Abstract
epidermal vekstfaktor (EGF) og insulin-like growth factor-I (IGF-I) er kritiske regulatorer av celledifferensiering, overlevelse , spredning og migrasjon i kreft. Denne studie viser at ARNO (cytohesin-2), en aktivator av EGF og IGF-I reaksjonsveier, ble mer sterkt uttrykt i kolorektal cancer vev enn i benign tilstøtende kolorektal vev. Når ARNO-siRNA eller kjemisk hemmer SecinH3 blokkert ARNO, nedstrøms av EGF og IGF-I trasé redusert i kolorektal cellelinjer HT29 og HCT116. Dette blokkering også svekket celleproliferasjon, invasjon, og migrasjon in vitro. Videre er EGF-reseptor (EGFR) -avhengige kolorektale tumorxenografter i nakne mus som virker anti-proliferative og veksthemming effekter ved å injisere secineH3. Disse data antydet at inhibering cytohesins eller ARNO som cytoplasmatiske aktivatorer av EGFR og IGF-I i kolorektal cancer resulterte i anti-spredning, redusert invasjon, redusert migrering, og undertrykket vekst in vivo og in vitro. Derfor kan cytohesins eller ARNO være en potensiell terapi mål for noen tykktarmskreft
Citation. Pan T, Sun J, Hu J, Hu Y, Zhou J, Chen Z, et al. (2014) Cytohesins /ARNO: Funksjons i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 9 (3): e90997. doi: 10,1371 /journal.pone.0090997
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 27 august 2013; Godkjent: 06.02.2014; Publisert: 11 mars 2014
Copyright: © 2014 Pan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet fra National High Technology Research and Development Program of China (No. 2012AA02A506), Provincial Natural Science Foundation of China Zhejiang (LD13H160015) og Zhejiang Provincial Key vitenskapelig og teknologisk forskning Prosjekter av International Cooperation (No. 2009C14010). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er fortsatt å være den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og den andre hos kvinner til tross for betydelige forbedringer i sin prognose tilskrives fremskritt i diagnostikk og terapi modaliteter. Over 1,2 millioner nye krefttilfeller og 608 700 dødsfall registreres årlig [1]. Den effektive behandlinger av kolorektal kreft er kirurgi, cellegift og målrettet terapi. Fremskritt i konvensjonell kjemoterapi har forlenget levealder, men effektiviteten for mange pasienter er fortsatt lav, spesielt for de med metastaser. Jakten på mer effektive og mindre giftige terapier har gitt opphav til en ny generasjon av antitumormidler. Den vanligste årsaken er målrettet biologisk middel [2]. Epidermal vekstfaktor (EGF) reseptor (EGFR) og tilhørende signaloverføringsveier har dukket opp som viktige molekylære terapeutiske mål for tykktarmskreft [3].
EGFR /ErbB1, sammen med HER2 /ErbB2, HER3 /ErbB3, og ErbB4, er et medlem av ErbB-familien. EGFR /ErbB1 regulerer kroppens medfødte immunrespons [4] samt celledifferensiering, overlevelse, spredning, invasjon, og migrasjon. EGFR inneholder et ekstracellulært ligand-bindende domene, en enkelt membran-dekkende region, og et cytoplasmatisk tyrosinkinase-domene [5]; [6]. Ligander binder til det ekstracellulære domenet forårsaker reseptordimerisering, for derved å indusere konformasjonsendring av intracellulære komponenter fosforylering og aktivering nedstrøms signalisering [7].
I dag er mange målrettede biologiske faktorer spiller viktige roller i EGFR-signaleringsreaksjonsveien. Anti-EGFR-monoklonale antistoffer og EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer har blitt vist å effektivt inhibere proliferasjonen av kreftformer, særlig colorectal cancer og nasofaryngeale [8]; [9]. Cetuximab og Panitumumab, antistoffer mot EGFR, er mye brukt til å behandle kolorektal kreft. Men pasientene etter hvert utvikle resistens mot disse midlene [10]. En vanlig hypotese av cetuximab-motstand er EGFR eller nedstrøms molekylær mutasjon i kreftceller, for eksempel kjøpt EGFR ectodomain mutasjon S492R [10]. I tillegg forbedrer vedvarende EGFR blokkerende andre enn de EGFR-reaksjonsveien veier, som for eksempel HER2, HER3, insulinlignende vekstfaktor (IGF) -I-reseptor (IGF-IR) signalveier [11] – [13].
IGF-i og IGF-II spiller sentrale roller i cellevekst, differensiering, overlevelse, transformasjon, og metastasering. De biologiske effekter av IGF formidles av IGF-IR, er en reseptor tyrosin kinase med homologi til insulinreseptoren. Forskere har nylig funnet ut at dereguleringen av IGF-systemet er en viktig bidragsyter til utviklingen av flere kreftformer, med IGF-IR aktivering øke tumorigent potensialet i bryst, prostata, lunge, tykktarm, samt hode og hals plateepitelkarsinom [14 ]; [15].
Cytohesins som aktivatorer av ErbB reseptorer har blitt rapportert av Bill et al. [16]. De viste at cytohesins forbedre EGFR aktivering av direkte interaksjon med cytoplasmatiske domener av dimeriserte reseptorer og ved å legge til rette for de konforme rearrangements av disse domenene. Cytohesins enn uttrykk forbedrer EGFR-signalering i humane lungekrefttilfellene, mens den kjemiske hemming eller knockdown av cytohesins reduserer EGFR aktivering. Tilsvarende har våre tidligere studier vist at blokkering cytohesins av SecinH3 eller slå ned ARNO av ARNO-siRNA kan redusere EGFR aktivering i tykktarmskreft cellelinjer HT29 [17]. EGF og IGF er kritiske regulatorer av celledifferensiering, overlevelse, spredning og migrasjon i kreft. De er også involvert i apoptose, transformasjon, invasiv vekst, og fjern metastase av tumorceller [15]. Cytohesins har blitt foreslått som en ny effektiv mål for å redusere invasjon, metastaser, og Cetuximab eller panitumumab-resistente celler i pasienter med kolorektal kreft. Muligheten for at cytohesins kan være nye mål for multiresistent eller forskudd stadium kreftpasienter har blitt utforsket. Derfor undersøkte vi cytohesins eller ARNO som en ny anti-colorectal cancer agent i denne studien.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
cellekultur media 1640 og McCoy S 5A ble kjøpt fra Gibco (Gibco, USA). De kanin eller mus monoklonale anti-humane antistoffer som ble brukt var ARNO (Abcam, ab56510), pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), pErk1 /2 (T202 /Y204, BioWorld, BS5016), EGFR (Cell Signaling, 3197), GAPDH (BioWorld, AP0063), IGF-IR (Abcam, ab39675), pIGF-IR (Abcam, ab39398), Pirs (Abcam, ab52167), Pakt (Abcam, ab106693), pIRS1 (Abcam, ab66153), pShc (Abcam, ab155170), og Ki-67 (Cell Signaling, 9027). Andre reagenser og utstyr som ble brukt var som følger: SecinH3 (Merck-565725 /sc-203 260), siRNA oligo (Genephama), MTT (Sigma, m5655), DMSO (Sigma, D5879), human EGF (Peprotech, AF-100-15 ), human IGF-1 (Peprotech, AF-100-11), FBS (Gibco, USA), og 0,25% trypsin (Sigma), immunhistokjemiske kit (Zhongshan, Kina).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og dyrking
den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HT29 og HCT116, som ble identifisert uten mutasjon i KRAS og BRAF, ble hentet fra Key Laboratory of Cancer Prevention and Intervention, Cancer Institute, Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Kina. Cellekulturene ble brukt var som følger: HT29-cellelinje ved 1640 (med 10% FBS + 1% streptomycin /penicillin), og HCT116-cellelinjen ved McCoy «s 5A (med 10% FBS + 1% streptomycin /penicillin). Alle cellelinjer ble dyrket i en 37 ° C 5% CO
2 inkubator og passert med 0,25% trypsin (Sigma) i 0,2 M fosfat-bufret saltvann (PBS).
tumorprøver
Før mennesketumorprøver forskning, må hadde blitt innhentet pasientens samtykke. Vi hadde sendt inn en uttalelse fra sykehuset vårt etisk komité og fått godkjenning av forskningen. Alle tumorprøver stammer fra Biobank på Key Laboratory of Cancer Prevention and Intervention, Cancer Institute, Zhejiang University, Kina. Alle tumorer ble klinisk og patologisk identifisert som det primære og eneste neoplastisk lesjon og klassifisert i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) Klassifisering av svulster i fordøyelsessystemet (2010).
farging
For farging, brukte vi kanin monoklonale antistoffer dannet mot ARNO (Abcam, ab56510), mus antistoffer mot pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), kanin polyklonale antistoffer mot pIGF-IR (Abcam, ab39398) og kanin monoklonale antistoffer mot Ki-67 (Cell Signaling, 9027) som primære antistoffer. Før søknaden ble alle antistoffer fortynnet (Primære antistoffer utvannet 1:100, alle andre sekundære antistoffer fortynnet 1:200) i PBS (150 mM NaCl, 10 mM Na
2HPO
4, 10 mM NaH
2PO
4, pH 7,4). Immunhistokjemi ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Farging intensiteter ble individuelt evaluert av tre uavhengige observatører ved hjelp av en fire-lags poengsystem som beskrevet [18].
MTT
HT29 eller HCT116-celler ble sådd ut på 96-brønners plater i en tetthet på 3000 celler /brønn. Celler ble dyrket med 1% FBS og reagenser (50 ng /ml EGF eller 25 ng /ml IGF-1, SecinH3 med forskjellig konsentrasjon (0 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM)) i 24, 48, og 72 h ved 37 ° C og 5% CO
2. Deretter 5 mg /ml MTT ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Så ble 200 ul DMSO ble tilsatt til besluttsom MTT substrat, og absorbansen ble målt ved 570 nm ved bruk av en Spectra MAX mikroplateleser (Bio-Rad, USA)
Western blot-analyse
Celler ble oppsamlet og ekstrahert med en eukaryot cellelyseringsbuffer i henhold til produsentens instruksjoner. Proteiner ble separert ved 12% SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran med en våt overføringsanordning (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blottet Membranene ble blokkert med 10% skummet melk i PBS Tween-20 i 1 time. Etter vasking av membranene tre ganger med Tris-bufret saltvann Tween-20 (TBST), ble de inkubert med primært antistoff fortynnet 1:1000 ved romtemperatur i 1 time og deretter inkubert i HRP-merket sekundært antistoff fortynnet 1:10 000 ved værelses temperatur i 1 time. Etter skylling av membranene, ble visualiseringen utført med en forbedret kjemiluminescens Western blot analysesystem (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK), og cellene ble eksponert for røntgenfilm (Kodak). GAPDH protein ble anvendt som en indre kontroll. Boltene blir oppdaget og analyse av programvare Alpha Imager EP (Versjon: 3.2.2.0).
Cell migrasjon analyser
Cell migrasjon analysene ble utført ved hjelp av 24-brønns Tran hovne plater (8 mikrometer pore størrelse, Costar). Om 1 × 10
4 celler (HT29 eller HCT116) ble lastet inn i forkamrene. De nedre kamre ble fylt med medium (1640 pluss 1% FBS) i fravær (DMSO 0,2%) eller nærvær av SecinH3 (10, 20, eller 40 uM). De Tran svelle Platene ble deretter inkubert i et 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 48 timer. Etter rengjøring av cellene fra den øvre siden av polykarbonatmembran og hematoxylin-eosin-farging, ble det polykarbonatmembran kuttet og plassert på et objektglass, dekke gled, og undersøkt under mikroskop. Det totale migrert celle antall og prosentandel ble deretter telles.
xenograft tumormodeller
Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med Zhejiang University lover for dyrevern og godkjent av Zhejiang University dyrevern komiteen . Svulster ble samlet ved subkutane injeksjoner av 5 x 10
6 HT29 celler i nu /nu athymiske mus av hankjønn i henhold til Ullrich et al. [19]. Etter etablering av tumorer (omtrent 6 mm i diameter) ble det fjorten mus randomisert i to grupper. Mus i SecinH3 gruppe ble behandlet med daglige intraperitoneale injeksjoner av SecinH3 (100 pl, 2,5 mM, i 75% glukoseoppløsning (5%) /25% DMSO). Mus i kontrollgruppen ble behandlet med samme volum av 75% glukoseoppløsning og 25% DMSO før den 14. dag. Under behandlingen, målte vi den største tumordiameter 2 dager etter ultralyd og deretter avlives musene for å samle tumorer. Vi så utført immunhistokjemisk farging for Ki-67 for å detektere proliferasjon inhibering av SecinH3 de xenograft tumormodeller. Den totale Ki-67 positive celle antall og prosentandel ble deretter telles.
statistikker
Resultatene er gitt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Den statistiske software SPSS16.0 ble brukt for statistisk analyse. Parvise sammenligninger ble utført av Student
t
-test. Pearson korrelasjonsanalyse ble gjennomført, med
p
0,05 (merket «*») og
p
. 0,01 (merket «**») anses vesentlig annerledes eller signifikant korrelert
Resultater
ARNO løpet uttrykk ble korrelert med EGFR og IGF-IR nivåer i human kolorektal kreft vev
EGFR og IGF-IR signale spiller viktige roller i mange typer kreft [16 ] og vår gruppe fant at ARNO og andre cytohesins forbedre EGFR aktivering i kolorektal kreft celler [17]. Derfor lurte vi på om ARNO var over uttrykt i pasientenes kreft vev og over uttrykket ble korrelert med EGFR og IGF-IR signalering. Derfor brukte vi immunhistokjemi å undersøke primære humane kolorektal adenokarsinomer med et antistoff påvisning av ARNO, pEGFR (pY1068), og pIGF-IR (pY1185). Resultatene viste at normal kolorektal vev eller godartet ved kolorektal vev hadde bare bakgrunnen (30/36) eller svak farging (6/36). Dessuten, alle karsinomer viste ARNO positiv farging, 93,1% av disse var moderat eller sterk. Vi fant en svært signifikant (
r
= 0,712,
p
= 0,012 for pEGFR;
r
= 0,684,
p
= 0,031 for pIGF- IR,
n
= 36) sammenheng mellom uttrykk nivå ARNO og pEGFR eller pIGF-IR (figur 1). Våre tidligere studier på rollen ARNO i kolorektal kreft vev har avdekket en høy korrelasjon med pEGFR og pIGF-IR, noe som tyder på at ARNO muligens øker aktiveringen og signalene med EGFR og IGF-IR.
Pasient kolorektal kreft eller godartede tilstøtende vev på hverandre følgende snitt ble farget for ARNO (a), pEGFR (b), og pIGF-IR (c). Representative bilder av normal kolorektal vev (venstre kolonne) og moderat (høyre kolonne) ARNO uttrykk vises (opprinnelig forstørrelse x 100). Diagrammet i (a) viser fraksjonen og frekvensene av tumorer med bakgrunn (-), svak (+), moderat (++), eller sterk (+++) farging for ARNO. Diagrammene i (b) og (c) viser korrelasjonen av fosforyleringen nivåer av respektive proteiner med ARNO poengsum (
p
= 0,012 for pEGFR,
p
= 0,031 for pIGF-IR
n
= 36). Det avslører at ARNO løpet uttrykk ble korrelert med forbedret EGFR og IGF-IR.
Kjemisk hemming av cytohesins og knockdown av ARNO redusert cellesignale
For å oppdage funksjon cytohesins eller ARNO i EGF vei av kolorektal kreft celler, SecinH3 og ARNO-siRNA (valgt av de primære eksperimenter) hemme cytohesins /ARNO i HT29 celler [17]. I analysen HT29-celler ble dyrket i 35 mm glassbunn retter merket som gruppe A, B eller C. Alle celler ble dyrket med 1% FBS kulturmediet. SecinH3 (20 uM eller en blanding av 100 pmol av ARNO-siRNA i 5 ul Lipofektamin 2000) ble tilsatt til retter fra gruppe B når cellene hadde spredd seg til å dekke 70% av rettene i 10 timer. Samtidig ble 0,2% DMSO (eller 5 ul av Lipofectamine 2000) tilsatt til retter fra gruppene A og C som en kontroll, og deretter 50 ng /ml EGF ble tilsatt til retter fra gruppene A og B i 5 min. Western blot-analyse ble brukt for å teste ekspresjonen av EGF sti-assosierte molekyler, inkludert ARNO, EGFR, pEGFR, pIRS1, pShc, og pErk1 /2. Resultatene viste at når SecinH3 blokkert cytohesins eller ARNO hemmes av ARNO-siRNA ble ARNO uttrykk redusert i HT29 celler. I tillegg ble de fosforylerte molekyler EGF banen, herunder pEGFR, pShc, og pErk1 /2 nedregulert i HT29-celler (Fig. 2).
(a og b) SecinH3 og ARNO-siRNA redusert EGFR reseptorsignalisering. Western blot-analyse av HT29-celler behandlet med SecinH3 (a) eller ARNO-siRNA (b) og stimulert med EGF er vist. Fosforylering av de angitte proteiner ble bestemt ved hjelp av immundeteksjon phosphospecific antistoffer. Glyceraldehydes fosfat dehydrogenase (GAPDH) fungerte som en lasting kontroll. Diagrammene viser relative fosforylering nivåer etter normalisering for GAPDH. De ubehandlede ligand-stimulerte celler ble angitt som 3 (
n
= 3). Data blir representert som gjennomsnittet ± SEM. *
p
0,05, **
p
. 0,01
For å oppdage funksjon cytohesins eller ARNO i IGF vei, SecinH3 og ARNO -siRNA [17] i HCT116 cellene hemmes cytohesins /ARNO. I analysen HCT116-celler ble dyrket i 35 mm glassbunn retter merket som gruppe A, B eller C. Alle celler ble dyrket med 1% FBS kulturmediet. SecinH3 (20 uM eller en blanding av 100 pmol av ARNO-siRNA i 5 ul Lipofektamin 2000) ble tilsatt til retter fra gruppe B når cellene hadde spredd seg til å dekke 70% av rettene i 10 timer. Samtidig ble 0,2% DMSO (eller 5 ul Lipofektamin 2000) tilsatt til retter fra gruppene A og C som en kontroll, og deretter 25 ng /ml IGF-1 ble tilsatt til retter fra gruppene A og B i 5 min. Western blot analyse ble brukt for å teste uttrykk for IGF pathway-forbundet molekyler inkludert ARNO, IGF-IR, pIGF-IR, Pirs, og Pakt. Resultatene viste at når cytohesins ble blokkert av SecinH3 eller hemmet av ARNO-siRNA ble ARNO uttrykk redusert i HCT116 cellene. I tillegg ble fosforylerte molekyler IGF banen, herunder pIGF-IR og pakt nedregulert i HCT116-celler (Fig. 3).
(a og b) SecinH3 og ARNO-siRNA redusert IGF-IR-reseptorsignalisering. Western blot-analyse av HCT116-celler behandlet med SecinH3 (a) eller ARNO-siRNA (b) og stimulert med IGF-1 er vist. Fosforylering av de angitte proteiner ble bestemt ved hjelp av immundeteksjon phosphospecific antistoffer. Glyceraldehydes fosfat dehydrogenase (GAPDH) fungerte som en lasting kontroll. Diagrammene viser relative fosforylering nivåer etter normalisering for GAPDH. De ubehandlede ligand-stimulerte celler ble angitt som 3 (
n
= 3). Data blir representert som gjennomsnitt ± SEM. *
p
0,05, **
p
. 0,01
Blokkerings cytohesins redusert spredning og migrasjon av kolorektal celler
immunhistokjemi av pasientenes kreft vev avdekket at ARNO løpet uttrykk ble korrelert med forbedret EGFR og IGF-IR. Dette funnet fikk oss til å tenke på muligheten for redusert spredning eller migrering av EGFR /IGF-sensitive celler når ARNO blokkert. Slik velger EGFR /IGF-sensitive cellelinjer utførte vi MTT-analyse ved å dyrke de kolorektal kreft cellelinjer HT29, SW620, SW480, HCT116 og Løvø i 1% FBS med EGF eller IGF. Vi fant at HT29 var det EGFR-avhengig cellelinje, og HCT116 var IGF sensitive (data ikke vist). Begge cellelinjer ble identifisert som villtype for KRAS og BRAF (data ikke vist). For å oppdage forholdet mellom ARNO med celleproliferasjon og migrasjon i tykktarmskreft, har vi lagt sesinH3 til kulturmedium og fant det kan redusere spredning (MTT analysen med SecinH3 i 0 (DMSO), 10, 20, og 40 mikrometer for 24, 48, og 72 h) (fig. 4b), og overføringen (Tran svelle med SecinH3 i 0 (DMSO), 10, 20 og 40 uM i 48 timer) på HT29 og HCT116-celler (fig. 4a). Det viser at SecinH3 kan inhibere infiltrasjon og migrasjon av HT29 og HCT116-celler. Og effekten er proporsjonal med konsentrasjonen av SecinH3 og operasjonstidspunktet.
Venstre kolonne i diagram (a) er representative bilder av Tran svelle analyse av HT29 og HCT116-celler behandlet med SecinH3 i 0, 10, 20 , og 40 uM respektivt. Den venstre bilder er et resultat av HT29-celler uten SecinH3 (DMSO 0,2% i 48 timer) og med SecinH3 (20 uM i 48 timer) (opprinnelig forstørrelse x 100). Det virker som SecinH3 kan hemme migrering av HT29 og HCT116-celler. Resultatene er korrelert med konsentrasjonen av SecinH3 og tiden. Diagrammene (b) viser relative celleantall av HT29 og HCT116 bestemt ved MTT-analyse i nærvær av SecinH3 i 0, 10, 20, og 40 uM til 24, 48 og 72 timer. Det virker som SecinH3 kan hemme infiltrasjon av HT29 og HCT116-celler. Resultatene er også korrelert med konsentrasjonen av SecinH3 og tiden. Data blir representert som gjennomsnittet ± SEM. * P 0,05, ** p. 0,01 (
n
= 5)
SecinH3 reduserte veksten av kolorektale HT29 tumorxenotransplantater
Den sterke uttrykk for ARNO i kolorektal kreft vev og dens signifikant korrelasjon med pEGFR og pIGF-IR bedt oss om å lure på om blokkering cytohesins in vivo kan hemme spredning av kreftceller. For å undersøke denne hypotese, HT29 cellene som har den høyeste ekspresjon av EGFR enn andre kolorektal kreftceller [17], ble valgt for å gjøre det xenograft musemodell. Så vi subkutant injisert HT29 celler til hårløse mus for å generere tumorxenotransplantater. Når tumor xenograft størrelsen nådde 6-7 mm i mus som var blitt injisert i HT29-celler i nesten en uke, ble musene begynte å behandle med eller uten SecinH3. De svulster i SecinH3 gruppe ble inhibert vekst åpenbart etter behandling med SecinH3 i mer enn en uke. De to gruppene hadde åpenbare forskjellene inntil det 11. dager etter behandlingen (Fig. 5a). Immunhistokjemisk farging av markøren celleproliferasjonen Ki-67 i reseksjon tumorer bekreftet redusert celleproliferasjon. Den totale Ki-67 positive celle antall og prosentandel ble deretter telles. Vi har funnet det meget signifikant forskjellig ekspresjon nivået mellom på mus behandlet med og uten SecinH3 etter behandling av 14 dager (p = 0,0083, n = 7) (Fig.5b, c, d). Western blot-analyse ble brukt for å teste ekspresjonen av EGF sti-assosierte molekyler i tumorer mus behandlet i 2 uker, inkludert ARNO, pEGFR. Resultatene tyder på at når SecinH3 blokkert cytohesins, ARNO og pEGFR uttrykk ble redusert i HT29 xenografter. (Fig.5e).
Diameteren xenograft tumor etablert i mus ble målt ved ultralyd hver 2. dag under behandlingen (diagram a). T
1 var kontrollgruppen. T
2 var SecinH3 gruppen. De svulster i SecinH3 gruppen ble hemmet vekst åpenbart, etter daglige intraperitoneale injeksjoner av SecinH3 for mer enn en uke. Det var signifikant forskjell mellom de to gruppene i 11
th, 14
th dager etter behandling. Diagram (b) og (c) representerer immunhistokjemiske straining resultater for Ki-67 av tumor fra mus etter behandlet med (b) eller uten SecinH3 (c) i 14 dager, (opprinnelig forstørrelse x 200). Det sømmer som SecinH3 reduserer uttrykk for Ki-67 i HT29 xenografter. Diagram (d) viser positive uttrykk frekvensen av Ki-67 i svulster i mus med HT29 xenografter i 14
th dagen etter behandling med eller uten SecinH3. Diagram (e) viser den positive uttrykk for ARNO, pEGFR i tumorer i mus med HT29-xenotransplantater etter behandling med eller uten SecinH3 i 2 uker. Arno og pEGFR uttrykk for de to gruppene har betydelig forskjell. Diagrammene viser relative fosforylering nivåer etter normalisering for GAPDH. Data blir representert som gjennomsnitt ± SEM. *
p
0,05, * *
p
0,01, n = 7.
Diskusjoner
EGF og IGF er avgjørende regulering av de biologiske egenskapene til cellene, spesielt i kreft [20]. Vår tidligere studie har vist at ARNO er det viktigste cytohesin og er over uttrykt i kolorektal kreft cellelinjer som en aktivator som spiller en avgjørende rolle i EGFR vei signaliserer [17].
For å bekrefte hypotesen om at ARNO er relatert til kolorektal kreft ved å aktivere EGF og IGF, utførte vi immunhistokjemi av resected menneskelige kolorektal adenokarsinomer farget av ARNO, pEGFR, og pIGF-IR. Sammenlignet med normal kolorektal vev eller godartet tilstøtende kolorektal vev, ARNO, pEGFR, og pIGF-IR var over uttrykt i adenokarsinomer. Vi har også funnet en meget signifikant korrelasjon mellom uttrykket nivåer av ARNO og pEGFR eller pIGF-IR.
I tillegg brukte vi siRNA og SecinH3-hemmet ARNO /cytohesins i kolorektal kreft cellelinjer for å utforske aktiviteten til ARNO og dens tilknytning til EGFR og IGF-IR signalsystem. Vi oppdaget nedstrøms av EGFR og IGF-IR i forbindelse med kolorektal kreft forekomst. Når vi hemmet cytohesins eller ARNO ble nedstrøms molekyler EGF pathway speiles i redusert aktivering av pEGFR, pIRS1, pShc, og pErk1 /2. Bevis antydet at blokker cytohesins eller ARNO kunne redusere EGF sti system. Til alle tider, vi har oppdaget IGF vei nedstrøms inkludert IGF-IR, pIGF-IR, Pirs, og Pakt. Disse molekylene ble nedregulert når ARNO ble hemmet kjemisk eller ved siRNA. Disse forskrifter indikerte at signalforsterkning og overføringsveier ble effektivt sperret [21]; [22]. Dermed cytohesins eller ARNO var sterkt korrelert med EGF og IGF sti aktivering i kolorektal kreft [23].
I en mobil kontekst, brukte vi de menneskelige kolorektal kreft cellelinjer HT29 og HCT116 identifisert uten mutasjon i KRAS og BRAF . Når ARNO-siRNA eller SecinH3 blokkert ARNO eller cytohesins ble spredning av kolorektal kreft celler reduseres i MTT. Videre er reduksjonen proliferasjonen var positivt korrelert med SecinH3 konsentrasjon. For invasjonen og migrasjon analysen ble Tran svelle analyse utført. Porene i tran svelle Membranene ble blokkert med en gel (matrigel) sammensatt av ekstracellulær matriks for å etterligne de typiske matrisene som tumorceller støte på under invasjonsprosessen in vitro. Ved å plassere kolorektal cellene på den øvre side av gelen til å bli tiltrukket av en høyere serumkonsentrasjon på den annen side av brønnen, ble invasjon bestemt ved å telle de celler som har gjennomløpt den celle-permeabel membran som har invadert og migrerte mot den øvre konsentrasjon serum. I denne analysen, fant vi at hemmer cytohesins av SecinH3 redusert invasjonen og migrasjon av kolorektal kreft celler. Forskere har nylig rapportert tilsvarende reduksjoner i kreft lunge og prostata [6]; [19]; [24]. Denne reduksjonen kan bidra til nedregulering av EGF og IGF-I reaksjonsvei signalforsterkning og transduksjon. I in vivo studie, injiserte vi SecinH3 daglig etter HT29-tumor-xenografter ble samlet i nakne mus. Vi har funnet at veksten av svulsten var åpenbart inhibert etter 9 dager med SecinH3 injeksjon. Etter 14 dagers behandling ble tumor proliferasjon i mus også hemmet.
I en nyere forskning, er det finne at ARNO er sterkt uttrykt i kolorektal cancer, og uttrykket er korrelert med EGFR og IGF-IR-trasé . ARNO inhibering kan redusere signalering og leding av disse reaksjonsveier, samt redusere spredning, invasjon, og migrering av kolorektal kreftceller in vivo og vitro. Ludovini [25] rapporterte at hvis både IGF-IR og EGFR er svært co uttrykt i resected ikke-småcellet lungekreft, kan pasientene oppnå kortere sykdomsfri overlevelse. Choi et al. [26] indikerte at kombinert inhibering av IGF-IR-signalisering forbedrer veksthemmende og apoptose-induserende virkninger av EGFR pathway inhibitor. Men kreftcellene har alltid mange signal kanal måter å gjenskape, og EGFR og IGFR er bare to av disse måtene. Selv om ARNO kan være en ny terapi mål av enkelte kolorektale kreftceller, kan den høyere konsentrasjon av ARNO i kreftceller enn på normale celler skyldes andre årsaker, for eksempel proliferasjon og immunitet. Mekanismen for migrasjon kan også være relatert til integrin β [27]. Alle disse hypotesene trenger å bli undersøkt i fremtiden.
Takk
Vi takker Dr Zhou Jiaojiao og Dr Tan Chunwen for sine cellelinjer (HT29, HCT116), og vi takker også for støtten og entusiasme. Vi ønsker å si unnskyld til de forfatterne som har uvurderlig arbeid er ikke nevnt og sitert i de ovennevnte.
