Abstract
Tumor invasjon og metastaser representerer en kompleks serie av molekylære hendelser som bebuder en dårlig prognose. Bidraget av inflammatoriske trasé som formidler denne prosessen er ikke godt forstått. Nod-lignende reseptorer (NLRs) av medfødt immunitet funksjon som intracellulære sensorer av patogen motiver og fare molekyler. Vi foreslår en rolle NLRs i tumor overvåking og programmering tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss). I denne studien undersøkte vi nedstrøms serin /threonin og tyrosin kinase Rip2 i en murin modell av blærekreft. I Rip2-manglende C57BL6 mus, større ortotopiske MB49 tumorer utviklet med mer tallrike og høyere forekomst av metastaser sammenlignet med villtype-kontroller. Som sådan, økt tumorinfiltrasjon av CD11b
+ GR1
hi myeloide-avledet suppressor celler (MDSCs) med samtidig reduksjon i T-celler og NK-celler ble observert i Rip2-mangeltumorbærende dyr med ortotopiske og subkutane tumormodeller. Rip2-mangel svulster viste forbedret epithelial-til-mesenchymale overgang, med forhøyet uttrykk for
zeb1
,
zeb2
,
vri
, og
snegle
i svulsten mikromiljøet. Vi har funnet at fravær av Rip2 spiller en indre rolle i å fremme utviklingen av granulocytiske MDSCs ved en autokrin og parakrin virkning av granulocyttisk kolonistimulerende faktor (G-CSF) ekspresjon. Våre funn tyder på at NLR trasé kan være en roman modalitet å programmere Tīlss og påvirke kreftmetastaser
Citation. Zhang H, Chin AI (2014) Rolle Rip2 i Utvikling av Tumor-infiltrere MDSCs og blærekreft metastasering. PLoS ONE 9 (4): e94793. doi: 10,1371 /journal.pone.0094793
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 19 november 2013; Godkjent: 20 mars 2014; Publisert: 14 april 2014
Copyright: © 2014 Zhang, Chin. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. American Association for kreftforskning Career Development Award 10-20-14, Broad Stem Cell Research Center Scholars i translasjonell medisin Program, STOP Cancer Research Career Development Award, Becton Dickinson biovitenskap stipend (AI Chin) Perkins Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sammenheng med immun svulsten mikromiljøet kan være forutsigbare for tumorstadium, kreftspesifikk overlevelse, samt respons på kjemoterapi [1] – [3]. I visse ondartede sykdommer, tilstedeværelse av infiltrerende CD8
+ T-lymfocytter korrelerer med forbedrede resultater, mens infiltrerende B-celler, CD4
+ T-lymfocytter, og negative regulatorer inkludert myeloide-avledede undertrykkings celler (MDSCs) og T regulatoriske celler ( tregs) negativt korrelert med overlevelse [4]. Disse observasjonene understreker viktigheten i å definere stier avgjørende for programmering av sammensetningen av tumor infiltrerer lymfocytter (Tīlss), som selektiv modulering av immun svulsten mikromiljøet representerer en ny terapeutisk modalitet.
Mønstergjenkjenning reseptorer som det prototypiske Toll- like receptor (TLR) familie og intracellulære nucleotide-bindende oligomeriseringsprosessen domene (NOD) -lignende reseptor (NLR) familie gjenkjenne bevarte motiver på patogener samt endogene molekyler utgitt av skadede celler [5]. Aktivering av disse signalveier initierer medfødte og ervervede immunresponser, og kan fremme vev reparasjon og regenerering. Vi har tidligere innblandet TLR3 i en murin modell for prostatacancer tumor overvåking kritisk i programmering av infiltrasjon av T-lymfocytter og NK-celler, mens undertrykke Treg utvidelse [6]. I blærekreft, er effektiviteten av immunmodulering fremhevet ved bruken av intravesikal Bacillus Calmette Guerin, som fremmer en strøm av makrofager og nøytrofiler i svulsten mikro mediert delvis av TLR2 og 4 [7], [8].
-reseptor-veksel protein 2 (Rip2), en serin-treonin og tyrosin kinase nedstrøms og felles for Nod1 og NOD2, aktiverer transkripsjonsfaktorer så som NF-kB og MAP-kinaser gjennom dets kinaseaktivitet, samt gjennom rekruttering av E3 ubiquitin -ligase [9] – [14]. Rip2 avhengig trasé har dukket opp som avgjørende for sensing ulike patogener som spenner fra
Listeria monocytogenes
,
Staphylococcus aureus
, og
Legionella pneumophilia
til
Escherichia coli
så vel som ved formidling av inflammatoriske sykdommer slik som autoimmun encefalomyelitt [15] – [17]. I tillegg har polymorfismer av NOD2 blitt koblet med følsomhet for Crohns sykdom, mens polymorfismer av Rip2 har vært forbundet med systemisk lupus erythematosus [18], [19]. Evnen til NLRs å megle svulst overvåking er ikke undersøkt hittil. Her postulerer vi at Rip2 kan megle blærekreft overvåking og utforske sin rolle ved å bruke en mus orthotopic og underhud blærekreft modell. Vi viser at tumor peiling Rip2-mangelfull mus skjevheter myelogen differensiering mot MDSC avstamning og spiller en iboende rolle i utviklingen av CD11b
+ Ly6G
+ Ly6C
lo granulocytic MDSC befolkningen. Våre funn er den første til å implisere Rip2 og NLRs i tumor overvåking og deres betydning i programmering av immun svulstens mikromiljø. Den NLR veien kan representere en terapeutisk mulighet i moduler kreft immunitet for å hindre tumorinvasjon og metastasering.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeidet er utført i samsvar med Public Health service politikk på human Care og bruk av forsøksdyr og USDA dyrevelferdsloven Forskrift gjennom en godkjent UCLA Institutional Animal Care og bruk komité protokoll # 2010-023-11C.
Mus
Rip2-manglende mus backcrossed til et C57Bl /6 bakgrunn i 10 generasjoner ble genotypet som tidligere beskrevet [10]. Alderstilpassede C57Bl /6-mus (Jackson Laboratories) ble anvendt som kontroller. Seks til åtte-wk gamle hunnmus ble anvendt for eksperimentene. Mus ble plassert i patogenfrie forhold i henhold til UCLA Forsøksdyrutvalgets protokoller.
Cell kultur
MB49 cellelinjer (gave fra Tim Ratliff) ble avledet fra kreftfremkallende-indusert uroteliale cellekreft i C57BL6 mus og holdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i DMEM (Cellgro), supplert med 10% FBS (Omega Scientific) og 1% penicillin og streptomycin [20].
tumormodeller
for intravesikal tumor-implantering, ble hunnmus sedert, kateteriseres med en 24 sporvidde kateter (BD Biosciences), og innpodet med 10 ug av poly-L-lysin (Sigma) i 100 pl i 30 minutter før drenering og instillasjon av 2 x 10
6 MB49 celler i 100 ul i 60 minutter [21], [22]. Musene ble avlivet 12 dager etter tumor-inokulering, og blæren og indre organer ble undersøkt. Blære, lunger og nyrer ble fiksert i formalin eller innebygd i oktober for farging av H E eller immunofluorescence [23]. Lunge- og nyremetastaser ble bestemt grovt og ved lysmikroskopi av H E seksjoner i en enkelt representant koronale snitt. For subkutane tumor utfordringer, 5 x 10
5 MB49-celler ble implantert subkutant i flankene av mus med tumorvekst overvåket annenhver dag. Etter ofring av musene 14 dager etter tumorinokulasjon, ble svulster høstet, veid, og dissosiert for analyse.
immunfluorescens og Immunohistochemistry
immunfluorescens ble utført på oktober-innvevde frosne vevssnitt. Seksjonene ble blokkert med 10% geiteserum og 10% BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur, inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C, deretter vasket og inkubert med Al-448 eller Al-466 geit-anti-rotte-sekundært antistoff (Invitrogen ) på 1:800 fortynning. Immunhistokjemi ble utført på formalinfiksert parafininnstøpte tumorsnitt. Seksjoner ble utsatt for oppvarmet antigen avmaskering oppløsningen i 30 minutter, stoppet i 0,3% hydrogen dioksyd i PBS i 15 minutter, blokkert med 10% geiteserum og 10% BSA i PBS i 1 time ved RT, deretter inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C, inkubert med biotinylert geit-anti-rotte-sekundært antistoff ved 1:800 fortynning i 30 minutter ved RT, og utviklet ved hjelp av ABC-kit (Vector Labs). Lysbilder ble kontra med hematoksylin. Snittene ble montert med Vectorshield og analysert ved fluorescens eller lysmikroskopi (Zeiss). Antistoffer inkluderer CD11b (M1 /70, R iNOS, 5′-GCTGGAAGCCACTGACACTTCG, 3′-CGAGATGGTCAGGGTCCCCT; IL-4, 5’GTCATCCTGCTCTTCTTTC, 3’ATGGCGTCCCTTCTCCTGT; IL-10, 5′-GCTCTTACTGACTGGCATGAG, 3′-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG; IL-12 p40, 5’TGGTTTGCCATCGTTTTGCTG, 3’ACAGGTGAGGTTCACTGTTT; IFNy, 5’GGATGCATTCATGAGTATTGC, 3’CCTTTTCCGCTTCCTGAGG; M-CSF, 5’AGGACCTGTTGGAGTTCCCTC, 3’TTTCGCCCTCACACTTGATGA; G-CSF, 5’CTCAACTTTCTGCCCAGAGG, 3’AGCTGGCTTAGGCACTGTGT; GM-CSF, 5’GCCATCAAAGAAGCCCTGAA, 3’GCGGGTCTGCACACATGTTA; Zeb1, 5′-AACGGAGATTTGTCTCCCAGT, 3′-CTGTCCAGCTTGCATCTTTTC; Zeb2, 5′-TAGCCGGTCCAGAAGAAATG, 3′-GGCCATCTCTTTCCTCCAGT; Snail, 5′-GCGGAAGATCTTCAACTGCAAATATTGTAAC, 3′-GCAGTGGGAGCAGGAGAATGGCTTCTCAC; Twist, 5′-CGGGTCATGGCTAACGTG, 3′-CAGCTTGCCATCTTGGAGTC; og GAPDH, 5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC, 3′-CTTCTCCATGGTGGTGAAGA.
Resultater
For å undersøke hvilken rolle Rip2 i tumor overvåking, vi utfordret villtype og Rip2-mangelfull mus med syngene MB49 celler i en orthotopic blærekreft modell. Vi har observert en nesten to ganger økning i tumorvekt i fravær av Rip2 (figur 1A). Svulster høstet fra mus av begge genotyper viste tegn til invasjon inn i detrusor muskelen ved H E flekker under lett mikroskopi med større svulster sett i Rip2-mangelfulle dyr (Fig 1b). Brutto og histologisk undersøkelse av indre organer avdekket et større antall metastaser i lungene og nyrene Rip2-manglende mus på en ca tre ganger og to ganger høyere forekomst henholdsvis i løpet av vill type kontroller (fig 1C-D). Ingen andre grove metastaser ble observert blant annet i leveren
Rip2
+ /+ og Rip2
-. /- Mus intravesikalt implantert med MB49 celler og ofret på 12 dager ble vurdert for blære tumor (A ) vekt, (B) histologi med H E farging ved x5 og x20 forstørrelse. C, Lunger ble undersøkt for metastasering av antall metastatiske lesjoner per koronale snitt,% insidens, histologi med H E flekker på x10 og x40 forstørrelse, og brutto undersøkelse. D, Nyrene ble undersøkt for metastasering av antall metastatiske lesjoner per koronale snitt,% forekomst, og histologi med H E flekker på x5 og x20 forstørrelse. Representative eksempler er vist. Kolonner, mener over 33 Rip2
+ /+ og 19 Rip2
– /- mus samlet fra 5 uavhengige eksperimenter; barer, SEM. Alle
p
verdier ble bestemt av tosidige Student
t
test, med statistisk signifikans definert som p 0,05
Vi har tidligere innblandet Rip2 i utvikling. av Th1 og NK-celler [10], mens andre rapportert en rolle i dendrittiske celleinfiltrasjon [17]. For å undersøke rollen til Rip2 i sammenheng med tumorgenese, ble blære tumor Tīlss undersøkt ved immunfluorescens og immunhistokjemi. Denne viste redusert infiltrering av CD8
+ T-lymfocytter, CD4
+ T-lymfocytter og NK-celler i fravær av Rip2 som forutsagt. Undersøkelse av foxp3
+ celler representant for T regulatoriske celler, viste en økende trend i Rip2-mangelfull mus sammenlignet med villtype mus selv om det ikke statistisk signifikant. Interessant, tumorer viste økt infiltrering av CD11b
+ myeloide celler i Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype-mus, mens ytterligere karakterisering av denne myeloid populasjonen viste en forventet økning i makrofag markør F4 /80 og i den Gr-1-subtypen Ly6G, men ikke subtype Ly6C i svulster fra Rip2-mangelfull mus (fig 2).
Infiltrasjon av CD8, CD4, NK, CD11b, F4 /80, Ly6G, og Ly6C uttrykke celler som angitt, ble undersøkt av immunfluorescens, og foxp3 ved immunhistokjemi i blæren svulster fra Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus intravesikalt implantert med MB49 celler og ofret på 12 dager. Venstre panelene viser spesifikt antistoff farging, viser midtre panelet DAPI farging, viser panelet rett sammenslåing av antistoff og DAPI flekker. Representative eksempler fra hver gruppe på fire til seks mus i 4 uavhengige eksperimenter er vist i x40 forstørrelse. Stolpediagrammene spesifisere midlere antall av celler pr x40 felt av 3 representative seksjoner fra grupper på fire mus; barer, SD. Alle
p
verdier ble bestemt av tosidige Student
t
test, med statistisk signifikans definert som p. 0,05
For ytterligere å undersøke funksjonen av tumor-infiltrerende populasjoner, vi subkutant implantert MB49-celler for å generere større svulster for å lette etterfølgende sortering av celler. I likhet med ortotopiske tumorer, subkutane tumorer utviklet i Rip2-manglende mus var av øket størrelse i forhold til vill-type motparter (figur 3A). Dissosierte tumorer sortert for CD45
+ NK1.1
+ NK-celler viste redusert antall i Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype-mus som forventet (fig 3B). Den infiltrerende antall CD4 og CD8-celler var for liten til å kvantifisere ved strømningscytometri (data ikke vist). I samsvar med tidligere ortotopiske svulster, dissosiert subkutane svulster sortert for overflatemarkører CD11b
+ og GR1
+ viste beriket tall fra CD11b
+ GR1
hi celler fra Rip2-mangelfull i forhold til villtype mus (fig 3C). For ytterligere å undersøke de funksjonelle egenskapene til CD11b
+ GR1
hi celler, undersøkte vi et panel av gener som representerer en signatur av MDSCs og myeloide subpopulasjoner. Arginase-en og iNOS megle mellom T undertrykkende effekten av MDSCs [25]. IFNy støtter differensiering mot M1 celler, preget i sin tur av sekresjon av IL-12. IL-4 polariserer myeloide forløpere mot en M2 fenotype, som er sterkt assosiert med tumorassosierte MDSCs og uttrykke IL-10 å megle sine immunsuppressive effekter [26]. Vi viser at Rip2-mangel CD11b
+ GR1
hi celler uttrykte høyere nivåer av arginase-en sammenlignet med celler fra villtype mus, med en lignende trend i iNOS uttrykk (Fig 3D). Konsekvent, økte IL-10-ekspresjon i Rip2-manglende CD11b
+ GR1
hi-celler sammenlignet med celler fra villtype-kontroller ble observert, mens ingen signifikante forskjeller ble sett i ekspresjon av IFNy og IL-12, som indikerer M2 polarisering (fig 3D). Nivåer av IL-4 var umulig å oppdage i CD11b
+ GR1
hi celler (data ikke vist)
Rip2
+ /+ og Rip2
-. /- Mus subkutant implantert med MB49-celler i 14 dager ble undersøkt for (A) tumorvekt, og sortert ved strømningscytometri for å undersøke (B) CD45
+ NK1.1
+ celler, og (C) CD45
+ CD11b
+ GR1
hei og CD45
+ CD11b
+ GR1
lo celler. Kolonne, mener fire mus; barer SD. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. D, Ordnet CD45
+ CD11b
+ GR1
hei og CD45
+ CD11b
+ GR1
lo celler i Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus ble undersøkt for ekspresjon av arginase-en og iNOS ved qPCR, mens CD45
+ CD11b
+ GR1
hi celler i Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus var kontrollert for ekspresjon av IL10, IL-12, og IFNy ved qPCR. Kolonne, mener to mus; barer SD. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Representative eksempler er vist. Alle
p
verdier ble bestemt av tosidige Student
t
test, med statistisk signifikans definert som p. 0,05
For å undersøke Rip-2- uselvstendige systemiske signaler som kan påvirke utviklingen av tumoren mikromiljøet, ble cytokinnivåer målt ved anvendelse av et inflammatorisk cytokin matrise sammenligne serum fra villtype og Rip2-manglende mus implantert med ortotopiske MB49 blæretumorer. Nivåene av syv cytokiner fra panelet omfatter 40 cytokiner ble funnet forhøyet i fravær av Rip2. De fleste var forbundet med myeloid differensiering og kjemotaksis, blant G-CSF, M-CSF, IL-16, MCP-1, TREM-1, TIMP-1 og IL-1α med relative nivåer er vist skjematisk [27] – [33 ] (fig 4A). Splenocytter fra tumorbærende mus ble analysert for å bedømme innflytelsen av disse cytokin forandringer, avslører ingen signifikante forskjeller i antall CD4
+ og CD8
+ T-lymfocytter, B220
+ B-lymfocytter, og NK1.1
+ -celler, men øket utvikling av CD11b
+ Ly6G
hi-celler i Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype-mus, som representerer den granulocytisk MDSC populasjonen (figur 4B). For ytterligere å undersøke den blære tumor mikromiljøet, undersøkte vi et panel av cytokiner som påvirker funksjonell polariseringen av makrofager, så vel som differensiering av MDSCs i intravesikal blæretumorer [34]. Økte nivåer av IL-4, G-CSF og GM-CSF ble observert i blæretumorer fra Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype-mus, mens ingen forskjeller ble funnet i IFNy og M-CSF-ekspresjon, i samsvar med en tumor mikromiljø fremme utvikling av tumorassosierte MDSCs (figur 4C). For å skille mellom cytokin produksjon fra svulsten og omkringliggende stroma til myeloide populasjoner, undersøkte vi G-CSF uttrykk i CD45
– befolkning representerer kreft og stromale celler, og CD11b
+ GR1
hi befolkningen representerer myeloide celler , og viste økt G-CSF i Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype-CD11b
+ GR1
hi-celler, noe som tyder på en autokrin og parakrin regulering av MDSCs i fravær av Rip2 (figur 4D).
A, inflammatorisk cytokin ekspresjon i serum av Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus intravesikalt implantert med MB49-celler i 12 dager, ble bestemt ved cytokin rekke analyse. Cytokiner økte i Rip2
– /- mus er vist i skjematisk som vist. (+) 2-5x, (++) 5-10x, (+++) 10x basert på kvantifisering av ImageJ. Resultatene er fra duplikater og representative for to uavhengige eksperimenter. B, Splenocytter fra Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus ble undersøkt for ekspresjon av CD4, CD8, B220, NK1.1, mens CD11b
+ celler ble undersøkt for ekspresjon av Ly6G og Ly6C ved strømningscytometri som angitt. Kolonne, mener fire mus; barer SD. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. C, Total svulst fra Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus intravesikalt implantert med MB49 celler og ofret på 12 dager ble undersøkt for uttrykk av IL4, IFNy, M-CSF, G-CSF og GM -CSF av qPCR. Kolonne, mener tre mus; barer SD. D, Svulster fra Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus subkutant implantert med MB49 celler for 14 dager ble fraksjonert til CD45
– og CD45
+ CD11b
+ GR1
hi celler og undersøkt for G-CSF uttrykk ved qPCR. Kolonne, mener tre mus; barer SD. Alle
p
verdier ble bestemt av tosidige Student
t
test, med statistisk signifikans definert som p. 0,05
MDSC befolkning består av umodne myeloide celler og myeloide cellestamfedre som kan differensiere til modne makrofager, granulocytter og dendrittiske celler. De karakteriseres ved T-lymfocytter undertrykkende evne og ekspresjon av arginase-1 og iNOS [25]. I mus, kan de være videre preget inn granulocytiske MDSCs ved ekspresjon av overflatemarkører CD11b
+ GR1
hi eller CD11b
+ Ly6G
+ Ly6C
lo og monocyttiske MDSCs ved uttrykk av markører CD11b
+ GR1
lo eller CD11b
+ Ly6G
loLy6C
hi [35]. For å teste den iboende rolle Rip2 i myelogen utvikling, naive benmarg fra villtype og Rip2-mangelfull mus ble utsatt for
in vitro
differensiering ved hjelp av M-CSF, G-CSF, GM-CSF, eller G -CSF og GM-CSF i 4 dager og undersøkt for ekspresjon av CD11b, Ly6G, og Ly6C. I nærvær av G-CSF, GM-CSF og G-CSF pluss GM-CSF, fravær av Rip2 resulterte i en skjevhet mot CD11b
+ Ly6G
+ Ly6C
lo granulocytisk MDSC populasjonen ( figur 5A). I BM-avledede MDSCs differensiert ved hjelp av G-CSF eller G-CSF og GM-CSF, økt arginase-1 og iNOS ekspresjon ble jevnt observert i Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype-celler, i overensstemmelse med den økte utvikling av MDSCs (fig 5B )
A, benmarg fra naive Rip2
+ /+ og Rip2
-. /- mus ble differensiert etter M-CSF, G-CSF, GM-CSF og G-CSF pluss GM-CSF som angitt i fire dager før flow-cytometri for å undersøke ekspresjon av Ly6G og Ly6C i CD11b
+ celler (som varierer fra 70-90%, som ikke er vist). CD11b
+ LYG
+ Ly6C
lo og CD11b
+ LYG
loLy6C
hi populasjoner for hver gruppe er vist som totalt celletall per 10
5 starter BM celler. B, Expression of arginase-en og iNOS ved qPCR i G-CSF og G-CSF pluss GM-CSF differensiert benmarg fra naive Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus. Kolonne, mener tre mus; barer SD. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. Representative eksempler er vist. Alle
p
verdier ble bestemt av tosidige Student
t
test, med statistisk signifikans definert som p. 0,05
MDSCs har vært innblandet i å fremme EMT , en prosess kritisk i å tilrettelegge tumorinvasjon og påfølgende kreftmetastaser [36]. Et kjennetegn på EMT er en bryter i overflate adhesjons markører med tap av E-cadherin og ekspresjon av N-cadherin [37]. For å undersøke påvirkning av Rip2 i utviklingen av EMT, vi undersøkte uttrykk for vedheft markører i intravesikal svulster og observert redusert E-cadherin uttrykk gjennom svulsten med samtidig økt N-cadherin uttrykk i perifert av svulsten i Rip2-mangelfull i forhold til vill -type mus (fig 6A). NF-kB-aktivering har vært implisert i å fremme EMT og dermed vi undersøkt dens aktivering i fravær av Rip2 [38]. I samsvar med tidligere litteratur, observerte vi redusert kanonisk NF-kB aktivering utstilt ved redusert p-IKB uttrykk i Rip2-mangel tumorer (figur 6B), noe som tyder på NF-kB uavhengige mekanismer for å ta høyde for EMT [39]. For å undersøke andre mekanismer fremme EMT, et panel av transkripsjonsfaktorer som er involvert i EMT inkludert
Zeb-en
,
Zeb-2
,
snegle
, og
vri
ble undersøkt i tumor og stromale celler fra dissosiert subkutane svulster tømt for CD45, med uttrykk for
Zeb-en
,
Zeb-2
, og
snegle
funnet økt i Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype-tumorbærende mus, og økt ekspresjon av
vri
nærmer seg statistisk signifikans (figur 6C). Vi har også undersøkt uttrykk for disse EMT induserende gener i lungene som inneholder metastaser fra Rip2 villtype og -deficient mus, avslører en lignende trend med statistisk signifikans for økt
vri
uttrykk i fravær av Rip2 (Fig 6D).
A, Rip2
+ /+ og Rip2
– /- mus intravesikalt implantert med MB49 celler for 12 dager ble vurdert for E-cadherin og N-cadherin uttrykk ved immunfluorescens. Forstørrelse av x40. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. B, Bar grafene nedenfor nummerere gjennomsnittlig antall celler per x40 innen 3 representative seksjoner fra grupper på fire mus; barer, SD. C, Expression of
Zeb-en
,
Zeb-2
,
snegle
, og
vri
ble undersøkt fra CD45
– dissosiert total svulstvev av qPCR. Kolonne, mener fire mus; barer SD. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. D, Expression of
Zeb-en
,
Zeb-2
,
snegle
, og
vri
ble undersøkt fra dissosierte lungene inneholder metastaser ved qPCR. Kolonne, mener fire mus; barer SD. Alle
p
verdier ble bestemt av tosidige Student
t
test, med statistisk signifikans definert som p. 0,05
Diskusjoner
den immun sammensetningen av tumoren mikromiljøet kan være prediktiv av sykdomsfri og total overlevelse. Dette er vist i sammenheng med CD4
+ T-lymfocytter og CD1α dendrittiske celler i aksillære lymfeknuter sammenfaller med sykdomsfri overlevelse hos brystkreftpasienter [40], til tumor-infiltrerende CD3
+ celler og CD8
+ T-lymfocytter i tykktarmen [1] og blærekreft henholdsvis [2]. Balansen i Tīlss kan avgrense prediktiv evne til immunmikromiljøet, som CD4
l ° CD48
l ° CD8
hi pasienter viste forbedret tilbakefall overlevelse, mens forholdet mellom CD8
+ T-celler til CD68
+ tumorassosierte makrofager spådd total overlevelse og respons på neoadjuvant kjemoterapi hos brystkreftpasienter [3]. Anti-tumor immunitet kan forsterkes ved å målrette negative regulatorer av T-celle co-stimulering som dokumentert av utvikling av anti-CTLA4 og anti-PD1 terapi, og kan utvides til å målrette Tregs og MDSCs [41]. Dette tyder på at aktiv programmering av tumorImmunmikromiljøet kan være et levedyktig strategi for å utnytte og skjevhet immunitet mot en anti-tumorrespons.
Vi har antatt at evnen til å sanse PRRS kontekstavhengige signaler fra patogener for å initiere en immunrespons er parallell ved evnen til DAMPS utgitt av cellulær skade i tumoren miljøet for å forme tumorimmunitet. NLRs inkludert Nod1 og NOD2 har vært innblandet i sensing ulike patogener samt cellulære påkjenninger [42]. Rollen til cytosoliske PRRS, slik som NLR familien i tumor overvåking er uklart. Nylig, tap av Rip2 har vært implisert i utviklingen av større kolorektal kreft i en murin modell [43]. I dette manuskriptet, viser vi at NLRs gjennom Rip2 signalering kan forme svulsten mikromiljøet mot tumor-infiltrerende CD8
+ T-lymfocytter, NK-celler, og undertrykkelse av MDSCs. På tilsvarende måte, i fravær av Rip2, større ortotopiske blæretumorer utviklet, så vel som økt tumormetastaser i både lunge og nyrer.
Rip2 ble opprinnelig beskrevet basert på sekvenshomologi til dens C-terminale domene CARD [44] . Vi utviklet Rip2-manglende dyr og beskrevet en rolle i medfødt immunitet impliserer Rip2 nedstrøms for Nod1, og adaptiv immunitet formidling av IFNy-responser i Th1 og NK utvikling [10]. Siden da har betydningen av Rip2 i NLR signalering og makrofagfunksjon validert og vist seg å spille en avgjørende rolle i medfødte immunsignaloverføring av Nod1 og NOD2 reseptorer [45]. I fravær av tumorvekst, fant vi ingen signifikante forskjeller i utviklingen av alle splenocytic linjene undersøkt inkludert CD11b
+ GR1
+ celler i Rip2-mangelfull sammenlignet med villtype mus. Men i nærvær av tumorvekst observert vi økt splenocytic CD11b
+ Ly6G
+ celler som representerer granulocytiske MDSCs i fravær av Rip2 [35].
Vi undersøkte den systemiske macroenvironment samt lokal mikromiljøet nivåer av cytokiner som ble endret ved fravær av Rip2 uttrykk. Interessant nok ble forhøyet serum cytokiner som er viktige for myeloid differensiering funnet i Rip2-manglende tumorbærende dyr, med økte nivåer av G-CSF og M-CSF, samt MCP-1 og TREM-1. MCP-1 er implisert i større regelmessighet og dårligere blærekreft prognose ved formidling av tumorinvasjon, mens TREM-1 har vært implisert i aktivering av Kuffner celler i leverkreft [27], [30].
