Abstract
Makrofager er celler med mange viktige funksjoner i både medfødte og ervervede immunresponser og har vist seg å spille en kompleks rolle i tumorprogresjon siden de havna både svulsten hindrer (M1 makrofager) og tumor fremme ( M2 makrofager) aktiviteter. I mange humane kreftformer, har infiltrerende makrofager vært assosiert med en dårlig prognose pasient, og derfor foreslått å være i hovedsak av en M2 fenotype. Imidlertid har vi og andre tidligere vist at øket makrofag tetthet i kolorektal cancer (CRC) i stedet er korrelert med en forbedret prognose. Det er et interessant spørsmål om de ulike rollene spilles av makrofager i ulike kreftformer kan forklares med variasjoner i balansen mellom M1 og M2 makro attributter, drevet av tumor- eller organspesifikke faktorer i svulsten mikromiljøet av individuelle kreft. Her benyttet vi en
in vitro
cellekultur system av makrofager, differensiering for å sammenligne forskjeller og likheter i fenotype (morfologi, antigen-presentasjon, migrasjon, endocytose, og uttrykk for cytokin og chemokin gener) mellom M1 /M2 og kreft aktivert makrofager (TAM), som kan forklare den positive rollen som makrofager i CRC. Vi har funnet at utskilling av faktorer fra CRC-celler indusert TAMs av en «mixed» M1 /M2 fenotype, noe som igjen kan bidra til en «god inflammatorisk respons». Dette tyder på at omskolering av makrofager kan tillate for viktige terapeutiske fremskritt i behandlingen av kreft hos mennesker
Citation. Edin S, Wikberg ML, Rutegård J, Oldenborg PA, Palmqvist R (2013) Fenotypisk forvrenger av Makrofager
In vitro
av utskilt Faktorer fra kolorektal kreft celler. PLoS ONE 8 (9): e74982. doi: 10,1371 /journal.pone.0074982
Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia
mottatt: 12 mars 2013; Godkjent: 13 august 2013; Publisert: 18.09.2013
Copyright: © 2013 Edin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra det svenske Kreftforeningen (www.cancerfonden.se) (Grant ingen CAN 2011/839, Palmqvist.); Vetenskapsrådet (Grant ingen B03488901, Palmqvist.) (Www.vr.se); Cutting-Edge stipend fra fylkesrådet Västerbotten, Sverige (Grant ingen VLL-132981, Palmqvist.); Cancer Research Foundation i Nord-Sverige (Grant ingen AMP 10-655, Edin.) (Www.cancerforskningsfonden.se); og Tore Nilssons Foundation (Edin) (www.torenilssonsstiftelse.nu). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
svulstens mikromiljø spiller flere komplekse og viktige roller i tumorprogresjon [1]. I løpet av det siste tiåret har en Hovedfokus i kreftforskning vært på viktigheten av den inflammatoriske svulstens mikromiljø, som senere har ført til inkludering av tumor-fremme betennelse og immununndragelser som nye kjennetegnene til kreft [2]. En økt forståelse av immun contexture – dvs. plassering, tetthet og funksjonell orientering av immunceller, og hvordan dette påvirker tumorprogresjon kan gi viktige verktøy for prediksjon av pasientens prognose samt utvikling av nye behandlingsstrategier [3]
arbeidet med betennelse i human cancer har resultert i identifikasjon av komponenter i immunsystemet som kan være både gunstig og skadelig for pasienten prognose. En slik komponent er makrofagene i det medfødte immunsystemet. Makrofager er vist å være meget plast celler som kan vise både svulsten hindrer (M1 makrofager) og kreft fremme funksjoner (M2 makrofager) anmeldt i [4], [5]. I korte trekk, klassisk aktiverte M1 makrofager støtte adaptive immunrespons og målrette smittestoffer og ødelagte eller endrede celler. De er kjennetegnet ved en økt ekspresjon av antigen-presenterende molekyler (f.eks MHC klasse II), kostimulerende reseptorer på lymfocytter (f.eks CD86 og CD40), så vel som et antall av pro-inflammatoriske cytokiner (f.eks IL6, IL12, IL23 og TNF-alfa), og er rapportert å ha microbicidal og tumorici-dal aktivitet. Alternativt aktiverte M2 makrofager er engasjert i sårheling og i vedlikehold av vev homeostase og rengjøring i hjemmet og uttrykke høye nivåer av mønstergjenkjenning reseptorer (f.eks Mannose reseptor (MR) og scavenger reseptorer (f.eks CD163). Men mange av funksjonene til M2 makrofager kan faktisk være pro-tumorigen ettersom de stimulerer cellulær proliferasjon, vev-omforming, angiogenese og utvikling av et immunsuppressivt miljø ved sekresjon av immunundertrykkende cytokiner (f.eks IL10 og TGFp), som kan anvendes ved en voksende tumor til å invadere omgivende vev og spre seg til fjerntliggende organer [6]. M1 og M2 makrofager har forskjellige kjemokin profiler, som fører til selektiv rekruttering av immunceller, f.eks forskjellige delmengder av T-lymfocytter. Mens M1 makrofager hovedsakelig uttrykker CXCL9 og CXCL10 som rekruttere lymfocytter av T helper type 1 (Th1) og cytotoksiske (TC) undergrupper, M2 makrofager i stedet primært rekruttere lymfocytter av regulatorisk fenotype (treg) og T helper type (Th2) undergrupper etter utskillelsen av kjemokiner CCL17, CCL22 og CCL24 [4], [5 ], [7]. Makrofager kan også være differensiert i ulike M2-lignende funksjonelle tilstander, som har blitt dokumentert både
in vitro Hotell og
in vivo
, anmeldt i [4]. I virkeligheten er varianter av makrofager med forskjellige M1 eller M2 egenskaper synes å være uendelig. M1 og M2 makro fenotyper bør derfor ses på som ekstreme funksjonelle tilstander i et spekter av makro phentoypes [8]. Imidlertid kan M1 og M2 klassifisering likevel brukes til å identifisere de viktigste fenotype og funksjoner av forskjellige makrofag-populasjoner. Makrofag fenotypen styres av hendelser i svulsten mikromiljøet i hvilket den er funnet. Eksempler på makropolariserende hendelser er sekresjon av tumor avledet mediatorer, hypoksisk eller nekrotiske faktorer og vevsskade [9]. Makrofag fenotypen er også påvirkes av andre immunceller og stromale komponenter.
I humane krefttyper, har makrofagin ofte blitt korrelert til en dårligere prognose og dermed tumorassosierte makrofager er blitt foreslått for å være i hovedsak av en M2 fenotype [10] – [12]. Dette er imidlertid ikke tilfelle i alle kreftformer. I kolorektal cancer (CRC), har vi og andre vist at et høyt antall tumor-assosierte makrofager er korrelert til et forbedret prognose [13] – [17]. Vi har videre undersøkt fordelingen av M1 og M2 makro fenotyper i CRC. Vi fant at antallet M1 og M2 makrofager ble høyt korrelert. Pasienter med høyt antall infiltrere M1 makrofager, hadde også et høyt antall infiltrere M2 makrofager, og en betydelig bedre prognose [18]. Tatt i betraktning den høye plastisitet av makrofager, kan en mulig forklaring for den blandet populasjon av M1 og M2 makrofager sett i CRC være enten at tumor utskilt faktorer i CRC har potensial til å utløse eller opprettholde M1 makrofag egenskaper, eller at de ikke kjører M2 makrofag differensiering i samme grad som i andre kreftformer hvor makrofag infiltrering er klart ugunstig for pasienten prognose.
Her har vi brukt et
in vitro
cellekultursystem for å sammenligne fenotypen (og funksjoner) av tumor aktiveres makrofager (TAM) i CRC til at de etablerte M1 og M2 makro fenotyper å få en bedre forståelse av hvordan makrofagen fenotype påvirkes av kreft skilles faktorer og hvordan dette kan påvirke pasientenes prognose. Vi fant at utskilling av faktorene fra CRC cellene induserte ikke en komplett M1 eller M2 makrofag respons, men i stedet TAMs av en «blandet» M1 /M2 fenotype. Videre, selv om M1 og M2 makrofager ble funnet å være lett re-edjucated i motsatt retning, utskilte faktorer fra CRC-celler var ikke i stand til skew som allerede er tilstede M1 M2 makrofager mot makrofager, men i stedet ut til å forsterke M1 fenotype. Sammen, kan dette bidra til å skape en «god betennelsesreaksjon» hvor svulstundertrykkende funksjoner av makrofager blir dominerende.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Humanmonocytter var hentet fra buffy strøk av anonyme friske blodgivere som hadde gitt sitt samtykke skriftlig (i henhold til lokale retningslinjer på Blood sentrum, Umeå universitetssykehus). Ifølge den lokale forskningsetiske komité (Regional Etisk Review Board i Umeå, Sverige) er etikk godkjenning ikke nødvendig å studere leukocytter isolert fra buffy coats innhentet fra anonyme blodgivere (DNR 2012-327-31M).
Cell kultur
CRC-cellelinjer RKO, SW480 og Caco2 (ATCC) ble dyrket i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 37 ° C med 5% karbondioksid. Kondisjonert media fra CRC-cellelinjer ble fremstilt ved vasking av cellene i fosfatbufret saltvann (PBS), hvoretter cellene ble dyrket til tilnærmet 90% konfluens i RPMI supplert med 10% FBS og antibiotika i 48 timer. Kondisjonert medium ble samlet opp, sentrifugert ved 3000 rpm i 30 minutter og lagret i -80 ° C fryser inntil bruk. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble renset fra blod donor buffy coats ved dekstransedimentering og Fiqoll-Paque-gradient sentrifugering. Monocytter ble videre renset fra PBMC enten ved 1,5 timer med adhesjon etterfulgt av 2 vaskinger i varm PBS supplert med 5% FBS, eller ved magnetisk-aktivert cellesortering (MACS) i henhold til fabrikantens instruksjoner (Miltenyi Biotec) som resulterer i en populasjon av monocytter med ca. 95% renhet. Rensede monocytter ble dyrket i RPMI med 10% FBS og antibiotika supplert med 20 ng /ml M-CSF, med mediet byttet annenhver dag. På dag 6 ble monocytter stimulert ytterligere i 40 timer ved tilsetning av 100 ng /ml LPS og 20 ng /ml IFNy (for M1 makrofager), eller 20 ng /ml IL4 eller IL10 (for M2 makrofager). For tumor aktivert makrofag undergrupper, monocytter var på dag 6 inkubert i tumor kondisjonerte medium supplert med 20 ng /ml M-CSF i 40 timer. Celler ble høstet og underkastet videre analyse. De differensierte makro fenotyper ble evaluert for hver buffy coat av flowcytometrisk analyse av uttrykk for M1 og M2 typiske markører. Celledød (apoptose /nekrose) ble kontrollert med flowcytometri ved hjelp Annexin V /PI farging (Abcam) som anbefalt av produsenten. EtOH ble tilsatt ved en konsentrasjon på 5% i 30 minutter som en positiv kontroll for celledød.
For morfologisk undersøkelse 8 x 10
6 rensede mononukleære celler pr brønn ble sådd ut i 6-brønners kulturplater, ytterligere renset ved adhesjon, og differensiert i forskjellige makrofag populasjoner som beskrevet ovenfor. Live-fotografering ble tatt med DeltaPix Invenio 3S montert på en Leitz Diavert mikroskop.
flowcytometrisk analyse
Surface markør uttrykk ble analysert ved flowcytometri (BD FACS Calibur Flowcytometer) ved hjelp av R-fysoerytrin (R-PE) konjugert monoklonalt antistoff mot CD14 (klon M5E2, BD Pharmingen) og CD1a (klon HI149, ImmunoTools); Fluorescein (FITC) konjugert monoklonalt antistoff mot CD86 (klon FUN-en, BD Pharmingen), HLA-DR (klone MEM12, Abcam) og CD40 (klon 5C3, BD Pharmingen); Allofykocyanin (APC) konjugert monoklonalt antistoff mot Mannose reseptor (MR) (klon 15-2, Biolegend) og CD163 (klon 215 927, R BD Biosciences) i 500 pl RPMI-kulturmedium med 10% FBS og tillates å følge i 3 timer. Deretter ble dyrkningsinnsatser plassert i kondisjonert medium fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC-celler eller RPMI cellekulturmedium inneholdende 10% FBS og inkubert i 24 timer. Etter vask i PBS, ble innsatsene anbragt i iskald metanol i 1 minutt og vasket på nytt i PBS. Cellene fester seg til innsiden av innsatsen ble skrapt av med en bomullsdott, og cellene på utsiden ble farget med 0,5% Coomassie-blått. Etter vasker i PBS, ble filteret kuttet ut og cellene ble telt i tre tilfeldig utvalgte felt og vises som gjennomsnitt antall trekkende celler /felt.
cytokin og chemokin PCR Array
genuttrykket profiler av de forskjellige makro populasjoner ble undersøkt med Cytokiner Kjemokiner PCR Array (PAH-150A, SABiosciences) i henhold til produsentens anbefalinger. Kort fortalt ble totalt RNA isolert fra forskjellige cellepopulasjoner ved hjelp av NucleoSpin® RNA II kit (MACHEREY-NAGEL). 1 ug total RNA ble behandlet med DNase og cDNA ble fremstilt ved bruk av RT
2 First Strand kit. For hver analyse, ble cDNA prøvene blandet med RT
2 qPCR Master mix og distribuert over PCR rekke 96-brønners plater og syklet med real-time PCR (ABI 7900HT, Applied Biosystems). Forsterkning data (fold-endringer i C
t verdier av alle gener) ble analysert med SABiosciences programvare.
statistikker
Statistisk signifikant forskjell ble vurdert ved hjelp 2-tailed studenter menn
t
test. En
p
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Tallene viser et gjennomsnitt av 3 uavhengige eksperimenter, med mindre annet er angitt. Feilfelt angir standardavvik (SD).
Resultater
For å få en bedre forståelse for hvordan svulsten som sådan påvirke fenotype og funksjon av makrofager i CRC, vi har brukt en
in vitro cellekultur
modell for å studere interaksjoner mellom differensiert perifere blodmakrofager og CRC-cellelinjer. I en
in vitro
omgivelser, kan den klassisk aktivert M1 makrofag fenotype oppnås ved å utsettes for TLR ligander såsom LPS og Th1 typisk cytokin IFNy. Alternativt aktiverte M2 makrofager skille i microenvironments rike på Th2 typiske cytokiner (f.eks IL4 og IL13) og er noen ganger referert til som sårtilheling makrofager. Som svar på immunundertrykkende cytokiner (f.eks IL10) makrofager vedta et M2-lignende immunregulerende fenotype [4], [8].
Verifisering av M1 og M2 Makrofage pasient
Purified monocytter ble differensiert til heftende makrofager ved stimulering med cytokiner M-CSF i en uke og ytterligere differensiert ved tilsetning av LPS og IFNy (for M1), og IL4 eller IL10 (for M2 makrofager). Som vist i figur 1A, M1 makrofager, generelt, viste en mer rund morfologi mens M2-makrofager var mer langstrakt. Makrofager drevet i nærvær av M-CSF alene viste også en avlang morfologi mer likner M2 fenotype, selv om mindre uttalt at det for de forskjellige populasjoner av M2 makrofager. Ser inn flere detaljer om morfologi, IL4 stimulert M2 makrofager viste størst forlengelse, med spesielt lange utstikkere (Figur 1a). IL10 stimulerte makrofager var mer lik den M-CSF stimulerte makrofager, med unntak av å være litt mer vedheftende. For å utelukke at de morfologiske forskjellene sett mellom M1 og M2 makrofager var ikke på grunn av økt apoptose eller nekrose, analyserte vi bindingen av Annexin V til celleoverflaten fosfatidylserin og samt propidium jod (PI) opptak, henholdsvis. Som vist i figur 1B, de forskjellige makrofag fenotyper inneholdt rimelig lave nivåer av apoptotiske og nekrotiske celler, respektivt. Når man ser på ekspresjonen av M1 eller M2 typiske markører ved flowcytometri, ble M1 makrofager vist å uttrykke høye celleoverflate nivåer av MHC klasse II-reseptor-HLA-DR, så vel som T-celle kostimulerende reseptorer, CD86 og CD40, men lavere nivåer av de typiske M2 markører, CD163 og MR (figur 1C). M2 makrofager i stedet uttrykte høye nivåer av CD163 og MR, samtidig viser lav uttrykk for M1 markører (figur 1C). De to M2 populasjoner kan videre være preget av at IL4 stimulerte makrofager viste høyere uttrykk av MR, mens IL10 stimulerte makrofager uttrykte høyere nivåer av CD163 (figur 1C). Videre ble alle makro subtyper funnet typisk å uttrykke monocytt /makrofag markør CD14 (figur 1C). CD1a, markør for dendrittiske celler monocytic opprinnelse, ble ikke uttrykt av noen av de makro populasjoner (data ikke vist).
(A) Morfologisk evaluering av makro fenotyper. (B) Apoptose og nekrose av makrofag populasjoner ble evaluert ved farging med Annexin V og PI, henholdsvis, fulgt av strømningscytometri. Vist er prosent nekrotiske /apoptotiske celler (gjennomsnitt ± SD) fra tre uavhengige forsøk. (C) Uttrykk for ekstracellulære markører for makro bestander som vurderes av farging og flowcytometri. Relativt gjennomsnittlig flourescense intensitet (MFI) ± SD fra tre eller flere uavhengige eksperimenter er vist, hvor hver prøve ble normalisert mot sin respektive isotypekontroll. Relevante statistisk signifikante forskjeller er angitt med * (p 0,05) ** (p 0,01), eller *** (p 0,001), ikke-signifikant
p
verdier er angitt med ns
Migrasjon av M1 og M2 Makrofager
for å undersøke om kreft skilles faktorer på noen måte fortrinnsvis rekruttere makrofager av en viss fenotype, vi så på den vandrende evne til M1 og M2 makrofager i en
in vitro
celle migrasjon analysen. Vi fant at M1 makrofager hadde svært lav trekkende evne til RPMI-medium kontroll, mens M-CSF stimulerte makrofager og M2 migrerte mer i retning av medium alene (figur 2). Når slik at ulike subpopulasjoner av makrofager til å migrere mot kondisjonert medium fra RKO eller SW480 CRC cellelinjer, fant vi at fortrinnsvis IL4 stimulert M2 makrofager viste økt migrasjon mot kreft betinget media, noe som tyder på at kreft skilles faktorer helst rekruttere makrofager av et sårhelende fenotype (Figur 2).
Migrering av makrofag-fenotyper ble evaluert ved Boyden kammer eksperimenter, hvor makrofager ble tillatt å migrere mot kondisjonert medium fra RKO eller SW480 CRC-cellelinjene, eller kulturmedium kontroll (RPMI + 10% FBS) . Gjennomsnittlige antallet migrerende celler (n) ± SD er vist. Relevante statistisk signifikante forskjeller er angitt med * (p 0,05), ikke-signifikant
p
verdier er angitt med ns
fenotypen til Tumor aktiverte makrofager (TAM),
morfologien og celleoverflate-fenotype av TAMs differensiert i nærvær av kondisjonert medium fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC-cellelinjer ble analysert i figur 3A og B, respektivt. TAMs ble forlenget, og dermed morfologi mer lignet at av M2 makro populasjoner (sammenligne figur 3A og 1A). Når du ser på uttrykket av M1 og M2 spesifikke celleoverflatemarkører, ble TAMs også funnet å dele flere likhetstrekk med M2 makrofager (Figur 3B). Imidlertid TAM fenotype var ikke så markert som den for M2-makrofager, siden høy ekspresjon av enten MR (som i IL4 stimulerte makrofager M2) eller CD163 (som i IL10 stimulerte makrofager M2) ble ikke generelt sett. Unntaket var makrofager aktiveres av kondisjonert medium fra SW480 celler, som viste en høy ekspresjon av MR lik den til IL4 stimulerte makrofager (M2 figur 3B). Disse dataene derfor foreslå at SW480 celler kan forskyve makrofager mot en uttalt M2 fenotype, mens RKO eller Caco2 celler induserer ikke store endringer i M-CSF stimulerte makrofager, i alle fall ikke endringer som ble oppdaget her.
( A) Morfologisk evaluering av makrofager stimulert med kondisjonert medium (cm) fra RKO, SW480 eller Caco2 cellelinjer. (B) Ekspresjon av ekstracellulære markører ble evaluert ved immunfarging og flowcytometri i makrofager fra M1 og M2 undertypen eller i makrofager stimulert med kondisjonert medium (CM) fra CRC-cellelinjer. Relativt gjennomsnittlig flourescense intensitet (MFI) ± SD fra tre eller flere uavhengige eksperimenter er vist, hvor hver prøve ble normalisert mot sin respektive isotype kontroll og med M-CSF-stimulert kontrollprøve som angitt 1.
endocytose kapasitet M1 /M2 Makrofage populasjoner og TAMs
endocytic funksjonen til de ulike undergrupper av M1 og M2 makrofager, samt TAMs, ble også undersøkt i vår
in vitro
cellekultur system . Celler ble differensiert i de forskjellige macrophage fenotyper, og overvåket for sin evne til å endocytose fluorescensmerkede dekstran. M1 makrofager ble vist å ha en lavere endocytiske evne sammenlignet med M2-makrofager, omtrent 20% for M1 sammenlignet med 50-100% av M2 makrofager, med IL10 stimulerte makrofager M2 som viser den høyeste endocytiske evne (figur 4). For å undersøke hvordan kreft skilles faktorer påvirker makrofag endocytose, vi sammenlignet det av M1, M2 og TAMs (figur 4). Denne analysen viste at endocytose av FITC-dekstran av TAMs mer lignet som M2 makrofager.
Endocytose av M1 og M2 makrofager, eller makrofager stimulert med kondisjonert medium (cm) fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC cellelinjer ble evaluert ved å måle internalisering av FITC-dekstran ved strømningscytometri. Vist er prosent relativ endocytose (gjennomsnitt ± SD) med endocytose av IL10 stimulert M2 makrofager satt som 100%. Statistisk signifikante forskjeller er angitt med * (p 0,05) eller ** (p 0,01). Alle andre forskjeller ble testet, men fant ikke signifikant (ikke indikert i figuren).
Macrophage Plastisitet
Makrofager er kjent for å være plast celler, vedta ulike former avhengig av faktorer i miljøet i hvilken de er funnet. Ved analyse av plastisitet i
in vitro
cellekultursystem, ble M1 og M2 makrofager faktisk funnet å være meget plastisk av natur, ettersom differensierte M1 makrofager kan bli drevet mot en M2 fenotype, og vice versa, som evaluert av morfologiske undersøkelser og uttrykk for M1 og M2-typiske makro markører (figur 5). Morfologi M1 makrofager som fikk M2 stimuli ble vist å bytte til en mer langstrakt M2 utseende (figur 5A), selv om ikke helt. På den annen side M2 makrofager som syntes å raskere adoptere den runde morfologi M1 makrofager når den utsettes for de motstående stimuli (figur 5A). Ved å analysere ekspresjon av M1 og M2 markører, en forskyvning mellom fenotyper var også tydelig, ettersom M1 typiske markører ble funnet å være nedregulert ved M2-stimuli og vice versa (figur 5B). Det er foreslått i litteraturen at TAMs blir fordreid av kreft skilles faktorer mot en M2 fenotype [10] – [12]. Dette ble imidlertid ikke klart til uttrykk i vår
in vitro
cellekultur system, siden en distinkt M2 befolkning ikke var generelt indusert av utskilte faktorer fra CRC celler. På grunn av plast atferd vises av makro bestander, forsøkte vi å undersøke om differensierte M1 makrofager kan bli påvirket av kreft utskilt faktorer. Men kondisjonert medium fra CRC celler var ikke i stand til å forskyve allerede differensierte M1 makrofager mot et M2 fenotype. I stedet betinget media fra CRC celler økte uttrykk for M1 markør CD86, samtidig redusere det av M2 markør CD163, og dermed syntes å forsterke M1 fenotype (figur 5C). IL4 eller IL10 stimulert M2 makrofager ble ikke påvirket av utskilte faktorer fra CRC celler (data ikke vist). Dette tyder på at tumor utskilt faktorer alene ikke er i stand til å skifte en etablert M1 makrofag-fenotypen til en M2 fenotype i CRC.
morfologi og ekspresjon av ekstracellulære markører ble evaluert i makrofager i forskjellige M1 eller M2 subtyper før og etter stimulering mot motsatt fenotype eller stimulering av kondisjonert medium (cm) fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC cellelinjer. (A) Morfologisk evaluering av makrofag-fenotyper. (B) Uttrykk for ekstracellulære markører for makro bestander som vurderes av farging og flowcytometri. (C) Differensiering av M1 makrofager ved stimulering med kondisjonert media (cm) fra CRC cellelinjer. Relativt gjennomsnittlig flourescense intensitet (MFI) ± SD fra tre uavhengige eksperimenter er vist, hvor hver prøve ble normalisert mot sin respektive isotype kontroll og med M1 eller M2 (IL10) stimulert makrofag-prøven settes som 100%. Relevante statistisk signifikante forskjeller er angitt med * (p 0,05), ikke-signifikant
p
verdier er angitt med ns
Cytokin Expression av M1 og M2 Makrofager og TAM pasient
det er tydelig at den forenklede tydelig definisjon av M1 og M2 makrofager gjelder ikke for alle makrofager i en
in vivo
setting. Men å analysere forskjellene som er forårsaket av kreft skilles faktorer alene, vi igjen utnyttet vår
in vitro
cellekultur system for å se på mulige forskjeller og likheter mellom cytokin og chemokin uttrykk mønstre av M1 og M2 makrofager, eller TAM populasjoner. For dette ble det benyttet en PCR-basert cytokin og chemokin-genekspresjon array (resultatene presentert i detalj i tabell S1). Utvalgte gener av interesse er vist i figur 6. Som forventet ble M1 makrofager funnet å uttrykke høyere nivåer av proinflammatoriske cytokiner, IL1, IL6, IL12, IL23 og TNFa, som ikke ble uttrykt av M2-makrofager (figur 6A) . Immun regulatoriske cytokiner IL10 og TGFB ble hovedsakelig uttrykt av M2 makrofager, spesielt IL10-avledet M2-lignende immunregulerende makrofager (Figur 6A). Når du ser på cytokin og chemokin uttrykk mønster i TAMs var det klart at hver CRC cellelinje indusert et individuelt uttrykk mønster. Ved sammenligning av genekspresjonen profilen til M1 og M2 makrofager til det i de forskjellige TAMs, ble TAMs funnet å uttrykke høyere nivåer av proinflammatoriske cytokiner enn M2 makrofager, selv om det i de fleste tilfeller var mye lavere enn for de M1 makrofager. Ett unntak var TNFa, som ble funnet å bli uttrykt ved TAMs til samme nivå som for M1 makrofager. Den immunregulerende chemokiner IL10 og TGFβ2 ble også uttrykt ved de forskjellige TAMs, i noen tilfeller til en enda høyere grad enn M2-makrofager. Vi har søkt å undersøke forskjeller i den kjemotaktiske respons indusert ved M1 eller M2 makrofager og TAMs å forstå hvordan tumoren i CRC påvirker makrofag-induserte rekruttering av andre immunceller (Figur 6B). Når man ser på faktorer som fortrinnsvis rekrutterer lymfocytter av Th1 type (f.eks CXCL9 og CXCL10), TAMs stimulert av kondisjonert medium fra RKO eller Caco2-celler ble funnet å uttrykke høyere nivåer enn M2 makrofager, men likevel svært små mengder i forhold til ekspresjon av disse faktorene ved M1 makrofager. Den kjemotaktisk faktor for nøytrofile CXCL2 [19] ble utskilt av TAMs stimulert av kondisjonert medium fra SW480 celler. Dette tyder på at selv om effekten var beskjedne, noen av funksjonene i M1 makrofager kan også finnes i TAM. Når du ser på faktorer som rekrutterer lymfocytter av treg og Th2 type (f.eks CCL17, CCL18, CCL22 og CCL24), som uttrykkes hovedsakelig av M2 befolkningen, ble disse funnet å ikke uttrykkes ved TAMs, med unntak av CCL24 i TAMs stimulert av kondisjonert medium fra SW480 celler. Dette tyder på at ikke alle M2 funksjoner finnes i TAM. Til slutt har vi sett på gener som var mer høyt uttrykt i TAMs generelt, sammenlignet med i M1 eller M2 makrofager. Den monocytt kjemotaktisk å tiltrekke faktor CCL2 ble funnet å være sterkt uttrykt i alle populasjoner TAM. Også utfylle protein C5 ble funnet å være sterkt uttrykt i TAMs spesielt. Sammen dette tyder på at kreft skilles faktorer induserer TAMs av en «blandet» fenotype, med noen funksjoner som er TAM bestemt og noen funksjoner som kan være lik eller annerledes enn det som i M1 eller M2 makrofager.
Gene uttrykk var studert i M1 og M2 makrofager, eller makrofager stimulert med kondisjonert medium (cm) fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC cellelinjer ved hjelp av et cytokin Chemokine PCR Array. (A) Ekspresjon av pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner. (B) Uttrykk for kjemotaktiske faktorer. Vist er fold genuttrykk, med IL4 stimulert M2 makrofager satt som 1.
Diskusjoner
I en tidligere studie, der vi analyserte M1 og M2 makrofag distribusjon hos en pasient kohort av CRC , har vi funnet at en øket infiltrering av makrofager av et M1 fenotype kan bli korrelert til en forbedret overlevelse i CRC-pasienter [18]. Imidlertid infiltrasjon av M1 makrofager ble funnet også å være ledsaget av infiltrasjon av M2 makrofager. Tumorceller er kjent for å produsere faktorer som påvirker fenotypen makrofag og derved også makrofagen responsen mot tumoren, foreslått å favorisere tumorinvasjon og metastase [12], [20]. Mulige forklaringer til den positive rollen som makrofager sett på prognose i CRC, kan enten være at CRC opprett liksom en pågående M1 makrofag respons, eller mindre effektivt skew makrofag respons mot et M2 respons enn andre kreftformer der infiltrasjon av makrofager er et dårlig prognostisk markør
