Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) har vært innblandet i kontrollen av mange biologiske prosesser og deres deregulering har vært forbundet med mange kreftformer. I de senere år har kreftstamcelle (CSC) konsept blitt anvendt på mange kreftformer, inkludert pediatrisk. Vi antok at en felles signatur av deregulerte miRNAs i cscs brøkdel kan forklare forstyrret signalveier i cscs.
Metodikk /Resultater
Ved hjelp av en høy gjennomstrømming qPCR tilnærming vi identifisert 26 CSC forbundet forskjellig uttrykt mirnas (DEmiRs). Bruke BCmicrO algoritme 865 potensielle CSC forbundet Demir målene ble oppnådd. Disse potensielle mål ble utsatt for KEGG, Biocarta og Gene ontologi sti og biologiske prosesser analyse. Fire kommenterte trasé ble beriket: cellesyklus, celleproliferasjon, p53 og TGF-beta /BMP. Knocking ned
HSA-MIR-21-5p
,
HSA-MIR-181c-5p Hotell og
HSA-MIR-135b-5p
hjelp antisensoligonukleotider og små interfering RNA i cellelinjer førte til utarming av CSC brøk og nedskrivning av sfære dannelse (CSC surrogat-analyser).
Konklusjon
Våre funn indikerer at CSC tilhørende DEmiRs og de antatte trasé de regulerer kan ha potensielle terapeutiske anvendelser i pediatriske kreft
Citation:. Sanchez-Diaz PC, Hsiao TH, Chang JC, Yue D, Tan MC, Chen H-IH, et al. (2013) De regulerte microRNAs i Pediatric Cancer Stem Cells Target Pathways involvert i celleproliferasjon, cellesyklus og utvikling. PLoS ONE 8 (4): e61622. doi: 10,1371 /journal.pone.0061622
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 19 september 2012; Godkjent: 11 mars 2013; Publisert: 17 april 2013
Copyright: © 2013 Sanchez Diaz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Semp Russ grunnlaget for den område Foundation San Antonio (tildelt Jyh), Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT, RP101195, tildelt GET og YC), National Institutes of Health (NIH-NCI P30CA54174, tildelt CTRC på UTHSCSA, YC og NIH-NCATS UL1TR000149, tildelt CTSA på UTHSCSA, YC), den Greehey Graduate Fellowship i barns helse (tildelt JCC) og Ambassadors «Circle fond i Greehey Barnas Cancer Research Institute finansiert en del av dette arbeidet. FACS ble gjort i flowcytometri Shared Resource Facility, som er støttet av NIH-NCI P30CA54174 (CTRC på UTHSCSA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (miRNA) er en rikelig klasse av små (~22 nukleotider) ikke-kodende enkelttråd RNA (ncRNA) som regulerer genekspresjon på en post-transkripsjonsnivået. Disse regulerings ncRNAs spiller viktige roller i kontrollen av mange biologiske prosesser og deres deregulering har vært innblandet i en rekke patologiske tilstander, inkludert mange kreftformer.
Emerging bevis støtter forestillingen om at de fleste kreftformer har sin egen «stamceller «, referert til som» cancer stamceller «(cscs). Dette reservoar av stilk-liknende celler i tumormassen har evnen til å fornye seg selv og for å opprettholde den ubøyelige veksten av massen. Flere studier har vist at mirnas er involvert i selvfornyelse og celle-fate avgjørelser av stamceller, kontroll av cellesyklus og å opprettholde balansen av celleproliferasjon, differensiering og apoptose [1], [2], [3], [ ,,,0],4]. Nylig har studier vist at mekanismene som regulerer den selvfornyelse naturen av disse cellene er dysfunksjonell i kreft stamceller [5]. Vi foreslår at de definerende trekk ved cscs kan beskrives i form av et sammenhengende mønster av genuttrykk som er regulert av spesifikke, abnormt uttrykt mirnas koordinert mot vedlikehold og selvfornyelse av kreft stamceller. Reguleringen av selvfornyelse og evnen til å generere avkom er basert på felles gener og mekanismer. Denne undergruppe av gener som uttrykk er deregulert av mirnas kan forklare forstyrret signalveier i cscs.
I konvensjonell genekspresjon dataanalyse, berikelse analyse av differensial uttrykte gener har blitt brukt til å utforske de underliggende signalveier og genet ontologispråk funksjoner [6], [7], [8]. Strategien gir en tolkning prosessen fra differensial uttrykte gener til trasé eller funksjoner via et gen satt berikelse algoritmer [9]. Nylig har flere algoritmer blitt utviklet for å forutsi miRNA målgener ved sekvens-homologi mellom 3′-UTR og miRNA frø region [10], [11], [12]. Gjennom den anslåtte målgener av mirnas [11], flere studier utforsket metoder for å kommentere funksjoner av mirnas som metode for pathway mål i bevaring berikelse eller co-målretting parene slik at de dominerende funksjonene kan dukke opp via «hub» mirnas [13 ], en permutasjon basert statistisk metode som tester for over- eller underrepresentasjon av miRNA mål i en bestemt sett av målgener [14], [15], [16], [17] og har nylig gitt ut mirDIP som kombinerte 12 mål prediksjon algoritmer for å danne miRNA interaksjons nettverk [18]. Men alle disse algoritmene utnytter bare målet forutsigelse informasjon, uavhengig av ekspresjonsnivåene av mirnas, kombinert med det faktum at en miRNA mål enn 100 gener [19], slik at slutning til funksjoner eller trasé fra et sett av mirnas ikke er spesifikke for en biologisk objektiv altfor komplisert.
Forskjellig fra nevnte algoritmer, foreslo vi en ny algoritme som kombinerte et sett av miRNA mål prediksjon algoritmer med en bayesiansk ordning for å integrere prediksjon styrke, og deretter bygge miRNA-pathway par av ytterligere integrere begrepet gen sett anriking med et differensielt uttrykte mirnas (DEmiRs). Den berikelse trinnet oppnås ved første kartlegging mirnas «uttrykk på sine målgener priset etter sin prediksjon styrke, da både berikelse score (ES) og Fishers eksakte test ble utført over et gen sett eller en vei til å utforske den antatte regulering utøves fra DEmiRs .
cscs har blitt beskrevet i mange barndommen solide tumorer. Disse svulstene er ansett som en gruppe av heterogene svulster, men med tilsvarende og unike genetiske egenskaper. Nyere bevis tyder på at endringen av den normale utviklingsprosessene er en viktig faktor i barndommen solid tumor patogenesen. Biologien til de fleste barnekreftformer er forskjellig fra voksne kreftformer, for det meste, på grunn av deres blastoma opprinnelse. Barn med medfødte genetiske lidelser ofte utvikle flere typer barndommen solide tumorer. Disse observasjonene tyder på at det kan være visse veier som deles i en rekke forskjellige barndoms solide tumorer [20].
I denne studien har vi identifisert vanlige cscs forbundet DEmiRs i 6 pediatriske solide tumorcellelinjer. Vi brukte en høy gjennomstrømming QRT-PCR tilnærming for å kartlegge global miRNA uttrykket i sin CSC brøkdel. Deretter påføres vårt nye miRNA-reaksjonsveien krets algoritme for å belyse egenskapene til CSC. I tillegg studerte vi de potensielle effektene av noen av de DEmiRs i cscs av genet stanse.
Resultater
hierarkisk Clustering av kreftstamceller mirnas
Bruke neurosfærer og ALDEFLUOR® surrogat analyser som lesestrategier rettet mot berikende en stilk-lignende kreftcelle (CSC) populasjonen, hadde vi avdekket konkrete DEmiRs som ble feilregulert i denne populasjonen. Vi profilert seks pediatriske cellelinjer, Hep293TT, HepG2, MG-63, Daoy, SH-SY5Y, og RD-ES bruker TaqMan mikroRNA Micro Fluid Kort Analyser og real-time PCR-analyse (Applied Biosystems). Vi utførte kvalitetskontroller undersøker spredningsplott av alle miRNA uttrykket nivåer (ΔCt) i de 6 cellelinjene som ble testet (figur S1 i File S1). De scatter plott av ΔCt sammenligne stammen lignende beriket brøkdel vs. deres ikke stilk-lignende kolleger vise konkordans (korrelasjonskoeffisient 0,75). Som beskrevet i materialer og metoder seksjon, vi oppnådd 380 DEmiRs med ekspresjonsnivåer 2,2 ganger opp eller ned regulert i CSC fraksjonene i forhold til deres ikke-kreft stamcelle referanse fraksjon. Med disse 380 DEmiRs, valgte vi mirnas som ble forskjellig uttrykt i minst fire av våre 6 cellelinjer for å tillate en viss grad av feiltoleranse. Muligheten for å velge en Demir ved tilfeldig sjanse var 0,017 (binomialdistribusjon). Hierarkisk clustering ble utført på følgende 380 DEmiRs, som vist i figur 1A. De mirnas av HepG2 og Hep293TT (hepatoblastoma) og Daoy (medulloblastoma) ble gruppert sammen, mens RD-ES (Ewing sarkom) og MG-63 (osteosarkom) og SH-SY5Y (neuroblastom) ble gruppert sammen. En gruppe på 26 DEmiRs (23 oppregulert og tre nedregulert) ble funnet (figur 1B), inkludert
HSA-MIR-21-5p
,
HSA-MIR-148a-5p
,
HSA-MIR-181a-5p
,
HSA-MIR-323-3p
, og
HSA-MIR-487b-3p
, som sterkt uttrykt, og
HSA-MIR-19a-5p Hotell og
HSA-MIR-25-5p
, som nedregulert DEmiRs.
(A). De uttrykk verdier av 380 DEmiRs ble målt og hierarkisk clustering ble utført. Uttrykket profilen til HepG2 og Hep293TT ble gruppert med Daoy. RD-ES og MG-63 er gruppert sammen med SH-SY5Y. Forskjellig uttrykt mirnas (b). Tjueseks mirnas med minst to ganger endring i 4 eller flere cellelinjer ble valgt. Tjuetre mirnas var opp regulert og tre ble nedregulert.
miRNA Target Tippe
For å identifisere de antatte målgener av DEmiRs, målgenet prediksjon algoritme, BCmicrO [21 ] som er beskrevet i Materialer og metoder ble brukt på DEmiRs. I alt ble 865 antatte mikroRNA målgener (630 opp regulert og 235 ned regulert) identifisert (figur S2 i File S1). I vår analyse hvert Demir i gjennomsnitt hatt 38 spådd målgener, med unntak av
HSA-MIR-138-2-3p
,
HSA-MIR-655
, og
HSA -miR-101-3p
, hver med mer enn 100 spådd målgener. I tillegg fant vi også at to DEmiRs,
HSA-MIR-487b-3p Hotell og
HSA-MIR-517c-3p
, hadde 7 og 25 mål gener, henholdsvis spådd av TargetScan algoritme. Men disse DEmiRs ikke passere utvalgskriterium for BCmicrO (se Materialer og metoder).
berikelse Analyser av miRNA Regulerte Pathways
å forutsi hvilke trasé våre 26 cscs DEmiRs kan regulere vi brukte miRNA-mRNA-parene som oppnås som beskrevet ovenfor for reaksjonsveien og funksjon berikelse analyser. De gensettene fra KEGG, Biocarta trasé og Gene ontologi (GO) når det gjelder biologisk prosess ble brukt. Vi fant 8, 12 og 34 elementer med statistisk signifikans i KEGG vei, Biocarta sti og Gene ontologi, henholdsvis (tabell 1, 2, 3). Seks av de 8 beriket elementene i KEGG vei tilhørte forskjellige krefttyper: småcellet lungekreft, prostatakreft, kronisk myelogen leukemi, gliom, melanom, og kreft i bukspyttkjertelen. Blant de gensettene, mange cellesyklus og celleproliferasjon relaterte gener som
CDKN1A
,
CDKN1B
,
E2F1
,
PTEN Hotell og
RB1
ble regulert av differensielt uttrykte mirnas (tabell S1 i File S1), noe som indikerer celleproliferasjon for å være en viktig funksjon reguleres av CSC tilhørende DEmiRs. P53-pathway ble også beriket siden 15% av genene i denne veien (
P
0,001,
ES
= 2,18) var mål for våre DEmiRs (tabell 1). Vår metode spådd et sett med 10 gener involvert i p53 sti som potensielle mål for
HSA-MIR-21-5p
,
HSA-Mir-29b
,
HSA-speil 135b-5p
,
HSA-MIR-494
, og
HSA-MIR-655 plakater (Figur 2A). Spesifikke funksjoner av p53 sti som kan bli berørt av disse DEmiRs var cellesyklus arrest, apoptose, hemming av angiogenese og metastasering, DNA-reparasjon og skadeforebyggende, hemming av TGF-1 /mTOR vei, og p53 negativ feedback (figur 2A, vist eske ut i rødt).
(A). P53-bane som inkluderer 8 signalkomponenter som definert av KEGG var sterkt regulert av CSC forbundet DEmiRs. Fem av de 26 DEmiRs ble innblandet i denne veien,
HSA-MIR-21-5p, HSA-MIR-135b, HSA-MIR-29, HSA-MIR-655, HSA-MIR-494
. TGF-beta sti KEGG (B). TGF-beta sti ble også regulert av CSC forbundet DEmiRs. Receptor
TGFBR1
ble regulert av
HSA-MIR-101-3p
,
og Selge reseptor
TGFBR2
ble regulert av
HSA-speil 21-5p
, og
HSA-MIR-519a-3p
. Reseptoren
BMPR2
ble regulert av
HSA-MIR-101-3p, HSA-MIR-21-5p, HSA-MIR-181c-5p, og HSA-MIR-494
. Nodal type II reseptor kinase og reseptor
ACVR2B
ble også regulert av
HSA-MIR-101-3p
.
et annet viktig vei i cellesyklusregulering, TGF-beta /BMP vei, ble også anriket (
P =
0,001,
ES
= 2,28; Tabell 1). Ni gener inkludert 4 reseptorer,
TGFBR1
,
TGFBR2
,
ACVR2B Hotell og
BMPR2
og en ligand, TGF-beta, ble regulert med 8 (
HSA-MIR-181c-5p
,
HSA-MIR-21-5p, HSA-MIR-101-3p
,
HSA-MIR-494, HSA-MIR-655 , HSA-mi-519a-3p, HSA-MIR-29b-3p, HSA-MIR-132-3p)
av 26 CSC tilhørende DEmiRs, som vist i figur 2B. Som antydet i figur 2B, kan endring i TGF-beta og BMP-reseptorer interferere med Smad-avhengig signalisering i cscs, kanskje noe som resulterer i perturbert vekst-arrest, apoptotiske og differensieringsprogram. Således er tapet av TGF-beta følsomhet forårsaker deregulering av cykliner, CDK og CDK-inhibitorer, blandet med feilregulering i p53-trasé støttet vår forutsigelse om at disse CSC forbundet DEmiRs kan ha en rolle i reguleringen av cellesyklusen og celleproliferasjon. Berikelse analyse av Biocarta trasé, videre støttet resultatene oppnådd fra KEGG trasé (tabell 1). Fire kommenterte Biocarta trasé, cellesyklus, G1, P53, og RACCYCD, ble også knyttet til cellesyklusen (tabell 2,
P
0,001 for alle 4 veier). Pathways illustrasjoner sammen med CSC tilhørende DEmiRs målgener er gitt i Figur S3 A-D i File S1. TGF-beta /BMP sti viste også berikelse i Biocarta analyse (tabell 2,
P
= 0,001), derfor bekrefter vår KEGG pathway forutsigelse. Andre veier oppnådd i Biocarta berikelse analysen var CTCF, TOB1, ALK og PTEN trasé (tabell 2,
P
verdi mindre eller lik 0,001). Noen kjente gener i disse banene er
TGFBR1
,
TGFBR2
, og
TGFB
,
SMAD
familie og
PTEN
, videre støtter involvering av våre CSC forbundet DEmiRs i celleproliferasjon og cellesyklusen. De biologiske prosessene i Gene ontologi ble også brukt i vår berikelse analyse. Tretti-fire GO termer ble beriket (
P
0,01, tabell 3). Biologiske prosesser knyttet til celleproliferasjon som Positiv Regulering av Mesenchymale Cell Proliferation (
P
0,007,
ES
= 2,66), Negative Regulering av epitelcelleproliferasjon (
P
0,001,
ES
= 2,44), G1 fase mitotisk Cell Cycle (
P
0,001,
ES
= 2,29), Positive Regulering av fibroblast spredning (
P
0,001,
ES
= 2,04), Positive Regulering av B-celleproliferasjon (
P
= 0,001,
ES
= 1,70) , Positive Regulering av proliferasjon av glatte muskelceller (
P
0,001,
ES
= 1,61) og cellevekst (
P
= 0,004,
ES
= 1,53) ble beriket i vår CSC tilhørende DEmiRs. Noen biologiske prosesser korrelerte med kreft biologi, vaskulogenese, cellulær respons overfor hypoksi, sårheling, og respons på bestråling, ble anriket i tillegg (tabell 3). BMP signalering og TGF-beta viste også opp som beriket baner i GO analyse, ligner KEGG og Biocarta sti analyser. Signalveier, så som positiv regulering av proteinkinase B signaleringskaskade, aktivering av proteinkinase C-aktivitet av G-proteinkoblet reseptor-protein-signalreaksjonsveien, viste også betydelig berikelse i GO-analyse (tabell 3).
Functional evaluering av HSA-MIR-21-5p, HSA-MIR-181c-5p og HSA-MIR-135b-5p in vitro
for å etterforsknings det mulig funksjonell relevans i «stemness» av
HSA-MIR -21-5p
,
HSA-MIR-181c-5p Hotell og
HSA-MIR-135b-5p
, vi utførte knockdown eksperimenter på Daoy og SK-N-BE (2 ) -celler. Stengte Nucleic Acid (LNA ™) anti-sense knockdown av
HSA-MIR-21-5p
redusert brøkdel av ALDH
BR celler (surrogat CSC markør) med 50% i Daoy (figur 3A). Vi testet effekten av
HSA-MIR-181c-5p Hotell og
HSA-MIR-135b-5p
hemming på evnen til å vokse som Neurosfærene i Daoy og SK-N-BE (2 ) hhv. I begge tilfeller, til evnen til å danne kuler (utlesning til selvfornyelse) ble svekket. Resultater fra
HSA-MIR-135b
knockdown i SK-N-BE (2) er vist i figur 3B. Til sammen disse observasjonene foreslått en mulig rolle
HSA-MIR-21-5p
,
HSA-MIR-181c-5p Hotell og
HSA-MIR-135b-5p
i regulering av selvfornyelse i Daoy og SK-N-BE (2) cscs.
(A). Omtrent en to-fold reduksjon i fraksjonen anriket for stilk-lignende celler ble observert i
HSA-MIR-21-5p
knockdown. Dataene som vises, er representative for tre uavhengige eksperimenter.
HSA-MIR-135b-5p
hemming på evnen til å danne neurosfærer i SK-N-NE (2) (B). En nedskrivning av sfære dannelse ble sett i SK-N-BE (2)
HSA-MIR-135b-5p
stabil knockdown.
HSA-MIR-135b-5p
KD1, KD2 og KD3 var fra samme klon. Data representerer tre uavhengige eksperimenter, presentert som gjennomsnitt ± SEM.
Diskusjoner
I denne studien identifiserte vi en felles signatur av de regulert mirnas forbundet med cscs og spådd noen kandidat trasé berørt i cscs fra pediatriske svulster. CSC fraksjon innenfor de seks cellelinjer ble samlet ved hjelp av ulike surrogat analyser. Tjueseks forskjellig uttrykt mirnas (DEmiRs) ble identifisert i CSC brøkdel av fire ut seks cellelinjer. Dette inkluderte mirnas med kjent rolle i cscs funksjon (for eksempel
HSA-miR21-5p
), men også nye mirnas (for eksempel
HSA-MIR-487b Hotell og
HSA-speil 323-3p
). Det var slående å se at 6 av de CSC forbundet DEmiRs har blitt rapportert av andre grupper som mirnas innblandet i CSC funksjon (er) ved å regulere sentrale utviklingsveier [22] – [28]. For å få innsikt i plausible rollen som 26 CSC tilhørende DEmiRs, vi slått ned tre av CSC tilhørende DEmiRs med kjente funksjoner på cscs. Vi viste at
HSA Anmeldelser –
MIR-21-5p, HSA-MIR-181c-5p Hotell og
HSA-MIR-135b-5p
hadde en effekt på CSC brøkdel målt ved hjelp ALDH
BR og neurosfære formasjon som surrogatmarkører. Våre data var lik studier av andre grupper som viste en involvering av disse DEmiRs i CSC trasé [22] – [28]. Disse observasjonene antydet at videre studier er nødvendig for å karakterisere disse CSC tilhørende DEmiRs pediatriske kreftformer.
Vi har også innført en systembiologi metode for å forutsi trasé og funksjoner av disse CSC tilhørende DEmiRs. En bayesiansk tilnærming BCmicrO [21], [29] ble ansatt som integrator av flere mål prediksjon algoritmer. En kortfattet matematisk modell (Eq. 2) ble presentert for å kartlegge mirnas til skoleveien forskriften eller andre funksjonelle grupper. Berikelse analyse for differensielt uttrykte gener ble vellykket anvendt, sammen med Fishers eksakte test for å fastslå betydelige aktive stier i vår studie. Vår metode gitt en unik berikelse analyse som kombinerte differensial uttrykk for DEmiRs og målet prediksjon styrke til å forstå regulering på en sti eller funksjonelt nivå ved å fokusere på de antatt DEmiRs målgener. Ved hjelp av differensial uttrykk nivået DEmiRs, vi forventet mer innsikt i DEmiRs regulering og deres funksjoner gjennom vår metode.
Selv om den funksjonelle effekten av de fleste miRNAs er fortsatt ukjent, vi utnyttet miRNA målrettede gener spådd
i silico
å oppdage funksjonene til Demir regulering og mulig intervensjon. Vår metode gir dermed en bro fra DEmiRs til sti og funksjon regulering. Det matematisk analyse av disse 26 CSC tilhørende DEmiRs avdekket at disse DEmiRs kan bare regulere fire merkede stier: celleproliferasjon, cellesyklus, p53 og TGF-beta /BMP (tabell 1 og 2). Det er velkjent at Notch, Wnt, pinnsvin og PTEN /Akt er sentrale utviklingssignalveier som orkestrere celleproliferasjon, cellesyklus og celle skjebne
in vivo
. De-regulering i disse fire hovedsignalveier har i stor utstrekning blitt demonstrert i cscs. Våre CSC forbundet DEmiRs er involvert i de sentrale utviklingssignalbaner, som angitt ovenfor. Seks av de 26 CSC forbundet DEmiRs:
HSA Anmeldelser –
MIR-19a-5p product: [22],
HSA Anmeldelser –
MIR-25-5p
[23], [24],
HSA-MIR-181c-5p product: [25],
HSA-MIR-21-5p
anmeldt i [26],
HSA
–
MIR-135b-5p product: [27] og
HSA-MIR-148a-5p product: [28] har kjent funksjon (er) i cscs. I denne forbindelse, biologisk validert mål av
HSA-MIR-21-5p Hotell og
HSA-MIR-135b-5p
, som er oppført i tabell 4, er kartlagt til PTEN /Akt, Notch og /eller wnt stier og er avgjørende for CSC selvfornyelse i ulike cellulære sammenhenger [26], [27]. Vår beregnings analyse kartlagt forskjellig uttrykt
MIR-181c-5p
til Notch signalveien (tabell 4) og benmorfogenetisk protein (BMP) veien (figur 2B) en annen CSC selvfornyelse vei, begge kjent for å crosstalk med Wnt (anmeldt i [30]). Derfor kan vi anta at i våre modellsystemer,
HSA-MIR-21-5p
,
HSA-MIR-135b-5p Hotell og
HSA-MIR-181c-5p
kan regulere celledeling og cellesyklus sannsynlig ved å påvirke PTEN /Akt, Notch og /eller Wnt signalveier.
I sammendraget, vi kartlagt 6 pediatriske kreftcellelinjer for CSC forbundet DEmiRs som kanskje regulere CSC funksjoner. Bruk begge mål prediksjon score og differensial mirnas «uttrykk, og en roman berikelse algoritme spesielt utviklet for mirnas uttrykk profiler spådde vi trasé som ble rettet av disse DEmiRs i CSC. Gitt betydningen av utviklingsveier som Notch og Wnt, våre funn som presenteres i denne studien antydet flere mål for prognostisk og terapeutisk intervensjon hos barn kreft.
Materialer og Metoder
Cellelinjer
Menneskelige barn kreft cellelinjer Daoy (medulloblastoma); SK-N-BE (2) og SH-SY5Y (neuroblastom), HepG2 (hepatoblastoma), RD-ES (Ewings sarkom), og MG-63 (osteosarkom) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og opprettholdt i ATCC anbefalte kulturmediet. Alle kulturmedier ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Atlanta® Biologicals) og 1% antibiotika-antimycotic, amfotericin B, penicillin og streptomycin (Gibco®, Life Technologies ™). Hep 293TT (hepatoblastoma) er et nytt menneske lever svulst cellelinje etablert i vårt laboratorium utledet ved hjelp av primære tumor vev fra et 5-år gammel kaukasisk kvinnelig barnet [31]. Hep293TT celler ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende L-glutamin og 25 mM HEPES (Mediatech) og supplert med 10% FBS (Atlanta® Biologicals) og 1% antibiotisk-antimykotisk, amfotericin B, penicillin og streptomycin (Gibco®, Life Technologies ™ ). Cellelinjene ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% karbondioksid.
neurosfære Formation Assay
En
in vitro
selektivt kultursystem betegnet som neurosfærene analysen ble brukt til å berike Daoy, SK-N-BE (2), SH-SY5Y, RD-ES og MG-63 cscs. Ved hjelp av en veldefinert protokollen, og i nærvær av vekstfaktorer inkludert basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og epidermal vekstfaktor (EGF), er det mulig å fremstille en fornyelse kilde stilk lignende kreftceller, som kan utvides som neurosfærer . Cellene ble trypsinert og suspendert på 2 × 10
4 celler /ml deretter sådd ut på ultra lave festeplater (Corning) i serumfritt vedlikehold medium for humane embryonale stamceller (mTeSR ™ 1, Stem Cell Technologies). Etter ca 2 dager, ble primær kuler dannet med ca. 100 celler pr sfære. For å evaluere selvfornyelse, ble enkelte sfærer høstet og disaggregert til encellede suspensjoner og serielt passert for to generasjoner.
Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) og ALDEFLUOR® analysen
Hep293TT og HepG2 stilk liknende fraksjoner ble anriket ved hjelp av FACS for å identifisere celler med høy enzymatisk aktivitet av aldehyddehydrogenase (ALDH) ved hjelp av ALDEFLUOR® Assay (Stem Cell Technologies) ifølge produsentens instruksjoner. Denne analysen beriket cellefraksjon med høy ALDH-aktivitet som leses ut for stammen lignende befolkning. I korthet BODIPY ™ aminoacetaldehyd (BAAA), et substrat for ALDH, ble tilsatt, og når eksitert ved 488 nm, ble stammen lignende celler med høy ALDH-aktivitet detektert og styrt av deres grønn fluorescens ved 515-545 nm. Denne rense stilk-lignende celler ble bekreftet ved bruk av diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en spesifikk inhibitor av ALDH, som en negativ kontroll. Cellesortering ble utført med en FACS Aria (FACS Diva v 6.1.2 programvare; Becton Dickinson). Levedyktige celler ble inngjerdet ved hjelp propidiumjodid (PI).
RNA Utvinning og High-throughput mirnas Kvantifisering
Celler ble høstet og total RNA ble isolert ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion) i henhold til produsentens anvisninger. Integritetskontroller (målt som RNA Integrity nummer, RIN) og prøve kvantifisering ble utført ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). miRNA profilering ble utført ved hjelp av en høy gjennomstrømming rask stilk-løkke kvantitativ polymerase chain reaction (QRT-PCR) assay i en high-throughput 384 brønner format (mikroRNA Micro Fluid kort Analyser «kjemi, Applied Biosystems) i henhold til produsentens protokoll Totalt av 768 modnet miRNAs og kontroller som finnes i det menneskelige genom, kommenterte i miRBase registeret (https://microrna.sanger.ac.uk) ble profilert. I det første trinnet, ble cDNA revers transkribert fra total RNA prøver (2 ng /mL fortynning) ved hjelp av to dammer av spesifikke stilk-sløyfe RT-primere. De transkriberte cDNA ble lastet inn to sett med microfluidic kort (pool A og B), hvert basseng som inneholder tørket opp unike TAQMAN primere og prober (375 mirnas og 9 normalisering kontroll). QRT-PCR ble brukt til å forsterke cDNA med bestemte preamp primere og ble utført på en ABI Prism 7900HT real-time PCR system i en 384 godt format; med basseng A og B kjører separat. Her ble analysene utført i tre paralleller i to uavhengige eksperimenter. QRT-PCR termisk sykling betingelser inkludert 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 5 minutter, deretter 40 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 30 sekunder. Dataene fra stammeliknende anrikede fraksjoner og deres ikke-stammen som motstykker ble analysert ved hjelp av sammenlignende C
T terskelsyklus metode (2
-ΔΔCT) Fremgangsmåte for relativ kvantifisering (ΔΔCt = ΔCt sample-ΔCt kalibrator; hvor ΔCt prøve = Ct stilk-lignende celler-Ct stilk-lignende celle normalisering kontroll, og ΔCt kalibrator = Ct ikke stilk-lignende celler-Ct ikke stilk-lignende celle normalisering kontroll).
knockdown av HSA-MIR -135b-5p
miRZip-135b anti-MIR-135b miRNA konstruksjonen ble kjøpt fra System biovitenskap (SBI). Konstruerer kom som bakteriell striper. En enkelt koloni ble plukket og dyrket i LB buljong (Fisher Scientific) med 50 mikrogram /ml ampicillin (Gibco®, Life Technologies ™). Plasmidene ble inkubert over natten ved 37 ° C og samlet opp neste dag. Plasmider ble renset i henhold til PureLink® Hurtig Plasmid Miniprep Kit (Life Technologies ™) produsentens protokoll. Renset plasmid-DNA ble transfektert inn i SK-N-BE (2) celler. I korthet, SK-N-BE (2) celler ble sådd i en 6-brønn plate på 8 x 10
5-celler /brønn. Celler ble dyrket i antibiotikadyrkningsmedium over natten. -Celler ble transfektert med 4 ug av DNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Life Technologies ™) i henhold til produsentens protokoll. Kort, DNA og Lipofectamine ble inkubert i separate rør som inneholder 250 mL av OptiMem (Gibco®, Life Technologies ™). Plasmid-DNA og Lipofectamine ble deretter slått sammen og inkubert i 20 min. Cellene ble vasket med OptiMem og frisk OptiMem ble tilsatt til hver brønn. Plasmid-DNA og Lipofectamine blanding ble deretter tilsatt til hver betegnet brønn og inkubert i 24 timer. Etter 24 timer ble GFP uttrykk målt for å bestemme transfeksjonseffektiviteten. For å generere en stabil cellelinje, ble cellene passert og dyrket i vekstmedium inneholdende 1 mikrogram /ml puromycin (Gibco®, Life Technologies ™).
knockdown av
HSA-MIR-21-5p
og
HSA-MIR-181c-5p
med Anti-sense LNA ™ Oligonukleotider
Daoy cellene i eksponentiell vekstfase ble sådd i 6-brønners plater (TPP, Techno Plastic Products) 8 × 10
4 celler /brønn og dyrket i antibiotika gratis media for ~24hours, etterfulgt av transfeksjon av miRCURY LNA ™ knockdown prober for
HSA-miR21-5p Hotell og
HSA-miR181- 5pc product: (Exiqon Inc.), ved hjelp av oligofectamine og OPTIMEM® serumfritt medium (Life Technologies ™), i henhold til produsentens protokoll. 6 timer etter transfeksjon, ble mediet med serum tilsatt, deretter 24 timer etter transfeksjon, ble mediene endret til sin vanlige vekstmedium (Minimum Essential Medium Eagles (Mediatech), 10% FBS (Atlanta® Biologicals) og 1% antibiotisk-antimykotisk; amfotericin B, penicillin og streptomycin (Gibco®, Life Technologies ™). Ingen probe (mock) ble brukt som negativ kontroll.
Statistisk dataanalyse for miRNA profilering
mikroRNA uttrykk kvalitetskontroll.
mikroRNA uttrykk data generert med microfluidic kort analysene ble først undersøkt av spredningsplott sammenligne alle prøvene (Figur S1 i File S1) hvor miRNA uttrykk nivåer (ΔCt) av stammelignende beriket fraksjoner og deres non stilk-lignende kolleger var plottet. resultatene bør utvise en viss grad av samsvar (vi velger korrelasjonskoeffisient å være større enn 0,75), ellers vil en replikering bli kalt til å bekrefte resultatet eller erstatte den mislykkede testen.
uttrykt forskjellig mirnas (DEmiRs [33].
