Abstract
Kjemoprevensjon presenterer en viktig strategi for medisinsk behandling av tykktarmskreft. De fleste stoffer som brukes for kolorektal kreft terapi indusere DNA-skade alkylering, som primært reparert av base excision reparasjon (BER) pathway. Således blokade av BER veien er et attraktivt alternativ for å hemme spredning av kolorektal kreft. Ved hjelp av en
i silico
tilnærming, utførte vi en struktur-basert skjerm med docking små-molekyler ut mot DNA polymerase β (Pol-B) og identifisert en potent anti-Pol-β sammensatte, NSC-124854. Vårt mål var å undersøke om NSC-124854 kan forbedre den terapeutiske effekten av DNA-alkylerende middel, Temozolomide (TMZ), ved å blokkere BER. Først bestemmes vi spesifisiteten av NSC-124854 for Pol-β ved å undersøke
in vitro
aktiviteter APE1, Fen1, ligase DNA jeg, og Pol-β-rettet enkelt nukleotid (SN) – og lang-lapp (LP) -BER. For det andre, undersøkte vi effekten av NSC-124854 på effekten av TMZ til å hemme veksten av mismatch reparasjon (MMR) -deficient og MMR-dyktig tykktarmskreft cellelinjer ved hjelp av
in vitro
klonogene analyser. Tredje, vi utforsket effekten av NSC-124854 på TMZ-indusert
in vivo
tumorvekstinhibitering av MMR-mangelfulle og MMR-dyktig colonic xenografter implantert i hunn homozygote SCID-mus. Våre data viste at NSC-124854 har høy spesifisitet til Pol-β og blokkerte Pol-β-rettet SN- og LP-BER aktiviteter i
in vitro
rekonstituert system. Videre NSC-124854 effektivt indusert følsomheten av TMZ til MMR-mangelfull og MMR-dyktig kolon kreftceller både
in vitro
cellekultur og
in vivo
xenograft modeller. Våre funn tyder på en potensiell ny strategi for utvikling av svært spesifikk struktur basert hemmer for forebygging av tykktarmstumorprogresjon
Citation. Jaiswal AS, Banerjee S, Aneja R, Sarkar FH, Ostrov DA, Narayan S (2011) DNA Polymerase β som Novel Target for kjemoterapeutiske Intervensjon av tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (2): e16691. doi: 10,1371 /journal.pone.0016691
Redaktør: Ben Ko, Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 04.10.2010; Godkjent: 03.01.2011; Publisert: 02.02.2011
Copyright: © 2011 Jaiswal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (R01 CA-097 031 og CA-100247). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen og den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [1]. I år 2010 vil anslagsvis 102,900 nye kolorektal tilfeller bli diagnostisert og 51,370 dødsfall vil skje i bare USA. Selv i de siste to tiårene en merkbar fremgang har blitt gjort i behandlingstilbud, er dødeligheten av denne sykdommen ikke mye bedre. Derfor er nye behandlinger for å forbedre den prognose av denne sykdommen. I mange år har det første valget av kjemoterapeutiske stoffet for tykktarmskreft vært 5-Fluorouracil (5-FU). Den er mest brukt som neoadjuvant behandling med stråling og i kombinasjon med flere andre kjemoterapeutiske legemidler, slik som mitomycin, cisplatin, oksaliplatin, camptosar, eloxatin, Avastin, Erbitux, og Vectibix for behandling av kolorektal kreft som blir spredning [2]. Disse stoffene gir best resultat ved høyere doser, men gi alvorlige bivirkninger, inkludert drap på friske celler i slimhinnen i munnen, slimhinnen i mage-tarmkanalen, hårsekkene, benmargen og forårsake leverskade og hypertensjon [3].
Mutasjoner i
adenomatøs polypose coli (APC)
genet er en tidlig hendelse i familiær adenomatøs polypose (FAP), et syndrom der det er en arvelig predisposisjon for tykktarmskreft [4], [5]. De fleste mutasjoner av
APC
-genet forekommer i mutasjonen klynge region (MCR) og resulterer i produksjon av et avkortet protein. Denne avkorting kompromitterer flere funksjoner i APC, som er involvert i kromosomal ustabilitet og unormal funksjon av Wnt-signalveien, cellesyklusregulering, stabilisering av mikrotubulære cytoskjelettet, celle-celle interaksjoner og DNA rep y [6] – [14]. Nyere studier tyder på at den kjernefysiske APC, gjennom en region (aminosyrene 1441-2077) som er avkortet i flertallet av kolorektal tumorer, samarbeider i rekrutteringen av DNAPKcs til skadet DNA kromatin og forbedrer tidlig respons på dobbel tråd pauser (DSB ) DNA-reparasjon [15]. APC samhandler også direkte med genomisk DNA, fortrinnsvis med A /T rike sekvenser [16], noe som tyder på en rolle for APC i DNA replikasjon [17]. Det har blitt foreslått at APC gjennom dens C-terminale enden (aminosyrene 2140 til 2421) interagerer med DNA og negativt regulerer cellesyklusutvikling ved inhibering av DNA-replikasjon ved direkte interaksjon med DNA [17]. Vi har tidligere vist at behandling med DNA-alkylerende midler øker nivået av APC i kolorektal kreftceller [14]. I tillegg demonstrerte vi at APC interagerer med DNA-polymerase β (Pol-β) og klaff-endonuklease 1 (Fen1) og blokkerer Pol-β styrt enkelt-nukleotid (SN) – og lang-lapp (LP) -base eksisjon reparasjon (BER) aktiviteter for å påvirke cellulær respons på kjemoterapi [14], [18]. Basert på disse studiene, ser det ut til at samspillet av APC med Pol-β og andre BER proteiner kan være et passende mål for kjemoterapeutisk intervensjon av kolorektal kreft vekst.
Bruk av DNA-alkylerende midler som cellegifter er basert på deres evne til å utløse en celledød reaksjon [19], og deres terapeutiske effekt er bestemt av balansen mellom DNA-skade og reparasjon. De DNA-alkylerings skade-indusert lesjoner er reparert av BER, O
6-metylguanin DNA-metyltransferase (MGMT) og mismatch reparasjon (MMR) veier. Mange colontumorer bli resistent mot DNA-alkylerende midler på grunn av overekspresjon av MGMT eller MMR-mangel [20]. Cellene som mangler MGMT er ikke i stand til å behandle O
6meg under DNA-syntese, og hvis det ikke er reparert, en G: T oppstår overgang mutasjonen [21]: C til G. I tidligere studier har rollen til BER reaksjonsveien også vært involvert i cellulær resistens overfor TMZ [22], [23], som er avhengig av bestemte BER genekspresjon og aktivitet [24]. I de siste årene har kreft narkotika som er utviklet i hovedsak være rettet mot MGMT og MMR trasé [25], [26]. Siden MMR-manglende kolorektal kreft utgjøre en større risiko for resistens mot DNA-alkylerende midler på grunn av overekspresjon av MGMT eller MMR-mangel [27] – [29], er det avgjørende å oppdage et kjemoterapeutisk strategi som kan være nyttig for behandling av både MMR-mangelfulle og MMR-dyktig kolorektal tumorer. Interessant, men BER er ansvarlig for reparasjon av 70%, 5% og 9% av N
7-metylguanin (MEG), N
3-MEG, og N
3-metyladenin (MEA) lesjoner henholdsvis indusert av DNA-alkylere medikament temozolomid (TMZ, NSC-362856) [23], [30], [31], den potensielle nytten av BER pathway blokade ikke har blitt grundig undersøkt. Således, med en kombinasjon av BER-blokkerende midler og TMZ behandling, det kliniske resultatet av kjemoterapeutisk effekt av TMZ kan forbedres. Tidligere studier støtter også at DNA alkylering-indusert skade er primært repareres av BER vei [26], [27]. I det siste har BER veien vært brukt som et mål for utvikling av nye legemidler, men den kliniske implikasjonen av disse stoffene er fortsatt under etterforskning [31] -. [36]
TMZ har blitt brukt for behandling av metastatisk melanom og glioblastoma multiforme, sistnevnte i kombinasjon med radioterapi [37], [38], men har vist seg å være mindre effektive i behandling av andre maligniteter. En fase II kliniske studie av TMZ i forhåndsvalgt avanserte aerodigestive veis kreft, inkludert tykktarms svulst, har nylig blitt gjennomført av Schering-Plough, Kenilworth, NJ, og viser bare en delvis respons på behandlingen (https://clinicaltrials.gov/CT2 /vise /NCT00423150). I en tidligere fase I kliniske studier av TMZ, en partiell reaksjon av stoffet på metastatisk kolorektal kreft ble også observert, noe som tyder på betydelig tumorresistens til behandling [39]. For å overvinne motstanden av TMZ, ble en fase II klinisk studie gjennomført i hvilken lomeguatrib ble kombinert med TMZ, men resultatene var ikke veldig viktig [40]. Det er derfor et stort behov for utviklingen av en ny strategi ved hvilken effekten av TMZ kan økes for behandling av kolorektal kreft.
Siden de fleste kjemoterapeutiske medikamenter forårsaker DNA-skade og motstand på grunn av aktivering av DNA-reparasjon pathway (s), rettet mot proteiner av disse reaksjonsveien (e) for å blokkere deres aktivitet kan være en lovende strategi for utvikling av nye medikamenter med høyere effekt i forhold til både kjemoterapi-resistente og sensitive tumorer. I de senere år har strukturbasert virtuell konstruksjon og den tredimensjonale struktur av et medikament-target-interaksjon med lav molekylvekt inhibitorer blitt brukt til å lede begrunnelsen drug discovery [41]. Dataassistert drug design kunne finne nye blyforbindelser og hjulpet i strukturen optimalisering for biologiske og farmakologiske tester [42] – [44]. I den foreliggende undersøkelse, utførte vi struktur-baserte molekylære dokking av Pol-β på stedet hvor adenomatøs polypose coli (APC) samvirker og blokker Pol-β-rettet BER [14], [45], [46]. Strukturen-baserte molekylære dokking er ansett som en egnet metode for utvikling av nye medisiner, fordi denne metoden er rettet mot spesifikt protein og spesifikke reaksjonsveien [47]. Basert på i silikoaluminofosfater arbeid har vi identifisert en svært potent liten molekylvekt inhibitor, NSC-124854 {[5- (4-amino-6-jod-2-okso-5,6-dihydropyrimidin-1-yl) -3- hydroksy-oksolan-2-yl] methoxyphosphonic syre}, som spesifikt interagerer med Pol-β og blokkerer Pol-β styrt enkelt-nukleotid (SN) – og lang-lapp (LP) -BER. Her presenterer vi data som beskriver at NSC-124854 kan forbedre effekten av TMZ i MMR-mangelfulle og dyktige tykktarmskreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
modeller. Vi foreslår at disse pre-kliniske funn vil etablere et nytt paradigme for klinisk behandling av tykktarmskreft.
Resultater
Screening av små molekyler til å hemme Pol-β-rettet strand-forskyvning aktivitet
For å identifisere en potent anti-Pol-β sammensatte, brukte vi en
i silico
high-throughput struktur-basert molekylær docking tilnærming og vist ca 140.000 små molekyl forbindelser (molekylvekt 500 dalton) for deres evne til å samhandle med APC-bindingssetet for Pol-β (fig. 1
A
) [48]. De 22 høyeste poeng små molekylære forbindelser ble forespurt fra Therapeutics Program Developmental (DTP) av National Cancer Institute (NCI) for en undersøkelse. Vi har utført en innledende screening av forbindelser for å bestemme deres evne til å inhibere Pol-β-rettede trådfortrengningssyntese. Vi brukte en
in vitro
reconsitiuted analysesystem i disse studiene. Vi screenet 22 toppen scoring forbindelser og data fra 12 forbindelser er vist her (fig 2
A
-.
C
). Blant 22 små molekyler, NSC-21371 og NSC-91855 hemmet Pol-β-rettet strand-forskyvning syntese på 125 mikrometer konsentrasjon (fig 2
B
;. Sammenligne spor 3 med baner 9-13 og 19-23 , henholdsvis). Disse små molekylære forbindelser ikke påvirker 1-nt inkorporering aktivitet (24-mer-produkt) av Pol-β til enhver undersøkt konsentrasjon. Men NSC-124854 hemmet Pol-β-rettet strand-forskyvning aktivitet på fem mikrometer konsentrasjon, mens høyere konsentrasjoner av NSC-124854 helt avskaffet dannelsen av Strand-forskyvning produkter (fig 2
A
;. Sammenligning av spor 3 med baner 4-8 henholdsvis). Når konsentrasjonen av NSC-124854 ble ytterligere øket til 50 uM eller mer, ble det 1-nt inkorporering (24-mer-produkt) aktivitet av Pol-β fullstendig blokkert, som vist ved akkumulering av 23-mer innsnitt produkt og mangel på ett -nt innlemmelse produkt, som reflekterer et fullstendig tap av Pol-β-aktivitet (fig. 2
en
, sammenlign spor 3 med 4-8, henholdsvis). Disse resultater antyder at NSC-124854 er en mest potent inhibitor of Pol-β aktivitet blant alle de testede forbindelsene.
Panel
A
viser den predikerte interaksjonen av NSC-124854 basert på krystallstrukturen Pol-β. Pol-β er vist i gull og sidekjeder spådd å danne kontakter med NSC-124854, Asp17 og Arg89, er avbildet med gull for karbon, blå for nitrogen og rødt for oksygen. APC bindende lomme rester, Thr79, Lys81, Arg83 av Pol-β er vist som kuler farget grå for karbon, blå for nitrogen og rødt for oksygen. Polar kontakter er avbildet som gule stiplede linjer mellom NSC-124854 og Pol-p rester Lys81 og Arg89. Figuren ble gjort med PyMol. Panel
B
viser Pol-p-ligand interaksjoner spådd basert på poserte molekylære docking orientering av NSC-124854. Interaksjoner mediert av hydrogenbindinger (grønn) og av hydrofobe (grå) kontakter vises. NSC-124854 og Pol-β er vist i svart for karbon, blå for nitrogen og rødt for oksygen. Inter-atomic obligasjoner fra NSC-124854 vises i magenta. Inter-atomic obligasjoner av Pol-β er vist i gull. Hydrogenbindinger, er angitt med stiplede linjer mellom de involverte atomer, mens hydrofobe kontakter er representert av en bue med eiker som stråler mot NSC-124854 atomer de er i kontakt. De kontaktet Pol-p-atomer er vist med eiker som stråler tilbake. Figuren ble gjort med HBPLUS og LigPlot.
For å bestemme effekten av forbindelser på blokkering av Pol-β-aktivitet, vi samlet
in vitro
strand-forskyvning syntese analysen med renset APE1 precut
32P-merket 63-mer F-DNA og Pol-β. Panel
En plakater (NSC-124854, NSC-143995, NSC-160172 og NSC-263659),
B plakater (NSC-10730, NSC-21371, NSC-43656 og NSC-91855) og
C plakater (NSC-274937, NSC-351093, NSC-668472 og NSC-674711) viser effekten av små molekyler på Pol-β-rettede trådfortrengningssyntese. I hvert panel viser kjørefelt en 63-mer
32P-merket F-DNA, kjørefelt 2 viser 23-mer produkt etter APE1 snitt, kjørefelt 3 viser en-nt inkorporering (24-mer) og Strand-forskyvning produkter. Baner 4-8, 9-13, 14-18 og 19-23 viser strengFortrengningsAktiviteten Pol-β inkubert med 0, 5, 10, 25, 50 og 125 uM, henholdsvis, av de angitte forbindelser. Dataene er representative for to eksperimenter.
lite molekyl hemmer, NSC-124854, spesielt blokker Pol-β aktivitet
Vi videre fastslått om NSC-124854 er en spesifikk hemmer av foru- β aktivitet eller den kan også blokkere aktiviteten av andre enzymer BER. Vi først bestemt IC
50 av NSC-124854 for Pol-β-rettet strand-forskyvning syntese. Dette eksperimentet var den samme som beskrevet i screening forsøket, bortsett fra at vi valgte lavere konsentrasjoner for å bestemme den IC
50 av NSC-124854. Vi kvantifisert de trådfortrengningssyntese produkter (fig. 3
A
, kolonnene 3-10, henholdsvis) og plottet som en prosent endring fra NSC-124854-mediert blokkering av Pol-β-aktivitet (Fig. 3
B
). Behandlingen med NSC-124854 viste en nedgang doseavhengig i tråd-forskyvning syntese aktivitet med en IC
50 på 5,3 mikrometer (Fig. 3
B
). Disse resultater antyder at NSC-124854 har en sterk hemmende effekt på Pol-β-rettede trådfortrengningssyntese.
For å bestemme affiniteten av NSC-124854 for blokkering av Pol-β-rettede tråd-fortrengningsaktivitet , bestemt vi sin IC
50 i et rekonstituert analysesystem som i beskrevet i figur 2. Panel
A
viser autoradiogram av tråden-forskyvning aktivitet. Lane 1 viser
32P-merket 63-mer F-DNA, kjørefelt 2 viser 23-mer produkt etter APE1 snitt, og kjørefelt 3 viser strand-forskyvning aktivitet av Pol-β. Lanes 4-10 viser effekten av 0,5-20 mikrometer av NSC-124854 på Pol-β-aktivitet. Panel
B
viser IC
50 data. NSC-124854 inhiberte Pol-β-rettede tråd-forskyvning aktivitet på en doseavhengig måte med en IC
50 på 5,3 uM. Dataene er representant for to uavhengige beregninger.
Deretter bestemmes vi om NSC-124854 kan hemme aktiviteten av andre BER pathway enzymer som apurinic /apymidinic endonuklease 1 (APE1), Fen1 og DNA ligase I. Resultatene viste at NSC-124854 ikke inihibit aktivitetene til disse enzymene (fig 4
A
-.
C
, henholdsvis). Fra disse resultatene, konkluderte vi med at den hemmende effekten av NSC-124854 var svært spesifikk for Pol-β og ikke påvirke aktiviteten til andre BER enzymer.
Panel
A
viser effekten av NSC-124854 på APE1 aktivitet. APE1 (10 nM) ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av NSC-124854 (0,5-20 uM, baner 3-9, henholdsvis) og
32P-merket 63-mer F-DNA. Lanes 1 og 2 viser uncut
32P-merket 63-mer F-DNA og 23-mer snitt produkt, henholdsvis. Panel
B
viser effekten av NSC-124854 på Fen1 aktivitet. Fen1 (10 nM) ble inkubert med ulike konsentrasjoner av NSC-124854 (0,5-20 mikrometer, baner 3-9, henholdsvis) og
32P-merket 51-mer flakset-DNA. Bane 1 viser plasseringen av 51-mer merket oligonukleotid og felt 2 viser 11-mer spaltes klaff produkt. Panel
C
viser effekten av NSC-124854 på DNA ligase Jeg aktivitet. I DNA-ligase (5 nM) ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av NSC-124854 (0,5-20 uM, baner 3-9, henholdsvis), etterfulgt av tilsetning av 2,5 nM
32P-merket 63-mer nicked DNA. Felt 1 viser 23-mer merket oligonukleotid (nicked produkt) og felt 2 viser 63-mer ligert produkt. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter
Små molekyl hemmer NSC-124854 blokker single-nucleotide (SN) -. Og lang patch (LP) -BER aktiviteter i et rekonstituert
in vitro
assay
Basert på molekyl dokking analyse, blir NSC-124854 forutsagt for å danne polare (H-bindinger) interaksjoner med aminosyreresiduer Lys81 og Arg89 og en ikke-polar (van der Waals) interaksjon med aminosyrerest Asp17 på overflaten av Pol-β [48], [49]. Disse restene er i umiddelbar nærhet av APC bindende lomme (aminosyreresidier Thr79, Lys81 og Arg83) (Fig. 1
B
). De anslåtte kontakter foreslå flere direkte kontakt mellom NSC-124854 og Pol-β, som kan muligens etterligner samspillet av APC med Pol-β. Siden disse data tyder på at NSC-124854 i kombinasjon med TMZ som en mulig kjemoterapeutisk behandlingsstrategi for tykktarmskreft, foretok vi en studie for å fastslå effekten og begrensninger av denne strategien.
Selv om vi bestemt spesifisitet NSC- 124854 for Pol-β-aktivitet som vist i fig. 3 og 4, var det nødvendig å undersøke effekten av denne forbindelsen når den komplette BER system av SN- og LP-BER er satt sammen. Disse eksperimentene vil gi biokjemiske bevis for styrken av NSC-124854. Vi brukte 63-mer
32P-merket U-DNA som et substrat (Fig. 5
A
) for SN-BER. Siden Fen1 er nødvendig for LP-BER aktivitet og kan stimulere Pol-β aktivitet for strand-forskyvning syntese [50], [51], vedtok vi samme strategi for å bestemme effekten av NSC-124854 på LP-BER (Fig. 5
B
). Etter APE1 snitt, ble det forventet 23-mer produkt generert (fig 5
C
;. Sammenligne kjørefelt 1 med 2). Resultatene viste effektiv 1-nt inkorporering (24-mer-produkt) ved Pol-β som ble ligert med DNA ligase for å generere I 63-mer reparerte produkt (fig. 5
C
, spor 5). Tilsetningen av Fen1 stimulert Pol-β aktivitet for trådfortrengningssyntese (fig. 5
C
, spor 4), som også ble ligert med DNA ligase for å generere I 63-mer reparerte produkt (fig. 5
C
, spor 6). Tilsetningen av NSC-124854 blokkerte Pol-β-rettede 1-nt tilsetning (24-mer produkt i fravær av Fen1) (fig. 5
C
, sammenlign spor 3 med 7), så vel som Strand- forskyvning syntese i nærvær av Fen1 på en doseavhengig måte (fig. 5
C
, sammenlign spor 4 med baner 8-11, henholdsvis). Videre er fullstendig reparasjon av SN- og LP-BER under trasé etter tilsetning av DNA ligase Jeg ble også blokkert av NSC-124854 på en doseavhengig måte (Fig. 5
C
, sammenlign spor 12 -15 og henholdsvis 16-19,).
paneler
A og B
representerer protokollene fra SN- og LP-BER, henholdsvis. Panel
C
viser autoradiogrammet som beskriver effekten av varierende konsentrasjoner av NSC-124854 på SN- og LP-BER aktiviteter. Felt 1 viser 63-mer
32P-merket U-DNA, Bane 2 viser 23-mer produkt etter APE1 innsnitt, Bane 3 viser en-nt inkorporering av Pol-β, spor 4 viser tråd-forskyvning produkter etter tilsetning av Fen1. Lanes 5 og 6 viser den 63-mer ligert produkt av SN- og LP-BER aktiviteter, henholdsvis. Lane 8-19 viser effekten av NSC-124854 på blokkering av 1-nt (24-mer-produkt) inkorporering. Lanes 8-11 skildre NSC-124854-mediert blokk med strand-forskyvning syntese. Videre kolonnene 12-15 og 16-19 baner viser effekten av NSC-124854 på blokkeringen av SN- og LP-BER-aktivitet på en doseavhengig måte. Data er en representant for tre forskjellige eksperimenter.
Uttrykk for villtype APC forårsaker resistens mot TMZ behandling som er avskaffet ved behandling med NSC-124854
I tidligere studier, vi har vist at APC samhandler med Pol-β og Fen1 og blokker SN- og LP-BER aktiviteter [14], [45], [46], [52] – [54]. Vi har også vist at HCT-116 celler (uttrykker villtype APC) er mer følsomme for methylmethane sulfonat (MMS) og TMZ behandlinger enn HCT-116-APC (KD) celler (slått ned APC med pSiRNA) [36], [45], [46]. I denne studien, bestemt vi følsomheten til TMZ i nærvær av NSC-124854 til flere tykktarmskreft cellelinjer (HCT-116, HCT-116-APC (KD), HCT-116 + CH3, Caco-2, HT29, SW480, LoVo og RKO) ved hjelp av en klonogene analyse [18], [36], [46]. IC
50 Resultatene viste at alle cellelinjene som ble testet viste høyere følsomhet for kombinasjonsbehandling av NSC-124854 med TMZ (tabell 1). IC
50 data viste at NSC-124854 var i stand til å øke veksthemmende effekten av TMZ til både HCT-116 og HCT-116-APC (KD) cellelinjer; var imidlertid effekten større i HCT-116 enn i HCT-116-APC (KD) celler (tabell 1). Disse resultatene bekrefter våre tidligere funn om at villtype APC ved å hemme BER pathway øker følsomheten av DNA-alkylaying legemidler [36], [46], [54]. Imidlertid kan andre cellelinjer som uttrykker enten villtype eller avkortet APC, såsom RKO (310 kDa), SW480 (147 kDa), Caco-2 (150 kDa), LoVo (120 kDa) og HT29 (110 og 200 kDa) viste ikke en direkte korrelasjon av rollen til APC i sensitiviteten av disse stoffene. Disse resultatene tyder på at andre enn mutasjoner i arvelige faktorer
APC
genet kan også spille en rolle i å bestemme sensitiviteten av NSC-124854 og TMZ til forskjellige tykktarmskreftceller. Ett av de kritiske parametrene for dette differensial følsomhet styres av differensial status for MMR aktivitet, som er omtalt nedenfor.
Kombinasjonsbehandling av NSC-124854 forbedrer veksthemmende virkning av TMZ på MMR-mangelfull og MMR-dyktig tykktarmskreftceller
MMR proteiner er involvert i kjemoterapeutiske respons av tykktarmskreftceller, og feil i MMR protein (e) er til stede i arvelig nonpolyposis tykktarmskreft (HNPCC) [55]. To av MMR proteiner er oftest mutert i humane kreftformer, MLH1 og MSH2. MMR-manglende celler er ofte resistente mot DNA-alkyleringsmidler [55]. For å finne ut hvilken rolle MMR i kombinasjonen effekten av NSC-124854 med TMZ på veksthemming, brukte vi flere MMR-dyktige og MMR-mangeltykktarmskreft cellelinjer. HCT-116, HCT-116-APC (KD), og RKO cellelinjer er mangelfull i MMR grunn av mangel på ekspresjon av hMLH1, et nøkkelenzym i denne reaksjonsvei [56], mens LoVo-celler er MMR-mangelfull på grunn av fravær av MSH2 uttrykk [57]. Den HCT-116 + ch3 celle har blitt gjort MMR-dyktig ved å innføre en enkelt kopi av kromosom 3 huse
hMLH1
genet [58]. TMZ er kjent for å forårsake motstand mot MMR-manglende celler [26]. I tidligere studier, har det blitt foreslått at avbrudd av BER reaksjonsvei kan oppheve legemiddelresistens forårsakes av MMR-mangel [59]. I denne studien, bestemt vi om behandling av TMZ sensitizes MMR-dyktige celler relativt flere enn MMR-manglende celler, og om blokaden av BER sti ved NSC-124854 kan avskaffe TMZ motstand mot MMR-manglende celler. Som forventet, MMR-dyktig cellelinjer SW480 (IC
50 108,1 ± 3,2 mm), HCT-116 + CH 3 (IC
50 130,7 ± 4,3 mm) og Caco-2 (IC
50 449,2 ± 42,4 mm), med unntak av HT29 (IC
50 962,7 ± 62,7 mm) viste en høyere følsomhet for TMZ sammenlignet med MMR-mangelcellelinjer HCT-116 (IC
50 739,0 ± 25,9 mm), HCT-116- APC (KD), (IC
50 877,7 ± 49,2 mm), LoVo (IC
50 838,8 ± 53,1 mm) og RKO (IC
50 1572,6 ± 89,9 mm) (tabell 1). Videre er kombinasjonsbehandling av NSC-124854 ytterligere redusert IC
50 av TMZ med to ganger i alle de syv cellelinjene uavhengig av deres status av MMR-aktivitet (tabell 1). Disse resultatene tyder på at kombinasjonen behandling av NSC-124854 med TMZ kan være en nyttig kjemoterapeutisk strategi for forvaltningen av både MMR-mangelfulle og MMR-dyktig kolorektal tumorer.
Kombinasjon av NSC-124854 med TMZ kan brukes som en potensiell kjemoterapeutiske tilnærming for å øke colonic tumorvekst
in vivo
for å ytterligere bekrefte
in vitro
resultatene av effekten av kombinasjonsbehandling av NSC-124854 og TMZ med et godt karakterisert og spesifikke målet for Pol-β å redusere dosene av TMZ som kan eliminere bivirkninger og samtidig avskaffe MMR-motstand, vi utført en
in vivo
xenograft studie med alvorlig kombinert immunsvikt ( SCID, mangler funksjonelle T- og B-celler) mus, som beskrevet i figur 6
A
. Vårt valg for hunnmus ble basert på fersk studie beskriver at de estimerte nye tilfeller av tykktarmskreft i 2009 ble anslått til å være høyere hos kvinner enn hos menn [60]. Vi valgte en dose på 20 mg /kg kroppsvekt av TMZ for disse forsøk, som er 10- og 4-ganger lavere enn den maksimalt tolererte dose hos mus og mennesker, henholdsvis [61] – [65]. Dessuten er den dose på 10 mg /kg kroppsvekt for NSC-124854 mer enn 20 ganger lavere enn dens IC
50 i kultur (tabell 1). Selv om vi ikke har bestemt den høyeste tolererte dose (MTD) av NSC-124854 i mus, er valgt konsentrasjon veldig mye i tryggere område.
Panel
A
viser skjematisk fremstilling av forsøksprotokoll. Panel
B
viser endringen i tumorvolum på 42
nd dag av forsøket. Dataene presentert er gjennomsnittet ± SD av fire til seks dyr i hver gruppe. *, Vesentlig annerledes enn kontroll;
†, vesentlig annerledes enn NSC-124854. P . 0,05
Disse stoffene ble gitt intraperitonealt (.
i.p.
) i fem påfølgende dager. Veksten inhibering av tumorer ble overvåket inntil 42 dager. Resultatene viste en økning i tumorvolumet i kontrollgruppen i en tidsavhengig måte for alle cellelinjer,
ie
, HCT-116, HCT-116-APC (KD) og HCT-116 + CH3. Tumorvolumet nådde et maksimum på 1,120 mm
3 i løpet av 42 dager etter implantasjon xenograft, som er vist i figur 6
B
. Den tumorvekst i ubehandlet HCT-116 xenograft var høyere enn HCT-116-APC (KD) og HCT-116 + ch3 celler. Anti-tumoreffekten til TMZ alene var signifikant forskjellig i HCT-116 + CH3-celler (MMR-dyktig) og var mindre uttalt i HCT-116 og HCT-116-APC (KD) celler (fig. 6
B
). Behandling med NSC-124854 alene reduserte også veksten av tumorer med alle cellelinjer, som var mer uttalt når det ble kombinert med TMZ (fig. 6
B
). Disse resultatene tyder på at kombinasjonen behandling av NSC-124854 forbedrer den terapeutiske effekten av TMZ like godt i både MMR-mangelfull og MMR-dyktig xenograft tumor modell
in vivo
. For å bestemme toleransen for medikamentene, vi registrert kroppsvekten til dyrene to ganger i uken til slutten av forsøket. Resultatene viste en tilsvarende gevinst i kroppsvekt av kontroll og behandlet gruppe av dyr med NSC-124854 og strålebehandling alene eller i kombinasjon (data ikke vist). Dermed ser det ut til at doser på 10 mg /kg kroppsvekt for NSC-124854 og 20 mg /kg kroppsvekt for TMZ var godt tolerert og ikke forårsake noen åpenbare uheldige bivirkninger i våre forsøksdyr.
diskusjon
i tidligere studier har Pol-β blitt brukt som et mål for kjemoterapeutisk legemiddelutvikling [23], [34], men nådde ikke utover den pre-klinisk nivå. Effektiviteten av de foregående forbindelsene har vært mindre effektiv fordi de krever meget høye konsentrasjoner for å oppnå den ønskede cytotoksisitet
in vitro
og de ble ikke undersøkt systematisk
in vivo
. Videre ble de i hovedsak rettet mot blokkere SN-BER. Bruken av TMZ for behandling av andre enn glioblastom og melanom maligniteter har vært begrenset, spesielt for behandling av kolorektale tumorer, på grunn av mindre uttalt virkning på undertrykkelse av tumorvekst [39], [40]. I den foreliggende undersøkelse har vi brukt struktur-baserte molekylære tilnærming for å identifisere små molekyler som kan etterligne interaksjonen av APC med Pol-β og blokk Pol-β-rettet BER som kan benyttes som et kjemoterapeutisk mål. Vår strategi for molekylær docking i APC-bindende lomme med Pol-β var å identifisere et lite molekyl som kan blokkere både SN- og LP-BER aktiviteter og demonstrere cytotoksisitet i både
in vitro Hotell og
i vivo
analyser ved lavere konsentrasjoner
Spesielt, hvis det lykkes, den foreslåtte strategien vil være svært effektiv i forebygging av både MMR-dyktige og MMR-mangel kolorektal kreft.; Dette er viktig fordi MMR-mangel kolorektal kreft utgjør en større risiko for resistens mot DNA-alkylerende medikamenter på grunn av over-uttrykk for MGMT eller MMR-mangel [27] – [29]. Cellene mangelfulle i MGMT er ikke i stand til å behandle O
6meg under DNA-syntese, og hvis reparasjon, en G: oppstår T overgang mutasjon [27]: C til G. G: T mismatch deretter reparert av MMR vei [28]. Men hvis O
6meg ikke reparert før re-syntese skritt i MMR, vil trolig settes inn overfor lesjon i tymin. Det antas at den gjentatte syklus av intetsigende MMR resultatene i en generasjon av tertiære lesjoner, mest sannsynlig gapped DNA.
