sekvensen er 7 nukleotider lang, med det forespørrende nukleotid som ligger på den nest siste posisjon fra primeren er 3 «enden.
(A) SuperSelective primer
BRAF
V600E 24-14 /14-5: 1: 1 inneholder en lang 5′-anker sekvens som binder sterkt til mal tråder, en kort 3′-fots sekvens som inkluderer et avhør nukleotid som er perfekt komplementær til det tilsvarende nukleotid i en mutant templat (men ikke samsvarer med den tilsvarende nukleotid i en vill-type mal), og en bro sekvens som forbinder ankeret sekvensen til foten sekvens, og som er valgt til å være komplementære til den tilsvarende intervenerende sekvens i templatkjeden, for derved å danne en enkelt-trådet boble som skiller funksjon av ankeret fra funksjonen av foten. (B) Real-time PCR-analyser som syssels SuperSelective primer
BRAF
V600E 24-14 /14-5: 1: 1. Seks reaksjoner initiert med 10
6
BRAF
villtype maler pluss ulike mengder av mutant maler (10
1, 10
2, 10
3, 10
4 10
5 og 10
6) er plottet i blått; en reaksjon initiert med bare 10
6 villtype malene er plottet med en stiplet oransje linje; og en kontrollreaksjon som ikke inneholdt templat-DNA er plottet i rødt. (C) Terskelen syklusen måles for hver reaksjon som inneholdt mutant-malene er plottet som en funksjon av logaritmen av antall mutante maler opprinnelig tilstede i hver reaksjon. Den stiplede oransje linjen viser terskelen syklus av reaksjonen som bare inneholder vill-type maler.
Real-Time PCR-analyser som inneholder SuperSelective primere
Real-Time PCR-analyser ble utført, hvis eneste forskjell fra en konvensjonell real-time PCR assay var erstattet av den konvensjonelle fremover primer med
BRAF
V600E SuperSelective forover primer vist i fig 1A. Disse monoplex analyser inneholdt en konvensjonell revers primer som var til stede i samme konsentrasjon som den SuperSelective primer. Åtte 30 pl PCR-analyser ble fremstilt. Syv av reaksjonene inneholdt DNA-fragmenter fra 10
6 plasmider som innehar
BRAF
villtypesekvensen og DNA-fragmenter fra enten 10
6, 10
5, 10
4, 10
3, 10
2, 10
1 eller 0 plasmider som innehar enkeltnukleotidpolymorfi i
BRAF
V600E mutant sekvens. En åttende reaksjon som ikke inneholdt DNA-fragmenter som tjente som en kontroll. Alle reaksjoner inneholdt DNA interkalerende fargestoff, SYBR
® Green, hvis fluorescens intensitet under kjedeforlengelse fasen til hver termisk syklus reflekterer antall amplikonene syntetiserte.
Figur 1B viser resultatene av dette eksperimentet . Kontrollen reaksjon som ikke inneholdt templat-DNA ga ingen falske amplikonene som primer-dimerer, til tross for den lengre lengden av SuperSelective primere. Reaksjonsblandingen som inneholdt 1.000.000 villtype-maler og ingen mutant maler ble undertrykket i en slik grad at det ikke fremstille et betydelig antall amplikonene til ca 50 sykluser med amplifikasjon hadde blitt gjennomført. Men de seks reaksjoner initiert med 1.000.000 villtype maler og forskjellige antall mutant maler tok betydelig færre sykluser med amplifikasjon for å generere et betydelig antall amplikonene. Når terskelsyklusen (Ct) på hver av disse seks reaksjonene ble plottet mot logaritmen av antall mutante malene i hver reaksjon, ble resultatet en rett linje (figur 1C). Denne inverse lineært forhold mellom logaritmen av antall mutante mål opprinnelig var til stede i en prøve, og den Ct-verdi observert for at prøven er kjennetegnet av kvantitative eksponentielle amplifikasjonsanalyser [21, 22]. Betydelig, Ct-verdien fra prøven som inneholdt 10 mutant maler i nærvær av 1.000.000 villtype maler var lett kan skilles fra det Ct-verdien som genereres av prøve inneholdende bare 1000000 villtype-maler (vist i figuren som en stiplet orange linje) .
i disse analyser, forekommer det selektive trinnet når en SuperSelective primer er bundet til et DNA (-) tråd mal som er til stede i den opprinnelige prøven som analyseres. Når foten sekvensen av en primer SuperSelective initierer syntese av et amplikon, er hele sekvensen til primeren SuperSelective (inkludert «kunstig» bro sekvens) innlemmet i den (+) fragment. I etterfølgende varmesykluser, blir de resulterende amplikonene forsterkes effektivt på vanlig måte, med hele SuperSelective primer-sekvens som tjener som en lang konvensjonell primer som er fullstendig komplementær til (-) amplikonene, som omfatter komplement av tennsatsen bro sekvens på plass av de mellomliggende sekvens som var tilstede i den opprinnelige malen (fig 2)
den selektive trinnet oppstår bare når en SuperSelective primer hybridiserer til en DNA. (-) templat-fragment som er tilstede i prøven. På grunn av den lille størrelsen på foten sekvens, er sannsynligheten for initiering av en (+) amplikon er betydelig større dersom målsekvensen av foten i (-) mal fragmentet er et helt komplementær mutant sekvens, enn hvis targetsekvensen av foten i (-) mal fragment er et umake villtypesekvensen. Når (+) amplikon syntese forekommer, deretter ble den resulterende (+) amplikon tjener som et templat for en konvensjonell revers primer, og er effektivt kopiert i løpet av den neste termiske syklus, genererer en (-) fragment hvori komplementet av den unike broen sekvens som var til stede i SuperSelective primer er substituert for det intervenerende sekvens som var tilstede i den opprinnelige (-) mal fragment. Som et resultat, i etterfølgende varmesykluser, er hele SuperSelective primer-sekvens som er komplementær til (-) amplikon tråder, og eksponentiell amplifikasjon oppstår effektivt, og kan følges i sanntid
Optimalisering av. utformingen av SuperSelective primere
de tre delene av en SuperSelective primer tjener forskjellige funksjoner. 5′-sekvens ankeret er konstruert slik at den er lang nok og sterke nok slik at ved glødetemperaturen for PCR assay det bindes til målsekvensen, uavhengig av hvorvidt eller ikke målsekvensen er mutant eller villtype. Den korte 3′-fot-sekvens, på den annen side, er utformet for å være i stand til å binde seg til fullstendig komplementære mutant target-sekvensen ved glødetemperaturen for PCR-analyse, men ikke å binde seg til den feilaktige villtype sekvens under de samme betingelser . Rollen til boblen, som dannes av broen sekvens i primeren og det intervenerende sekvens i malen, er todelt: (i) ved å skille forankringssekvensen fra foten sekvens, nærværet av det enkelt-trådede boble bevirker dannelsen av den svake foten hybrid å forekomme uavhengig av hverandre fra dannelsen av den sterke anker hybrid; og (ii) ved å forankre foten sekvens i primeren til potensialet målsekvensen i malen, er sannsynligheten for at den korte sekvens fot (6, 7 eller 8 nukleotider i lengde) vil faktisk danne en hybrid økes markert. En frittflytende sekvens av størrelsen på foten vil praktisk talt aldri danner et hybrid med en targetsekvens i henhold til PCR-varmebehandlingsbetingelser. For bedre å forstå rollen spilt av de forskjellige sekvenssegmenter SuperSelective primere, og for å forstå hvordan man best skal utforme disse primere, slik at de er meget selektive for hvilken som helst gitt target-sekvensen, gjennomførte vi en serie av modell analyser som utforsket optimal design av foten sekvens, og optimal design av boblen.
den villtype sekvens der
BRAF
V600E mutasjon oppstår er aT rik (3′-TAAAGTG-5 «), og dermed sikre at den svake feilaktige hybrid som den danner med foten av
BRAF
V600E 24-14 /14-5: 1: 1 SuperSelective primer er svært lite sannsynlig å danne under annealing forholdene i PCR-analyse [23], som fører til betydelige undertrykkelse av villtype-amplikon syntese (figur 1). Men når vi gjennomført lignende undersøkelser med en SuperSelective primer utviklet for å oppdage enkeltnukleotidpolymorfi i
EGFR
L858R mutant sekvens, hvis tilstedeværelse i ikke-småcellet lungekreft spår motstand mot tyrosinkinasehemmere [ ,,,0],24, 25], fant vi at dens tilstedeværelse i en GC rik villtypesekvensen (3′-ACCCGAC-5 «) resulterte i mindre undertrykkelse av villtype-fragment syntese. Det ble derfor gjennomført en rekke eksperimenter med forskjellig
EGFR
L858R SuperSelective primer design (fig 3) for å optimalisere diskriminering mellom mutant sekvens og sin nesten identisk villtypesekvensen.
Brua sekvens innenfor hver SuperSelective primer er vist i blått, og avhører nucleotide i hver fot sekvens er vist i rødt.
EGFR
L858R primere er ordnet i grupper som reflekterer deres komparative eksperimenter.
BRAF
V600E målsekvens er 69 basepar lang;
EGFR
L858R målsekvenser er mellom 79 og 87 basepar lang, avhengig av SuperSelective primeren som blir anvendt; og
EGFR
T790M målsekvens er 68 basepar lang.
Effekt av varierende lengde av foten sekvens
Vi har utforsket effekten av å forkorte lengden av SuperSelective primer fot sekvens for å overvinne den høyere sannsynlighet for at foten vil danne et hybrid med GC-rik sekvens som er tilstede i
EGFR
villtype-mål. Vi har utført tre sett av bestemmelser, hvert sett ved bruk av en SuperSelective primer hvis sekvens var fot 6, 7 eller 8 nukleotider i lengde. I alle andre henseender er utformingen av primerne var det samme: (i) det forespørrende nukleotid var plassert på den nest siste posisjon på 3′-enden av hver fot; (Ii) ankeret sekvensen var 24 nukleotider lang; og (iii) broen sekvensen og intervenerende sekvens ble hver 14 nukleotider lang. Sekvensene av disse tre primere (
EGFR
L858R 24-14 /14-6: 1: 1;
EGFR
L858R 24-14 /14-5: 1: 1, og
EGFR
L858R 24-14 /14-4: 1: 1) er vist i figur 3. Hvert sett av PCR-analyser ble initiert med forskjellige mengder av mutant templat (10
6, 10
5, 10
4, 10
3, 10
2, og 10
1 kopier) i nærvær av 10
6 kopier av villtype-mal. De resulterende Terskelverdiene er plottet som en funksjon av logaritmen av antall mutante maler opprinnelig tilstede (figur 4A).
lineariteten av forholdet mellom terskelsyklusen og logaritmen av den første rekke mutant maler til stede i reaksjoner som inneholder 10
6 villtype maler og ulike mengder av mutant malen ble bestemt for PCR-analyser initiert med forskjellige SuperSelective primer design. (A) PCR reaksjoner innledet med
EGFR
L858R SuperSelective primere som innehar fot sekvenser av forskjellig lengde. (B) PCR reaksjoner innledet med
EGFR
L858R SuperSelective primere som danner symmetriske bobler av forskjellig omkrets.
Ct-verdiene oppnådd med primer inneha kortest fots lengde (seks nukleotider, 4: 1: 1) alle fall på en rett linje, noe som viser at selv om
EGFR
målsekvens er GC rik, så få som 10 mutant maler kan kvantifiseres uten innblanding fra 1.000.000 villtype maler som var til stede. Primere som innehar lenger fots lengde (syv nukleotider, 5: 1: 1, eller åtte nukleotider, 6: 1: 1), førte imidlertid til et avvik fra lineariteten når de mutante målene er mest sjeldne, på grunn av utilstrekkelig undertrykkelse av amplikon syntese av de rike villtype maler. Disse resultater viser at kortere fots lengde, skjønt senke likevekt overflod av foten hybrider, noe som resulterer i lengre forsinkelser før terskelen syklusen er oppnådd, fører til forbedret selektivitet. Fra et termodynamisk synspunkt, er på grunn av den høyere andel av likevekts overflod av perfekt komplementære mutante hybrider foten i forhold til likevekts overflod av umake villtype fot hybrider forbedret selektivitet ved kortere fots lengde.
Effekt av varierende plasseringen av den utspørrende nukleotid
Vi undersøkte også virkningen av å variere plasseringen av det utspørrende nukleotid i foten sekvens på primeren evne til å diskriminere mutant maler fra villtype-maler. Vi har utført en rekke PCR-analyser hvor seks forskjellige SuperSelective primere ble anvendt, som hver innehar en utspørrende nukleotid ved en annen posisjon innenfor en 7-nukleotid lange fot sekvens. Lengdene av ankersekvens, bro-sekvens, og intervenerende sekvens ble opprettholdt ved 24, 14 og 14 nukleotider, respektivt. Sekvensene til disse seks
EGFR
L858R primere er vist i figur 3. To reaksjoner ble utført med hver primer, en initiert med 1.000.000 kopier av mutant templat, og en initiert med 1.000.000 kopier av villtype-mal. Terskelen sykluser som ble observert, er oppført i tabell 1. Resultatene viser at vinduet av diskriminering (ΔCt) mellom terskelen syklus for mutanten og terskelen syklus for villtypen er bredest når plasseringen av den utspørrende nukleotid er nærmest 3′-enden av primeren. Fordi det er kun en liten forskjell i ΔCt mellom primeren som avhører nukleotid var plassert ved 3′-enden av foten (ΔCt = 18,8), og primeren som avhører nukleotid var plassert på den nest siste posisjon fra 3′-enden av fot (ΔCT = 18,2), konkluderer vi med at plassering av avhør nucleotide enten posisjon fungerer godt. Siden det forespørrende nukleotid ved den nest siste posisjon fra 3′-enden av foten ikke danner et basepar med det tilsvarende nukleotid i vill-type-sekvensen under PCR-varmebehandlingsbetingelser, er meget lite sannsynlig at det 3′-terminale nukleotid av foten for dannelse av et basepar med den tilsvarende komplementære nukleotid i villtype-sekvensen.
effekt av varierende omkretsen av boblen
Vi undersøkte også virkningen av å variere omkretsen den enkelt-trådede boble som funksjonelt skiller ankeret hybrid fra foten hybrid (se figur 1).
