Abstract
Identifikasjon av CD8
+ T-celle epitoper som kan indusere T-celler til drepe tumorceller er et grunnleggende trinn for utvikling av et peptid kreftvaksine. Pote-proteinet er et nylig identifisert kreft antigenet som ble funnet å bli uttrykt i en rekke forskjellige humane kreftformer, inkludert prostata, tykktarm, lunge, bryst, eggstokk og bukspyttkjertel. Her bestemmes vi HLA-A2.1 begrenset cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) epitoper i pote protein, og også designet forbedrede epitoper av aminosyre (AA) erstatninger. Fem 9-mer peptider ble først valgt ut og deres bindingsaffinitet til HLA-A2-molekyler ble målt ved T2-bindingsanalysen. Pote 272-280 og pote 323-331 viste den sterkeste HLA-A2 bindende affinitet. AA-substituerte peptider Pote 252-9V (med valin i posisjon 9), Pote 553-1Y (med tyrosin i posisjon 1) og Pote 323-3F (med fenylalanin i posisjon 3) overdratt høyere affinitet for HLA-A2, og induserte CTL-responser kryssreaktivt med vill-type-antigener. Mens pote 252-9V var den sterkeste i denne sammenheng, hadde pote 323-3F den største økningen i immunogenisitet sammenlignet med villtype. Viktigere, to modifiserte epitoper (pote-553-1Y og pote-323-3F) induserte CTL som drepte NCI-H522, en pote-uttrykker HLA-A2
+ human ikke-små kreftcellelinje celle lunge, noe som indikerer naturlig endogen behandlingen av disse epitopene. Som konklusjon kan immunogenisiteten til Pote epitoper forsterkes ved peptid modifikasjon for å indusere T-celler som dreper humane kreftceller. En kombinasjon av Pote 553-1Y og pote 323-3F epitoper kan være en attraktiv vaksine strategi for HLA-A2 kreftpasienter til å overvinne toleranse indusert av svulster og hindre rømning
Citation. Huang YH, Terabe M, Pendleton CD, Stewart Khursigara D, Bera TK, Pastan jeg, et al. (2013) Identifisering og forbedring av HLA-A2.1-Restricted CTL epitoper i et nytt menneske Cancer Antigen-pote. PLoS ONE 8 (6): e64365. doi: 10,1371 /journal.pone.0064365
Redaktør: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, USA
mottatt: 22. januar 2013, Akseptert: 13. april 2013, Publisert: 04.06.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dr. Yi-Hsiang Huang ble støttet av Taiwan Merit stipend (TMS-094-2-B-015) og NCI utført finansiering fra NCI Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, Maryland, USA; og med midler fra Taipei Veterans General Hospital (V97S5-002, V100C-104 og V101C-147). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De fleste kreftformer ikke kan curatively resected unntatt når oppdages tidlig. Andre kirurgiske tilnærminger, for eksempel radioterapi eller kjemoterapi, også påvirke normale celler og fører til bivirkninger som begrenser behandling. I tillegg har alle behandlinger for residiverende eller metastatisk kreft er palliativ. Derfor, utvikling av nye systemiske tilnærminger til å behandle avansert, residiverende eller metastatisk kreft er nødvendig. Immunterapi kan ha stort potensiale som en lovende behandling for kreftpasienter på grunn av sin spesifisitet og frihet fra toksiske effekter av kjemoterapi. Siden sipuleucel-T ble den første kreftvaksine lisensiert i USA [1], [2], det har blitt kraftig fornyet interesse for kreftvaksiner [3] – [5]. Således nye tumor-antigener som er spesifikke for visse krefttyper er av stor interesse.
CD8
+ CTL kan gjenkjenne og spesifikt drepe tumorceller som uttrykker peptider fra tumorassosierte antigener presentert av MHC klasse I molekyler. Derfor er de fleste aktuelle kreft immunterapi strategier fokusere på induksjon av CTL at Lyse kreftceller [6]. Antigen-spesifikk immunterapi kreft ofte er avhengig av identifiseringen av epitoper uttrykt av kreftceller som kan brukes som mål for CD8
+ T-celler. Men de naturlige CTL-epitoper av kreft er ikke alltid optimal fordi den CTL repertoaret mot høy-affinitets-epitoper er ofte toleriserte [7]. Epitop forsterkning, ved hjelp av modifikasjon av AA-sekvens av epitoper, ble utviklet for å forbedre effektiviteten av vaksiner i første rekke ved å øke affiniteten av peptider for MHC-molekyler [3], [8]. Peptid vaksiner har nylig vist betydelige løftet i kliniske studier [9].
Oppdage tumorspesifikke antigener er kritisk til utviklingen av effektive kreft immunterapi [5]. Nylig har et nytt tumor-assosiert antigen, Pote, ble identifisert fra en rekke humane cancere [10], [11]. Denne tumor-antigen er kalt Pote fordi det var til å begynne med funnet å bli uttrykt i normal prostata, ovarie, testikler og morkake vev, så vel som i prostata kreft [10]. Den pote genfamilien ble funnet spredt blant åtte forskjellige kromosomer (2, 8, 13, 14, 15, 18, 21, og 22) med forskjellig lengde av mRNA [12]. Ikke desto mindre er det Pote cDNA-sekvensen blant forskjellige kromosomer svært homogen med divergensen mindre enn 10% [11]. Etterfølgende studier viste at Pote-genene ble uttrykt ikke bare i prostata cancer, men også i et bredt spekter av humane maligniteter, inkludert bryst, tykktarm, lunge, eggstokk og bukspyttkjertel [11]. Det finnes forskjellige mønstre for ekspresjon av Pote i normale vev og kreft [11]. Blant de ulike kreftformer, de pote paraloger på kromosom 2 (pote-2γ) er den hyppigst uttrykt.
Fordi pote mRNA er synlig bare i et begrenset antall normale menneskelige vev (prostata og testikkel i den mannlige, og eggstokk og placenta i den kvinnelige), er pote protein regnes som et medlem av kreft-testis antigen familie [11]. Ekspresjon av kreft-testis antigener i placenta eller testis bør ikke føre til T-celleaktivering på grunn av den meget lave ekspresjon av MHC klasse I-molekyler i disse vev [13], [14]. For kreftpasienter, noen reaktivitet mot prostata eller brystvev er akseptabelt, som heller ikke er vitale vev. Videre, for brystkreft eller prostata kreftpasienter, prostata i den mannlige og bryst i den kvinnelige burde vært kirurgisk reseksjon eller bestrålt. Bekymringene til autoimmun reaksjon i begge vev ville ikke være et hinder i behandlingen av livstruende kreft. Derfor bør pote antigen være et attraktivt mål for immunterapi av disse kreftformene.
I denne studien, vi først bestemt HLA-A2-bundne epitoper fra pote (2γ), og deres immunogenicities ble testet i AAD transgen mus som har en kimære MHC klasse i molekyl består av a1 og a2 domener fra HLA-A2 og α3 domene fra D
d [15]. Deretter forbedret vi deres binding til HLA-A2.1 molekyler ved epitop ekstrautstyr for å gjøre epitopene mer immunogene, uten å miste evnen til spesifikke CD8
+ T-celler til å gjenkjenne villtype-epitopen i betydelig grad. Til slutt fikk vi bekreftet de modifiserte epitoper induserte CTL som drepte humane kreftceller.
Materialer og metoder
Dyr
AAD mus [15] uttrykker en kimære HLA-A2.1 transgenet med a1 og a2-domener fra HLA-A2.1 og α3 domene fra H-2D
d, for å tillate binding til mus CD8, på en C57BL /6 bakgrunn, ble anvendt i disse forsøkene. Deler av eksperimentene ble gjentatt i hhd-2 mus (en gave fra Dr. Francois Lemmonier, Institut Pasteur), som uttrykker kimære human HLA-A2.1 med den kovalente human β2m, uten noen murin-klasse I-molekylet [16] – [ ,,,0],18]. Mus ble avlet og plassert i passende dyr institusjoner. Alle prosedyrer med dyr ble utført i samsvar med institusjonens godkjente protokoller.
Peptider
Peptider i denne studien ble syntetisert på en modell Symphony Peptide Synthesizer (Perkin-Elmer, Boston, MA) ved hjelp av konvensjonelle fluorenylmetoksykarbonyl (f-MOC) kjemi og spaltet fra harpiksen med trifluoreddiksyre. Renheten og molare konsentrasjon ble analysert ved revers fase høy-ytelse væskekromatografi på en C18-kolonne ved anvendelse av en gradient av 0,1% trifluoreddiksyre i vann og 0,1% trifluoreddiksyre i acetonitril og ytterligere renset ved preparativ reversfase-væskekromatografi ved å bruke en tilsvarende stigning.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
T2 cellelinje er mangelfull for TAP1 og TAP2 transportørproteiner og uttrykker lave nivåer av HLA-A2 [19]. Den C1R.AAD cellelinjen er avledet fra human B lymfoblastoid cellelinje HMYC1R transfektert med det kimære HLA-molekyl som inneholder a1 og a2-domener fra human HLA-A2.1 og α3 fra mus H-2D
d, en gave fra dr . V. Engelhard (University of Virginia, Charlottesville, VA) som tidligere beskrevet [15]. Den C1R.A2.1 cellelinje (en gave av Dr. William Biddison, ninds, NIH) er også avledet fra HMYC1R transfektert med HLA-A2.1 [20], [21]. C1R.AAD og C1R.A2.1 celler ble holdt i komplett medium bestående av 10% FCS-RPMI 1640, 1 mM natriumpyruvat, ikke-essensielle aminosyrer (Biofluid, Rockville, MD), 4 mM glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 50 mM 2-ME. NCI-H522 (pote
+ /HLA-A2
+) ble opprettholdt i fullstendig medium. HTB-19 (Pote
+ /HLA-A1
+) ble holdt i Eagles minimum essensielt medium (EMEM) med 5% FCS. MDA-MB-231 (Pote
– /HLA-A2
+) ble opprettholdt i 10% FCS-DMEM
T2 bindingsanalyse
Peptide bindingskapasiteten til den.. HLA-A2-molekylet ble målt ved hjelp av T2-cellelinje i henhold til en protokoll som er beskrevet tidligere [19], [22]. T2-celler (3 x 10
5-celler /brønn) ble inkubert over natten i 96-brønners plater med dyrkningsmedium (01:01 blanding av RPMI 1640 /Eagle-Hanks aminosyre inneholdende 2,5% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) med 10 ug /ml β2-mikroglobulin (Sigma) og forskjellige titrert konsentrasjoner av peptider (som starter fra 100 uM med to-ganger seriefortynning) som vist i figurene for å bestemme konsentrasjonen som gir en 50 % økning i binding (se nedenfor). Cellene ble vasket en gang med kald HBSS inneholdende 0,1% BSA og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med anti-HLA-A2.1 monoklonalt antistoff (klon BB7.2) (1:40 fortynning av hybridomsupernatant). Etter vasking ble cellene farget med FITC-merket geite-anti-mus-immunoglobulin (BD, San Jose, CA), og nivået av HLA-ekspresjon ble målt ved flow-cytometri. HLA-A2-ekspresjon ble kvantifisert som fluorescens indeks (FI) i henhold til følgende formel: FI = (geometrisk midlere fluorescensintensitet med peptid – geometrisk midlere fluorescensintensitet uten peptid) /geometrisk midlere fluorescensintensitet uten peptid. Bakgrunnsfluorescens uten BB7.2 ble subtrahert for hver enkelt verdi. For å sammenligne de forskjellige peptider, FI
0,5, peptidet konsentrasjonen som øker HLA-A2.1 ekspresjon ved 50% i forhold til ikke-peptid kontroll bakgrunn, ble beregnet ut fra titreringskurven for hvert peptid. Det bør bemerkes at FI
0,5 gir et relativt mål på peptid tilhørighet eller potens blant peptider sammenlignet side ved side, men kan ikke tas som en termodynamisk affinitet.
Vaksinasjoner
AAD eller HHD-2 mus ble immunisert sc i bunnen av halen med 100 ul av en emulsjon inneholdende 01:01 ufullstendig Freunds adjuvans (Sigma) og PBS med peptider og cytokiner (50 nmol av CTL-epitopen, 50 nmol av hepatitt B virus kjerne 128-140 hjelper epitop, 5 ug mus interleukin-12, og 5 ug av muse granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor). Cytokiner ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Mus ble forsterket 2 uker senere, og milten ble fjernet 2 uker etter boost. For alle forsøk ble grupper på tre mus brukt
interferon-y ELISPOT-analysen
Tallene for IFN-y-utskillende celler ble bestemt ved en ELISPOT-kit (Mouse IFN-gamma ELISPOT SixPak.; R D, Minneapolis, MA) eller ved et sett med anti-mus IFN-γ belegg (an18) og oppdager (R4-6A2) monoklonale antistoffer (Mabtech) i henhold til produsentens instruksjoner. To uker etter den siste immunisering ble miltcellene sådd ut på antistoff-belagte plater ved 200.000, 100.000 og 50.000 celler /brønn og stimulert med 200.000 peptid-pulset naive miltceller /brønn med angitte konsentrasjon av peptider i 2 timer. Etter inkubering over natten ved 37 ° C ble platene vasket, og detektering av antistoff ble tilsatt. En ELISPOT-blå farge modulen (R R
