Abstract
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er assosiert med tap av celle-celle adhesjon molekyl E-cadherin og forstyrrelse av celle- celle veikryss samt med oppkjøpet av trekkende egenskaper, inkludert omlegging av aktin cytoskjelettet og aktivering av RhoA GTPase. Her viser vi at depolymerisering av aktin cytoskjelettet av ulike metastatisk kreft cellelinjer med Cytochalasin D (Cyt D) reduserer cellestørrelse og F-aktin nivåer og induserer E-cadherin uttrykk på både protein og mRNA nivå. Induksjon av E-cadherin var doseavhengig og parallelt tap av mesenchymale markører N-cadherin og vimentin. E-cadherin nivåene økte 2 timer etter tilsetning av Cyt D i celler som viser en E-cadherin mRNA reaksjon, men bare etter 10-12 timer i HT-1080 fibrosarcoma og MDA-MB-231 celler i hvilke E-cadherin mRNA-nivå var bare minimalt påvirket av Cyt D. Cyt D behandling indusert atom-cytoplasma translokasjon av EMT-forbundet Snai en og SMAD1 /2/3 transkripsjonsfaktorer. I ikke-metastatisk MCF-7 brystkreft celler, som uttrykker E-cadherin og representerer en kreftcelle modell for EMT, aktin depolymerization med Cyt D indusert forhøyet E-cadherin mens aktin stabilisering med Jasplakinolide redusert E-cadherin nivåer. Forhøyede E-cadherin nivåer på grunn av Cyt D var assosiert med redusert aktivering av Rho A. Uttrykk for dominant-negative Rho En mutant økt og dominerende aktive Rho En mutant redusert E-cadherin nivåer og også hindret Cyt D induksjon av E-cadherin. Redusert Rho En aktivering nedstrøms av aktin ombygging induserer derfor E-cadherin og reverserer EMT i kreftceller. Cyt D behandling hemmet migrasjon og, ved høyere konsentrasjoner, fremkalt cytotoksisitet av både HT-1080 fibrosarkom celler og normale fibroblaster Hs27, men bare induserte mesenchymale-epitelial overgang i HT-1080-kreftceller. Våre studier tyder på at aktin ombygging er et oppstrøms regulator av EMT i metastatiske kreftceller
Citation. Shankar J, Nabi IR (2015) Actin Cytoskjelett Regulering av epithelial Mesenchymale Overgang i metastatisk kreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0119954. doi: 10,1371 /journal.pone.0119954
Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 18 juli 2014; Godkjent: 26 januar 2015; Publisert: 10 mars 2015
Copyright: © 2015 Shankar, Nabi. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Cancer Research Society stipend (IRN), en kanadisk Breast Cancer Foundation postdoktorstipend (JS) og en kanadisk Cancer Society Research Institute Innovation Grant (MR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Ivan Nabi er en PLoS ONE Editorial Board medlem og dette endrer ikke forfatterne « tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er et mobilprogram nødvendig under normale utviklingsprosesser som embryogenese og vev ombygging og også i utviklingen av sykdommer slik som kreft [1]. I løpet av denne prosessen, forstyrrelser i celle-celle og celle-ekstracellulære matriks (ECM) sammenvoksninger utslipp epitelceller fra det omgivende vev. De frigjorte celler forvandle seg til mesenchymale, trekkende celler med en forbedret evne til å bevege seg gjennom meshwork av tredimensjonale ECM. Lokalisert uttrykk for vekstfaktorer som TGF-β og EGF induserer EMT gjennom aktivering av Wnt og Notch signalveier og nedstrøms aktivering av transkripsjonsfaktorer som Smad, sneglen, ZEB og Twist. Ekspresjon av epitel-celle-celle adhesjon proteiner som E-cadherin er nedregulert, mens mesenchymale celle-celle adhesjon proteiner som N-cadherin, vimentin og det ekstracellulære matriksproteiner fibronectin og kollagen, er oppregulert [1,2,3].
kortikal organisering av aktin filamenter er et kjennetegn på epitelceller mens aktin stresset fiber finnes i mesenkymale celler. Aktin cytoskjelettet remodellering formidles ved de Rho GTPases og representerer en grunnleggende mekanisme kritisk for cellemigrering under prosesser som for eksempel cancer metastase. Med hensyn til EMT, aktivering av RhoA fører til ROCK avhengig aktin cytoskjelettet ombygging og forstyrrelse av E-cadherin basert celle adhesjon [4,5,6,7,8,9]. Flere actin cytoskjelett-assosierte proteiner som α-actinin, myosinlettkjedefosfatase, integriner, tropomyosins og moesin har vist seg å være oppregulert i løpet av EMT [3,7,10,11,12,13,14]. Actin cytoskjelett regulatorer ble også identifisert som kritiske faktorer som bestemmer lymfom progresjon i et tap-av-funksjon RNAi skjermen musetumormodeller [15]. Uttrykk av aktin regulatoriske proteiner som Arp2 /3 og WAVE2 korrelerer med dårlig prognose i bryst og lever karsinom støtter en rolle for aktin cytoskjelett dynamikk og organisering som kritiske regulatorer av kreft progresjon [16]. En fersk studie har også innblandet økt myosin IIB uttrykk og myosin IIA tung kjede fosforylering i styrke bryst epitelial celle migrasjon og invasjon i TGF-β-indusert EMT [17].
Vi viste tidligere at redusert uttrykk for pseudopod- beriket proteiner resulterte i reduserte aktin cytoskjelett dynamikk og cellestørrelse som var knyttet til en reversering av EMT i seks metastatisk kreft cellelinjer [18]. Vi viser nå at depolymerisering av aktin cytoskjelettet av kreftceller med cytokalasin D (Cyt D) induserer atom cytoplasma translokasjon av EMT-assosierte transkripsjonsfaktorer, øket E-cadherin uttrykk, redusert celleform og størrelse og redusert aktivering av RhoA. I MCF-7 brystkreftceller, induksjon av E-cadherin av aktin depolymerisering krever RhoA inaktivering mens dominerende aktiv RhoA induserer E-cadherin. Dette tyder på at aktin cytoskjelettet ombygging oppstrøms RhoA signalering spiller en rolle i EMT.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
Mus E-cadherin (# 610182) og N -cadherin (# 610920) antistoffer var fra BD Transduction Laboratories; anti-β-actin var fra Sigma, anti-vimentin (ab11256) var fra Abcam. SMAD1 /2/3 (Sc-7960), Snai 1 (Sc-28199), RhoA (Sc-418), c-myc (SC-789) antistoffer var fra Santa Cruz. Alexa488-, Alexa568-, og Alexa647-konjugerte sekundære antistoffer og rhodamine- og Alexa568-konjugert phalloidin var fra Molecular Probes. Reagenser for real-time PCR var fra Applied Biosystems; RNA isolering kit var fra Qiagen. Cytochalasin D og Jasplakinolide var fra Calbiochem (Millipore). RhoA plasmider var en slags gave fra Nathalie Lamarche (McGill University). RhoA perler, MLB lysebuffer og Rac1 mAb var fra Millipore (Upstate).
Cell kultur, western blot og immunfluorescens mikros
Menneske MDA-231, MDA-435, DU145, HT1080, U251 , U87F-7, MCF-7 og Hs27 cellelinjer var fra American Type Culture Collection. MDA-231, MDA-435, og Du145 ble holdt i fullstendig RPMI 1640 og HT-1080, U251, U87, MCF-7 og Hs27 celler i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 2 mmol /l L-glutamin, og 25 mmol /l HEPES-buffer for RPM1 og natriumpyruvat for DMEM, henholdsvis ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. For Western blot, ble cellelysater fremstilt, proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Bradford-reagens og like mengder av cellulært protein ble lastet. For immunofluorescens ble celler dyrket på dekkglass fiksert med 3% paraformaldehyd og antistoff-merket som tidligere beskrevet [18]. Bilder ble samlet inn med × 60 eller x 100 planapochromat mål (numerisk apertur, 1,35) av en FV1000 Olympus konfokalmikroskop.
Rho GTPase aktivitetsanalyse
RhoA rullegardin ble utført i henhold til produsentens protokollen (Millipore) og nivåer av RhoA GTP og total RhoA ble oppdaget av western blotting hjelp RhoA (Santa Cruz Biotechnology) antistoff. Før behandling med Cyt D-celler ble transient transfektert med RhoA Plasmider hjelp Effectene (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll.
Cell migrasjon og cytotoksisitetsassayer
Om lag, 3 × 10
4 HT1080 og HS27 celler ble overført til ubestrøket (migrasjon) 8-mikrometer cellekultur inserts (BD Falcon) i medium som inneholder 2% serum. Montasjen ble anbragt i 24-brønners plater inneholdende fullstendig medium. Cellene fikk feste seg til filter i 4-6 timer og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Cyt D og, som en bærerkontroll, 1% DMSO, i 12 timer. Etter 12 timer ble de ikke-migrerende celler fjernet fra toppen av filteret med en bomullspinne og migrering av celler på bunnen av filteret fiksert og farget med 0,5% krystallfiolett, For cytotoksisitetsanalyser, ca. 7500 celler for både HT-1080 og Hs27 ble sådd ut i 96-brønners plater over natten og ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Cyt D eller 1% DMSO i 10 timer og deretter vannoppløselige tetrazoliumsalter (WST-1-reagens) ble tilsatt til individuelle brønner. 2 timer etter tilsetning av reagens, ble absorbansen avlest ved 450 nm. Alle forsøkene ble utført in triplo.
real-time PCR
RNA ble isolert fra hver av cellelinjen ved bruk av RNeasy Plus mini-sett (Qiagen) og ble revers-transkribert ved bruk av Internett kapasitet cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Genekspresjon ble kvantifisert ved hjelp av sanntids kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) på en ABI 7500 Fast system med tilpasset TaqMan prober for hvert gen ved hjelp av Taqman genuttrykk Analyser (Applied Biosystems). Relativ ekspresjon ble bestemt ved anvendelse av en standardkurve og genekspresjon normalisert til 18S rRNA overflod.
Statistisk analyse
Statistiske tester ble utført for å bestemme nivået av betydning mellom kontroll og behandlede grupper. Alle resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre forsøk. To gruppesammenligninger (kontroll vs behandlet eller tidspunkter i forhold til tid 0) ble utført ved anvendelse av uparede Student t-test (fig. 1, 2, 3, 4 og 5). For flere gruppesammenligninger (Fig. 6), One-way ANOVA etterfulgt av Tukey multippel sammenligningstest ble utført for å generere statistiske data.
(A) Du145, MDA-231, MDA-435, HT1080, U251 og U87-celler belagt i 24 timer var ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 100 uM Cyt D (Cyt D-behandlet) i 12 timer, fiksert og immunofluorescently merket for E-cadherin (grønn) og F-aktin (rød). Scale: 10 mikrometer. (B) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 pM) og midlere størrelse og F aktin innhold av cellene ble bestemt ved hjelp av morfologi Explorer Bioapplication programvare fra en Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader. **
p
0,01 og *
p
0,05; sammenlignet med kontrollgruppen (ubehandlede) celler.
(A) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87-celler ble behandlet over natten med forskjellige konsentrasjoner av Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 pM) og cellelysater blottet for E-cadherin, N-cadherin, vimentin og β-aktin. (B) Real-time PCR for E-cadherin mRNA ble utført på total-RNA isolert fra Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Cyt D. Cyt D behandlingen økte E-cadherin mRNA-ekspresjon i alle celler bortsett fra HT1080 og MDA-231 hvor det var ingen eller minimal ekspresjon. **,
p
0,01, *
p
0,05; sammenlignet med kontrollgruppen (ubehandlede) celler.
(A) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87-celler ble behandlet med Cyt D til angitt tider og cellelysater utslettet for E-cadherin, N-cadherin, vimentin og β-aktin. (B) Real-time PCR for E-cadherin mRNA ble utført på total RNA isolert fra Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87-celler behandlet på ulike tidsintervall med Cyt D . Cyt D behandling økte E-cadherin mRNA uttrykk nivå i alle celler unntatt HT1080 og MDA-231 hvor det var ingen eller minimal uttrykk. **,
p
0,01, *
p
0,05; i forhold til tid 0.
(A) Du145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, U251 og U87-celler var ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 100 mikrometer Cyt D (Cyt D-behandlet) i 12 timer og immunofluorescently merket for Smad1 /2/3 og Snai 1 samt Hoechst 33342 for nukleær farging. Representative bilder for MDA-MB-231 celler er vist. (B) Celler ble scoret for atom distribusjon av Smad1 /2/3 og Snai en kontroll og Cyt D behandlede celler. Resultatene er presentert som prosent av total celle som viser atomfordeling for disse to proteinene. Skala: 10 mikrometer; **,
p
0,01, *
p
0,05; i forhold til ubehandlet kontroll for hver cellelinje.
MCF-7-celler ble behandlet med 100 uM Cyt D i 12 timer (A) eller 0-400 nM Jasplakinolide (JP) i 12 timer. (B) og lysater ble blottet for E-cadherin og β-aktin. (C) RhoA GTP og total RhoA nivå ble bestemt i MCF-7-celler behandlet med 100 uM Cyt D i 12 timer. ***
p
0,001; i forhold til kontroll. (D) MCF-7-celler ble transfektert med dominant-negative (DN), villtype (WT) og dominant-aktiv (DA) RhoA i 48 timer, hvoretter cellelysater ble analysert for c-Myc, E-cadherin og β- aktin. (E) utransfekterte MCF-7-celler eller MCF-7-celler transfektert med dominant-aktiv RhoA aktive ble behandlet med 100 uM Cyt D i 12 timer og cellelysatene probet for c-Myc, E-cadherin og β-aktin.
(A) HT-1080 og Hs27 celler ble behandlet over natten med forskjellige konsentrasjoner av Cyt D (0, 50, 100, 200 uM) og 1% DMSO som en bærerkontroll og cellelysater blottet for E-cadherin , N-cadherin, vimentin og β-aktin. (B) For migrerings analyser, celler sådd ut på 8 mikrometer celle innsatser i 4-6 timer, ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av Cyt D i 12 timer og antall cellen migrerer gjennom filteret telles. (C) For å vurdere cytotoksisitet av Cyt D, ble cellene sådd ut over natten og deretter behandlet med de angitte konsentrasjoner av Cyt D i 10 timer. WST-1 reagens ble tilsatt til hver brønn, og etter to timer absorbansen ble avlest ved 450 nm. *
p
0,05, **
p
0,01 og ***
p
0,001; DMSO behandlede celler i forhold til ubehandlede celler; Cyt D behandlede celler i forhold til DMSO behandlede celler.
Resultater
Den aktin depolymerisering agenten Cyt D induserer celle krymper og MET
Tidligere har vi rapportert at redusert aktin cytoskjelettet dynamikk ved uttømming av pseudopod beriket AHNAK, Septin 9, eIF4E og S100A11 med metastatisk kreft celler førte til økt uttrykk av epitel markør E-cadherin og tap av mesenchymale markører N-cadherin og vimentin, i hovedsak reversering epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [ ,,,0],18]. For å avgjøre om endring aktin cytoskjelett dynamikk kan direkte påvirke EMT vi behandlet seks metastatisk menneskelige kreftcellelinjer (prostata Du145, bryst MDA-MB-231 og MBA-MB-435, glioma U251 og U87 og fibrosarkom HT-1080) med aktin depolymerisering agenten Cyt D. Celler som utsettes for Cyt D (100 mm) for 12 timer viste en redusert størrelse og farget positivt for E-cadherin (fig. 1a). Du145, MDA-MB-435, HT-1080 og U87-celler viste junctional lokalisering av E-cadherin mens U251 og MDA-231 celler presentert en mer intracellulær E-cadherin lokalisering (Fig. 1a). Økende Cyt D-konsentrasjoner fra 10 til 200 uM resulterte i progressiv krymping av cellene og redusert F-aktin-innhold, påvist ved fluorescerende merking med Alexa-568 phalloidin og kvantitativ analyse med en Cellomics ArrayScan VTI automatisert fluorescens-imager (Fig. 1B).
Høyere konsentrasjoner av Cyt D øket ekspresjon av E-cadherin og resulterte i tap av mesenkymale markører vimentin og N-cadherin i alle seks cellelinjer (fig. 2A). Den mest uttalt effekt ble observert ved 100 og 200 uM Cyt D og Parallelt med øket E-cadherin mRNA, bestemt ved qPCR, i de fleste cellelinjer, selv om i mindre grad i HT-1080-celler og ikke i MDA-MB-231 celler (fig. 2B). Tidsforløpet av E-cadherin-protein og mRNA-induksjon i respons til 100 uM Cyt D varierte mellom cellelinjene. For Du145, U251, MDA-MB-435, og, i mindre grad U87, ble E-cadherin protein ekspresjon indusert ved 2 timer og forbundet med økt E-cadherin-mRNA (fig. 3). MDA-MB-231 og HT-1080-celler viste liten eller ingen ekspresjon av E-cadherin på mRNA-nivået, og protein-ekspresjon ble indusert etter bare 8-10 h (fig. 3). Actin depolymerization av Cyt D fører derfor til økt E-cadherin uttrykk både på mRNA protein nivåer med induksjon av E-cadherin mRNA forbundet med raskere induksjon av E-cadherin protein.
Smad1 /2/3 og SNAI1 er transkripsjonsfaktorer som har atom ekspresjon er assosiert med EMT [19] og er lokalisert til kjernen i de metastatiske celler studert [18]. Behandling av MDA-MB-231-celler med 10 pM Cyt D resulterte i en dramatisk omfordeling av Snai 1 og SMAD1 /2/3 til cytoplasma (fig. 4 A). Ligner Cyt D-avhengige omfordeling av disse to EMT-assosiert transkripsjonsfaktorer fra kjernen til cytoplasma ble observert for alle seks metastatisk cellelinjer undersøkt (Fig. 4 B).
Actin depolymerization regulerer RhoA aktivering
Forstyrrelse av aktin cytoskjelettet induserer derfor en epitelial overgang i metastatiske kreftceller. Vi testet deretter rollen til actin cytoskjelett dynamikk på EMT i epitel, ikke-metastatiske MCF-7 brystkreftceller som uttrykker E-cadherin og har blitt godt karakterisert som en modell for EMT i brystkreftceller [20]. Som observert for metastatisk cellelinjer, behandling av MCF-7-celler med Cyt D indusert forhøyet E-cadherin nivåer (Fig. 5 A). I motsetning til stabilisering av aktin cytoskjelettet med nanomolare konsentrasjoner av jasplakinolide, redusert E-cadherin nivåer (fig. 5 B). Aktin dynamikk derfor konsekvenser E-cadherin uttrykk i MCF-7 celler. Aktivert RhoA utløser EMT [4,5,9] og induksjon av E-cadherin ved Cyt D behandling reduserte nivåer av aktiv RhoA i MCF-7-celler (fig. 5C). Gjennomgående transfeksjon av MCF-7-celler med dominant-aktiv RhoA aktiv redusert E-cadherin uttrykk mens transfeksjon med dominant-negative RhoA øket E-cadherin uttrykket (fig. 5D). Videre er det i celler som uttrykker dominerende aktiv RhoA, Cyt D ikke lenger påvirket E-cadherin nivåer (Fig. 5 E). RhoA aktiveringsstatusen nedstrøms aktin cytoskjelett dynamikk er en viktig regulator av E-cadherin uttrykk i disse kreftcellene.
Cyt D induserer ikke MET i normale fibroblaster
For å teste kreftcelle spesifisitet Cyt D induksjon av E-cadherin, behandlet vi HT-1080 fibrosarkom celler og den normale humane Hs27 fibroblastcellelinje med forskjellige konsentrasjoner av cyt D (50, 100 og 200 uM), så vel som med 1% DMSO, som et vehikkel kontroll, i 12 timer. Som observert før behandling med Cyt D fører til induksjon av E-cadherin i HT-1080 med samtidig tap av N-cadherin og vimentin ved 50 uM Cyt D. Interessant, behandling med Cyt D på Hs27 ikke påvirker E-cadherin, N-cadherin eller vimentin ekspresjon tyder på at Cyt D induksjon av MET er spesifikk for kreftceller (fig. 6A). Behandling med 10 uM Cyt D reduserte signifikant migrering av HT1080 og Hs27 celler i forhold til 1% DMSO anvendt som en bærerkontroll (fig. 6B) som tyder på at cellemigrering er mer følsom for aktin cytoskjelettet avbrudd. Cytotoksisitetsassayer viste at Cyt D var giftig for celler på 100 og 200 mikrometer, men ikke på 10 og 50 mikrometer i forhold til 1% DMSO (Fig. 6C).
Diskusjoner
Actin organisasjon er kritisk for ulike cellulære prosesser som cellemotilitet, celledeling, organelle bevegelse, cellesignalisering og etablering og vedlikehold av celle veikryss og cellen form [21,22]. Under EMT, endringer i aktin organisasjon observert og uttrykk for mange aktin regulatoriske gener er oppregulert [3,7,10,11,12,13,14]. Vi har tidligere rapportert at tap av proteinkomponenter i den aktin-rike pseudopodia av metastatiske kreftceller endrer actin cytoskjelett dynamikk, reduserer cellestørrelsen og induserer E-cadherin ekspresjon og MET [18]. Her viser vi at en aktin depolymerisering middel, Cyt D, reduserer cellestørrelse og form, inaktiverer RhoA og induserer ekspresjon av E-cadherin, som definerer aktin cytoskjelettet som et oppstrøms regulator av EMT i metastatiske kreftceller. I samsvar med disse dataene, vi tidligere rapportert at induksjon av MET gjennom tap av pseudopod-beriket proteiner AHNAK, septin-9, eIF4E, og S100A11, var assosiert med tap av F-aktin og økt stabilitet av gjenværende F-aktin fibre [18] . Viktigere, gjorde Cyt D ikke indusere MET i normale fibroblaster som tyder på at disse effektene er spesifikke for kreftceller. Hvorvidt induksjon av MET av aktin depolymerisering er spesielt relatert til forstyrrelse av tumorcelle pseudopodia gjenstår å bli bestemt.
Cytoplasmisk domene interaksjonen av E-cadherin med a og β-catenin som danner celle-celle adhesjon komplekser forankret til aktin cytoskjelettet er kritisk for etablering av homotypisk celle-celle kryss [23]. Det er blitt rapportert at behandling av celler med høyere konsentrasjoner av Cyt d minker celle permeabilitet og stabiliserer tett veikryss [24]. Det ble videre vist at montering av trange veikryss fører til E-cadherin induksjon som tyder på at stabilisering og dannelsen av disse knutepunktene regulere E-cadherin uttrykk nivåer [25]. Tidligere ble det også vist at aktin depolymerisering med Cyt B og latrunculin En induserer overflate E-cadherin uttrykk og redusert N-cadherin og vimentin uttrykk i rotte βcells [26]. Behandling med Cyt D har også vist seg å redusere vimentin ekspresjon i bukspyttkjertelcancerceller [27]. I vår studie induserer behandling av celler med Cyt D E-cadherin-ekspresjon i alle seks cellelinjer metastatiske og reduserer kraftig cellestørrelse og form (fig. 1, 2). Behandling med Cyt D signifikant øket E-cadherin transkripsjon nivå i alle bortsett fra MDA-231-celler tyder på at aktin cytoskjelettet regulering av E-cadherin nivåer skjer på mRNA og proteinnivå. Viktigere, ble en raskere induksjon av E-cadherin observert i celler som også viste forhøyede nivåer av E-cadherin mRNA definerer en avgjørende rolle for de novo E-cadherin biosyntese i MET. Faktisk økte nivåer av Zeb2, en transkripsjons repressor av E-cadherin, nedregulerer E-cadherin på både mRNA og protein nivå og induserer EMT [28].
Mens ble observert den mest robuste induksjon av MET ved høyere konsentrasjoner av Cyt D (100 og 200 uM) som var assosiert med 10-20% celletoksisitet, vi konsekvent observert induksjon av MET ved 50 uM Cyt D, som ikke var assosiert med signifikant celletoksisitet og, i MDA-231 celler ved 10 mikrometer Cyt D. Cell migrasjon ble hemmet ved 10 mikrometer Cyt D og høyere Cyt D konsentrasjoner som forårsaket MET ble også assosiert med økt hemming av migrasjon og redusert F-aktin nivåer (fig. 1B). Vi observerte ikke induksjon av MET i normale Hs27 fibroblaster på noen Cyt D som indikerer at induksjon av epiteliale markører av aktin depolymerization er kreftcelle spesifikk. Cell migrasjon er derfor mer akutt følsomme for aktin depolymerization enn reversering av EMT som tyder på at disse to aktin-baserte cellulære responser er forskjellig regulert av aktin cytoskjelettet.
RhoA aktivering kan initiere EMT ved å fremme E-cadherin degradering [4 , 5,6,9,29]. Konsekvent, observerte vi at RhoA aktivering er assosiert med redusert E-cadherin nivåer. Imidlertid rapporter tyder på at redusert RhoA aktivitet er nødvendig for EMT i colon carcinoma progresjon [30]. I motsetning til en tidligere studie som rapportert aktivering av RhoA ved Cyt D behandling i Swiss 3T3 fibroblaster [31] vi observert redusert RhoA aktivitet i ikke-metastatiske MCF-7-celler etter Cyt D behandling som ble ledsaget av øket E-cadherin ekspresjon (Fig . 5). Kontrasterende observasjoner kan være på grunn av ulike cellelinjer som benyttes, fibroblaster vs epitelceller MCF-7 celler, eller høyere konsentrasjoner og lengre inkubasjonstid brukt i vår studie. Faktisk, i deres studie behandling var i 6 timer med 0,5 ug /ml (1 uM), i kontrast til våre over natten behandling med 100 uM Cyt D, og økt aktivert RhoA ble observert for de første 3 timer bare etter som det var en reduksjon i aktiverte RhoA nivåer. Redusert aktivitet av RhoA aktiv nedstrøms av aktin depolymerization induserer derfor E-cadherin uttrykk og MET. Det faktum at Cyt D ikke øker E-cadherin uttrykk nivåer i celler transfektert med dominerende aktiv RhoA indikerer at RhoA opptrer nedstrøms av aktin ombygging for å regulere E-cadherin ekspresjon (fig. 5) og EMT prosessen. Behandling av MCF-7 celler med jasplakinolide redusert E-cadherin uttrykk som tyder på at aktin polymerisasjon og depolymerisering hendelser har motstridende effekter på EMT. Interessant, syntes Cyt D effekt spesifikke kreftceller som tyder på at små molekyl regulatorer av aktin cytoskjelettet kan potensielt utvikles som mulige terapeutiske midler.
Regulering av aktin dynamikk av farmakologiske stoffer kan derfor påvirke uttrykket av EMT markører, som definerer avgjørende rolle for actin dynamikk i EMT og antyder at farmakologisk modulering av aktin dynamikk representerer en gyldig tilnærming til målet EMT i kreft. In vivo bruk av actin modulatorer slik som cytochalasins, latrunculins, jasplakinolide og andre for behandling av cancer har vært begrenset av deres påviste bivirkninger og fravær av passende avleveringssystem for målrettet levering til tumorceller [32,33]. Imidlertid nylig ble det vist at Cyt D innkapslet i PEG liposomer forbedret løselighet og biotilgjengelighet av Cyt D og induserte sterk anticancer virkning i musemodeller [34]. Identifisering av andre forbindelser som kan indusere MET mer spesifikt kan representere alternative tilnærminger for å målrette aktin cytoskjelettet i kreft.
