Abstract
Oral administrasjon av tumorceller induserer en immun hypo-respons kjent som oral toleranse. Vi har tidligere vist at oral toleranse til en kreft er tumorantigen spesifikk, ikke-kryssreaktiv og overfører en tumorvekst fordel. Vi har undersøkt bruk av regulatoriske T-celler (treg) reduksjon av oral toleranse til en kreft og dens evne til å kontrollere tumorvekst. Balb /c-mus ble matet gavage homogenisert tumorvev – JBS fibrosarcoma (for å indusere oral toleranse til en kreft), eller PBS som kontroll. Vekst av subkutane JBS svulster ble målt; milt vev som ble fjernet og flowcytometri brukes til å kvantifisere og sammenligne systemiske Tregs og T effektor (Teff) celle populasjoner. Før og /eller etter tumor foring, ble musene administrert intraperitonealt anti-CD25, for å inaktivere systemisk Tregs, eller gitt isotype antistoff som kontroll. Mus som ble oralt tolerert før subkutan tumorfremkallelse, viste betydelig høyere systemiske treg nivåer (14% vs 6%) og raskere tumor vekst enn kontrollene (p 0,05). Komplett regresjon av svulster ble bare sett etter Treg inaktivering og oppstod i alle grupper – dette var ikke hemmet av svulst fôring. Den kur priser for treg inaktive var 60% i løpet av tolerering, 75% i løpet av tumorvekst og 100% i løpet av inaktivering for både tolerering og tumorvekst. Nedbryting av tregs ga opphav til et økt antall teff celler. Treg uttømming post-tolerering og post-tumor induksjon førte til fullstendig regresjon av alle svulster på svulst bærende mus. Oral administrasjon av svulstvev, ensidige tumorvekst fordel og er ledsaget av en økning i systemisk treg nivåer. Administreringen av anti-CD25 Ab redusert treg tall og forårsaket en økning i Teffs. Mest spesielt treg celle hemming vant etablert oral toleranse med påfølgende tumor regresjon, spesielt relevant for forutgående kreftformer hvor oral toleranse er sannsynlig å bli indusert av utgytelsen av svulstvev i tarmen
Citation. Whelan MC, Casey G , Larkin JO, Guinn Ba, O’Sullivan GC, Tangney M (2014) Oral Toleranse for kreft kan bli opphevet av T Regulatory Cell Hemming. PLoS ONE 9 (5): e97602. doi: 10,1371 /journal.pone.0097602
Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italia
mottatt: 14 november 2013; Godkjent: 22 april 2014; Publisert: May 15, 2014
Copyright: © 2014 Whelan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert gjennom et forskningsstipend til GOS og MT fra Cancer Research Irland (CRI06OSUG). MW ble finansiert av et fellesskap fra Royal College of Surgeons Edinburgh og Royal College of Surgeons Irland. Forfatterne erkjenner også støtte fra Cork Cancer Research Centre. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv gir sammenlignbar tumorstadier prognosen for pasienter som lider av øsofagal og magekreft forblir konsekvent og vesentlig dårligere enn for pasienter med distale mage-tarmkanalen kreft, til tross for fremskritt i diagnostikk, kirurgi og adjuvant behandling [1], [ ,,,0],2]. Blant de mange variabler som bestemmer tumor vekst og prognoser, forskjeller i tumorimmunrespons er sannsynlig å eksistere mellom forutgående og andre kreftformer. Behandlingen av diett antigener (Ags) av det mukosale immunsystemet i mage-tarmkanalen fører til en systemisk Ag spesifikk immunrespons betegnet hypo-oral toleranse [3]. Det er sannsynlig at tumor Ags avledet fra tumorvev skur inn i tarmen etter forutgående kreft ville bli behandlet av tarm assosiert lymfoid vev (GALT), hovedsakelig i den proksimale mage-tarmkanalen, på en måte som minner om Ags inntas av slimhinneimmunsystemet , og dermed skape en svulst Ag spesifikk immuntoleranse. Vi har tidligere rapportert at oralt administrert frisk tumorvev induserte en tumor Ag spesifikk ikke-kryssreaktiv immuntoleranse med en påfølgende vekstfordel for kreft [4].
Mekanismen for toleranse overfor inntatt Ags kan tilskrives enten aktiv undertrykking eller induksjon av klonal sletting /anergi [5]. T-celler klonet fra tolerert mus har blitt tilskrevet en unik undergruppe av CD4
+ populasjonen var Th3 celle [6]. I T-celle reseptor (TCR) transgene mus, var det en økning i CD4
+ CD25
+ celler i respons til oral Ag administrasjon. Disse tregs ble funnet å uttrykke CTLA-4 og foxp3 og å ha en undertrykkende funksjon
in vitro
. CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Tregs spille en rolle i å hindre utvikling av autoimmune sykdommer, og har en dobbel egenskap som både anergiske og undertrykkende celler. Betydelig, har det vist seg at fjerning av denne gruppen kan indusere anti-tumor immunaktivitet [7] – [10]. I eksperimentelle systemer, som tumorer vokser, er det en numerisk økning i Tregs i immun infiltrat med derav følgende lokal undertrykkelse av anti-tumor immunresponser. Antistoff (Ab) mediert fjerning av disse Tregs kan unmasks naturlige svulst immunreaktivitet og denne strategien har vist seg å potensiere immunterapeutisk ødeleggelse av eksperimentelle-kreft [10] -. [12]
Vi har undersøkt effekten av oral toleranse til JBS svulst på tumorvekstrater og på størrelsen av lymfocytt-subpopulasjoner i Balb /C mus. Spesielt vi undersøkt om induksjon av oral toleranse for svulster var treg avhengige – og om treg inaktive kunne oppheve oral toleranse og hemme tumorvekst
Materialer og metoder
Cell Tissue Culture
.
JBS murine fibrosarcoma [13] ble dyrket i vevskultur-kolber ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2, i DMEM (Dulbeccos minimale essensielle medium -Sigma-Aldrich, Dublin, Irland). Vevskultur-medium ble supplementert med 10% jern-supplementert donor kalveserum, 50 pg /ml gentamycin, 300 pg /ml L-glutamin og 10 mM HEPES (1-Piperazineethane sulfonsyre, 4- (2-hydroksyetyl) mononatriumsaltet ), pH 7,4. Standardprosedyrer for trypsinering, sentrifugering og resuspendering av cellene ble brukt [13]. Levedyktige celler ble utført ved hjelp av trypanblått Dye Exclusion (Sigma, Irland).
Etikk erklæringen
Alle murine eksperimenter ble godkjent av dyreetiske komité av University College Cork (AERR # 2010 /003). Studien ble utført i henhold til de anbefalinger som er fastsatt av den irske avdeling for barn og helse.
Tumor Induksjon
Mus ble hentet fra Harlan Laboratories (Oxfordshire, England). De ble holdt ved en konstant romtemperatur (22 ° C) med en naturlig dag /natt lys syklus på konvensjonell dyr koloni. Standard laboratorie mat og vann ble gitt
ad libitum
. Før eksperimentene ble musene gis en prøveperiode på 14 dager. Balb /C-mus av begge kjønn og atymiske hann Balb /C HsdOla: MF1-nu mus i sin opprinnelige tilstand, som veide 16-22 g ved 6-8 ukers alder, ble inkludert i forsøkene. For JBS tumorinduksjon, 2 x 10
6 tumorceller, suspendert i 200 ul DMEM, ble injisert subkutant i flanken av musene. Med dette volum av inokulum og plasseringen det var lite punkteringsstedet ekstravasering av cellesuspensjonen og den tumorvekst og formen var konsistent.
gavage Mate
Etter subkutan inokulering av 2 x 10
6 JBS tumorceller i Balb /C-mus, tumorene utviklet og fikk lov til å oppnå en størrelse på 1-2 cm
3, ved hvilket stadium ble dyrene avlivet og deres tumorer ble fjernet. Tumorene ble homogenisert i fosfatbufret saltvann (PBS) (Sigma, Irland) ved anvendelse av en homogenisator FastPrep FP120 (Thermo Electron Corp., England). Homogenatet ble grundig vasket ved sentrifugering med PBS for å fjerne rusk. Når supernatanten var makroskopisk klar homogenatet ble resuspendert i PBS til en sluttkonsentrasjon på 0,2 g (våt vekt) per ml. Dette ble alikvotert og frosset inntil bruk. PBS-kontrollen var også alikvotert og frosset. Ved hjelp av en 18 Fr-stål-ball-tippet foringsnål festet til en 1 ml sprøyte, un-bedøves dyrene var gavage tilført 200 ul friskt tinet JBS tumor-homogenat (40 mg tumor) eller PBS. Dyrene ble foret daglig i 14 dager. Mengden av fôr og varigheten av fôring samsvarer med de som brukes i tidligere publiserte studier av gruppen vår, og var basert på en litteraturgjennomgang, spesielt med hensyn til studier som undersøkte toleranse for cellulære Ags [4], [14] – [17] . På dag 15, dyrene fikk en subkutan inokulering av tumorceller (2 × 10
6 celler) og ble overvåket for tumorutvikling daglig.
Tumor Monitoring
Svulster ble målt hver 48. time ved hjelp av en digital kaliper. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av standard formel
v
=
ab
2π /6 og tumor vekstkurver ble konstruert. Musene ble humant avlivet i tilfeller hvor tumoren nådde 1,5 cm
3 i diameter. I det første eksperimentet ble musene matet tumor Ag eller PBS, og vekst og overlevelseskurver ble fremstilt. I det andre eksperiment ble systemiske Tregs enten permanent inaktivert (referert til som tømt) ved anvendelse av anti-CD25 Ab (klon PC61- Bio-Express, New Hampshire, USA), midlertidig utarmet under mating bare eller ikke oppbrukt. I de siste forsøket mus ble foret i 14 dager og deretter randomisert til å motta anti-CD25 Ab eller en kontroll Ab konjugert til anti-pepperrotperoksidase (HPRN), Bio-Express, USA for å overvåke effekten på sc tumorvekst.
flowcytometrisystemer Analysis
ACK erytrocytt lysebuffer (0,15 M NH
4Cl, 10 mM KHCO
3, 0,1 mM Na
2EDTA, pH 7,4 med HCl) ble fremstilt ved bruk reagenser kjøpt fra Sigma-Aldrich, Irland. Løsningen ble filtersterilisert gjennom et 0,2 mikrometer filter og lagret ved 4 ° C. FACS-farging buffer ble fremstilt fra Dulbeccos fosfatbufret saltvann (Dulbeccos PBS) innkjøpt fra Sigma sammen med, bovint serumalbumin (BSA), natriumazid og kalvefosterserum. Miltene og tumorvev ble fjernet og hakket separat på 70 mikrometer nylon celle sil (BD Biosciences, UK). Disse cellesuspensjoner ble oppsamlet, vasket i dyrkningsmedium, pelletert ved 300 g i 10 min ved 4 ° C og ble deretter behandlet med ACK erytrocytt-lysebuffer i 3 minutter hvoretter de ble vasket to ganger og resuspendert i FACS-buffer farging. Levedyktige celler ble bestemt ved en standard trypanblått Exclusion test. Cellene ble deretter fortynnet til en konsentrasjon på ca. 2-4 x 10
6 per ml og 100 pl flekker buffer tilsatt pr Falcon rør (Becton Dickinson). Cellesuspensjoner og reagenser ble opprettholdt ved 4 ° C under forberedelse.
celle overflaten markør analyse
Phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) konjugerte antistoffer mot muse-CD25 og CD3, fluorescein (FITC) konjugert antistoff mot muse-CD25, CD3, CD4 og CD8 og PE anti-mus foxp3 farging kit ble kjøpt fra eBioscience, Insight bioteknologi, England. PE anti murine CD4 og CD3 ble kjøpt fra Serotec, Oxford, England. Fluorokromkonjugerte konjugert isotype fargekontroll (FITC-IgG, PE-IgG2a og PE-Cy5 IgG isotypekontrollantistoff) ble kjøpt fra eBioscience. Ukonjugert anti-murine CD16 /CD32 (Fcy III /II) monoklonalt Ab (Fc-reseptor-blokkerende Ab) ble innkjøpt fra Serotec.
For å minimalisere ikke-spesifikk binding Ab, anti-CD16 /CD32 Fc-reseptor-blokkerings Ab ble fortynnet til 0,01 ug /ul i farging buffer, 20 ul per brønn og inkubert ved 4 ° C i 20 min. Fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer mot celleoverflatemarkører ble også fortynnet i henhold til produsentens instruksjoner og ble satt til hver prøve uten fjerning av Fc-blokkering Ab. Celler ble inkubert i mørke ved 4 ° C i 45 minutter og deretter vasket to ganger i 250 pl buffer farging før resuspensjon i 500 pl buffer farging for umiddelbar analyse eller en bindemiddel-løsning med 0,5% paraformaldehyd i Dulbeccos PBS. Analysen ble utført innen 48 timer ved hjelp av en FACScaliber flowcytometer (Becton Dickinson, Oxford, Storbritannia) og analysert av den medfølgende Cellquest (BD Biosciences) dataprogram.
In Vivo
Ab Administration
Som tidligere nevnt, anti-CD25 Ab (PC61) og kontroll (Ab isotype kontrollrotte-IgG-HRPN) ble administrert intra peritonealy ved en dose på 1 mg /kg i et totalvolum på 200 ul PBS . Tidspunktet for doser avhengig av den eksperimentelle protokollen, men når to doser var som skal administreres, de ble gitt fire ganger fra hverandre (fig. 1). Dette resulterte i at over 95% inaktivering av Tregs som bestemt ved flow-cytometri.
Innledende eksperimenter involverte mus som ble tømt for Tregs for varigheten av forsøket og ble referert til som å bli permanent oppbrukt. For forsøk med utarming under tolerering, treg uttømming skjedde bare i løpet av svulst fôring og ikke når svulster ble indusert. Den endelige protokollen (depletion post tolerering) som kreves for oral toleranse skal etableres før Treg uttømming.
Statistical Analysis
Forskjellene mellom de enkelte gruppene ble testet ved hjelp av den tosidige Student
t
-test for parede verdier. Forskjeller med
p
verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
peroral administrasjon av Tumor Tissue ensidige Tumor Spesifikk vekstfordel
Vi har tidligere vist at subkutane svulster har en hurtigere vekst i mus som ble matet tumor før tumorfremkallelse, sammenlignet med mus som ble foret enten PBS eller en alternativ tumor (cARB eller CT26) [4], [13]. Vi har også vist at tumorvekstkurven i Balb /C mus som er tilnærmet lik den vekstkurven for subkutan tumor i atymiske nakne mus, som mangler fungerende T-celler og disse mus ble brukt som en immun inkompetent kontroll [13]. I denne studien ved bruk av den samme mate protokoll, validert vi at vår tumor foringsopplegg resulterte i en konsekvent og vesentlig øket subkutan tumor vekst i Balb /C-mus versus kontrollgrupper. Subkutane svulster i gruppene matet JBS tumor dukket opp tidligere (dag 5 vs. dag 6/7) og vokste betydelig raskere (p 0,05) (Fig. 2) ved flere tidspunkter
Vekstkurver for JBS svulster. hos mus etter gavage fôring i 14 sammenhengende dager med JBS tumorhomogenat eller med PBS. JBS svulster vokste betydelig raskere i mus oralt tolerert med JBS. Hvert punkt representerer den midlere tumorvolum av et panel av seks mus. Differansen var statistisk signifikant (p 0,05) på dag 8, 9, 12 14 som angitt med en stjerne på grafen.
Flowcytometri analyse av lymfocytter i respons til tumor inntak
Etter 14 dagers oral svulst eller PBS administrasjon, milt lymfocyttpopulasjoner ble analysert . Det var en betydelig økning i CD4
+ CD25
+ celler (p 0,022) etter svulst administrasjon versus PBS. Dessuten var det en betydelig økning observert i CD25
+ /
foxp3
+ uttrykket etter gating på CD3
+ CD4
+ populasjon av lymfocytter (p 0,019) (fig . 3). Det var ingen signifikant økning i totalt antall CD3
+ CD4
+ eller CD3
+ CD25
+ celler. Heller ikke var det noen signifikant økning i CD8
+ CD25
+ teff undergruppe populasjoner følgende svulsten fôring tidsplanen. Det var ingen observerbar forskjell i antallet eller forholdet av lymfocyttpopulasjoner mellom de musene som ble matet PBS, og de som ikke gavage foret i løpet av denne perioden (data ikke vist).
(a) Dot plott viser antall perifere blod Tregs i PBS (i-iv) eller JBS (v-, viii) matet mus. Tregs ble farget med CD3, CD4, CD25 og
foxp3
antistoffer konjugert til fluorokromer og isotype kontroller og analyseres på strømningscytometeret. Cellene ble separert på CD3
+ og CD4
+ (ii og vi) og isotype kontroller (I og V) og påfølgende dot plots ble ervervet gjennom denne porten for CD25
+ og
foxp3
+ celler (iv og VIII) og isotype-kontroller (III og VII). Det var en betydelig økning i CD4
+ CD25
+ celler (p 0,022) etter svulst administrasjon versus PBS. Dessuten var det en betydelig økning observert i CD25
+ /
foxp3
+ uttrykket etter gating på CD3
+ CD4
+ populasjon av lymfocytter (p 0,019). (B) Diagram som representerer de gjennomsnittlige prosentverdier for treg tall minus isotype kontroller innen totale perifere lymfocytter befolkningen fra JBS eller PBS matet mus. Det var signifikant flere Tregs i milten av mus som ble matet homogenisert svulst i 14 dager enn de matet PBS alene (p 0,002, n = 6)
Økt Tumor vekstrate er forbundet med. aktivitet av Tregs
Vi har tidligere vist at vår anti-CD25 Ab administrering protokollen letter 90% inaktivering av CD25
+ -celler i løpet av en periode på 14 dager [8]. Musene ble randomisert til enten anti-CD25 Ab på begynnelsen av 14-dagers fôring tidsplan, og igjen på slutten av fôring (referert til som permanent depletion) eller Ab på tidspunktet for oppstart fôring bare (referert til som uttømming under tolerising) eller kontroll Ab, eller ingen Ab (fig. 1).
de resulterende subkutan tumorvekstkurver viste at det tidligere observerte tumorvekstfordel følgende foring var fraværende i mus som gjennomgår utarmingen under tolerising plan, med tid til tumor utseende og tumorvekstraten i likhet med PBS-matet mus, noe som indikerer behovet for Tregs ved tidspunktet for tumor mating for induksjon av oral toleranse (fig. 4a). Som vist i fig. 4b, svulster hos mus som fikk anti-CD25 Ab slutt tilbakegang helt, både i uttømming under tolerering og permanente uttømming grupper. Vi, og andre, har tidligere rapportert funn som anti-CD25 administrasjon før svulsten induksjon induserer fullstendig tumor regresjon [8].
(a) Det var ingen signifikant forskjell mellom svulstvekstrater mellom mus matet tumor ( midlertidig eller permanent) og kontroll mus. Mus som fikk ingen anti-CD25 Ab uttømming viste signifikant forskjellige tumor vekstrater på dag 14, 18 og 22, avhengig av om de hadde blitt matet tumor og saltvann (p 0,05). Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig tumorverdier for 10 mus. (B) Overlevelse kurve for mus som var permanent, midlertidig eller ikke i bruk under induksjonen av oral toleranse. Mus som ble permanent utarmet ble 100% helbredet for sin subkutan tumor og forble sykdom gratis på 100 dager. 75% av de som ble midlertidig tømt mens matet tumor ble kurert, mens 66% av de som ble midlertidig oppbrukt og lei PBS kurert. Det var ingen signifikant forskjell mellom disse gruppene. Alle de musene som fikk isotypekontrollantistoff Ab bukket under for tumorbelastning (n = 10).
Endringer i Lymfocytt underpopulasjoner observert i Response til nedbryting av tregs enten permanent eller Under tolerering
på ulike tidspunkter, mus fra hver gruppe ble avlivet og deres milt analysert for systemisk CD4
+ CD25
+ treg og CD8
+ CD25
+ teff tall. Tumor foring signifikant øket systemisk treg nummer versus PBS matet grupper, og denne forskjell ble også sett i anti-CD25 Ab administrert mus (figur 5a). (P 0,01). Mens det var signifikant lavere antall Tregs i PBS-foret gruppene som fikk anti-CD25 Ab enn de som fikk kontroll Ab (figur 5b). (P 0,05) overraskende en reduksjon i det totale treg tall ble ikke funnet i anti- CD25 Ab, tumor-matet mus.
(a) Cellene ble farget for CD3, CD4 og CD25. Cellene ble først inngjerdet på CD3 og senere på CD4
+ CD25
+. Milt-Tregs ble analysert fra mus som var blitt behandlet med (i) isotype kontroll-antistoff, etterfulgt av PBS mating; (Ii) midlertidig utarmet med anti-CD25-antistoff, men PBS matet (iii) permanent utarmet med anti-CD25-antistoff og PBS matet; (Iv) isotypekontrollantistoff behandling og tumor matet, (v) utarmet midlertidig med anti-CD25 men tumor matet eller (vi) permanent utarmet og tumor matet. Representative prikkplotter fra relevante grupper er vist, tre mus fra hver behandlingsgruppe ble analysert; (B) graf som representerer de midlere data fra dot plots i (a). Det er en betydelig forskjell mellom de musene som ble svulsten matet eller PBS matet og permanent utarmet med anti-CD25 (p 0,01), utarming under tolerering mens PBS eller JBS matet (p 0,001), kontroll Ab, tumor matet versus kontroll Ab , PBS matet (p 0,01). Det var en signifikant forskjell mellom de musene som ble behandlet med kontroll Ab eller PBS matet og de som ble behandlet med anti-CD25 Ab når som helst og PBS matet, (p 0,05). Det var ingen signifikant forskjell i Tregs mellom en hvilken som helst av de musene som ble matet tumor på tvers av behandlingsgruppene.
Vi undersøkte også effekten av oral toleranse og anti-CD25 Ab på systemisk aktiverte effektor lymfocyttpopulasjon , nemlig CD8
+ CD25
+ celler. Det var en økning i antallet teff-celler som var permanent utarmet og matet tumor sammenlignet med alle andre grupper (Fig. 6), og denne verdi ble nærmer betydning.
(a) milten fra mus i hver behandlingsgruppe ble farget for å bestemme CD3
+ /CD8
+ og CD3
+ /CD25
+ tall. Grupper var som følger (i) tumor matet, men ingen antistoff uttømming; (Ii) PBS matet og ingen antistoff uttømming; (Iii) PBS matet og anti-CD25 behandlet og (iv) tumor matet, anti-CD25 behandles. CD8
+ og CD25
+ ble undersøkt fra i CD3
+ befolkningen. Hvert forsøk ble utført in triplo; (B) Diagram som representerer endringene i Teff tallene følgende svulst fôring og Ab nedbryting. Kumulative data fra prikk plott representert i (a) (n = 3).
Anti-CD25 Ab Therapy Post-tumor Fôring seirer Induced Oral Toleranse
For å avgjøre om anti- CD25 Ab terapi kan oppheve en etablert tumor vekstfordel, mus som hadde fullført den orale tumor ernæringsplan ble tilfeldig inndelt i grupper for å motta anti-CD25 Ab versus kontroll Ab eller ingen Ab (PBS alene). Administrering av anti-CD25 Ab umiddelbart etter svulst foring, fjernes den tidligere observert tumorvekstfordel (fig. 7a). Dette ble funnet å være signifikant sammenlignet med de andre gruppene (p 0,03). Overlevelsesdata viste at 100% av musene som fikk anti-CD25 Ab ble herdet, en herdegrad som tilsvarer den gruppe mus ikke mates tumor og deretter behandlet med anti-CD25 Ab (fig. 7b).
( a) Mus ble matet tumor eller PBS og randomisert til å få anti-CD25 Ab, isotypekontrollantistoff Ab eller PBS. De som fikk anti-CD25 Ab hadde lavere tumorvekst sammenlignet med de andre gruppene. Den betydelige forskjellen i vekstrate mellom de som var svulst eller PBS matet ble opprettholdt i isotypekontrollantistoff Ab og ingen Ab grupper på bestemte tidspunkter (p 0,05); (B) Mus som ble tolerert til svulst antigen gjennom oral administrasjon av tumor ble deretter behandlet med anti-CD25 Treg uttømming behandling og ble helbredet for sin subkutan svulst gjenværende tumor fri i minst 100 dager.
treg tall i Herdet Mus
Den anti-CD25 Ab behandling ikke har langsiktige effekter på treg tall. Mus kurert for sine svulster gjennom anti-CD25 administrasjon ble undersøkt 30 dager senere og hadde lignende treg tall til naive dyr uavhengig av om de var fra muntlig tolerert eller kontrollgrupper (Fig. 8).
Ett hundre og tretti dager etter at behandlingen med anti-CD25-antistoff, ble musene avlivet og deres milt farget for CD4
+ CD25
+ Tregs. Det var ingen signifikante forskjeller sett i andelen av CD4
+ CD25
+ celler mellom de musene som hadde helbredet for sin svulst eller naive mus (n = 3 per gruppe).
diskusjon
de fleste pasienter som utvikler kreft i øvre gastrointestinaltraktus dør som en direkte følge av sykdommen. Selv for de med klinisk lokalisert svulster, som er utsatt for kurativ kirurgi, fem års tilbakefallsrater vanligvis over seksti prosent [18]. På tidspunktet for kirurgi, de fleste av disse pasientene har mikrometastaser i forskjellige vev indikerer hematogen spredning av kreft på et tidlig stadium av tumorutvikling. Dette etterlater pasienter i en minimal sykdomstilstand post-kirurgisk behandling. En behandling som kan rette immunsystem til å identifisere kreft Ags systemisk ville være ideelt, om ikke å fjerne alt av sykdomsbyrden, så i hvert fall til å skape en tilstand av svulst dvalen [19], [20].
Vi har tidligere vist at veksten av svakt immunogene JBS cellelinje i flanken av immun kompetente mus førte til en økning i celle tall treg i tumormiljøet, men ikke systemisk [8]. I denne studien har vi modellert tilstedeværelsen av tumorfragmenter i tarmen til den kliniske situasjonen ved gavage fôring av JBS celler til mus. Vi vil forvente at disse fragmentene som skal behandles ved den GALT og ville resultere i en systemisk hypo-reaktivitet overfor tumor Ags [13]. Vi har vist for første gang at CD4
+ CD25
+ Tregs systemisk stiger som respons på peroral administrasjon av hele (JBS) svulst. I tillegg har vi vist at induksjon av oral toleranse for en svulst ensidige vekstfordel til kreft.
Mus som tregs ble oppbrukt av anti-CD25 behandling, uavhengig av svulst eller PBS fôring, viste tilbakegang av svulster og langsiktige botemidler. Det var ingen forskjeller i responsrater mellom tumor matet og kontrollgrupper som indikerer at Treg hemming effektivt overvinner kombinasjons-p toleranse og tumorvekst påvirkninger. Det er sannsynlig at den tidlige induksjon av Tregs på det systemiske nivå, oppnås på denne studie av tumor foring, er ansvarlig for den tumorvekstfordel observert. Det er av interesse at det var ingen forskjell i antall CD8
+ T celler mellom noen av gruppene som tyder på at en reduksjon i Teffs skjer ikke med oral toleranse induksjon. Det er også sannsynlig at oral toleranse og tidlig treg respons ikke hemme immun allergi til svulsten, men hemmet effektorfunksjon som var det ingen forskjeller i tidspunkt eller fullstendig tumor regresjon etter Ab behandling mellom svulsten matet tolerert eller PBS kontrollgruppe av mus. Det var en betydelig forskjell i det totale antall CD4
+ CD25
+ Tregs hos mus som fikk anti-CD25 Ab og var tumor matet og styre saltvann matet grupper. Dette ble også observert i de grupper som ble midlertidig utarmet. Overraskende var det imidlertid ingen signifikant reduksjon i Tregs observert mellom gruppene som ble matet tumor og fikk enten en doseringsregime med anti-CD25 eller Ab isotype kontroll Ab. En mulig forklaring på dette kan være på grunn av analysen av treg tall ved hjelp av CD4
+ CD25
+ bare på dette stadiet av den eksperimentelle prosessen i motsetning til den mer spesifikke CD4
+ CD25
+
foxp3
+. Ingen signifikant reduksjon i Tregs kan faktisk innebære forsøksprotokollen og tidspunktet for undersøkelse av tregs og dose av anti-CD25Ab, som ble valgt på grunnlag av vår tidligere kunnskap om at maksimal Treg utarming var innen 7 dager Ab administrasjon. Dosen av Ab anvendt i denne studien sørget for en 90% reduksjon i treg tall i naive mus. Den samlede økningen i Treg tall som svar på fôring ble ikke tatt hensyn til med en økt dose av Ab. Til tross for dette ble det observert funksjonelle forskjeller mellom forskjellige doser av anti-CD25 Ab i de resulterende vekstkurver, noe som tyder på CD4
+ CD25
+ Treg celler er involvert i T-cellerespons som overfører den tumorvekstfordel etter mating. Dette kan skyldes det faktum at virkningen av å fjerne eller inaktivere funksjonelt Tregs med Ab sterk nedbryting under utviklingen av oral toleranse er nok til å tillate delvis utdannelse av immunsystemet, og utvikling av anti-tumor-cytotoksiske responser. Interessant, var det flere kurer sett i de gruppene som ble gitt anti-CD25 Ab på tidspunktet for fôring bare og matet tumor (75%) enn hos de som fikk Ab på tidspunktet for fôring og matet PBS (60%). Det kan være at Ag lasting med fôring og påfølgende inaktivering av tregs gi opphav til økt teff tallene kunne ha skjedd, og tilsvarende funn er påvist andre steder [21].
I klinikken, pasienter med GALT stede med en allerede oralt tolerert immunsystemet, og det gjenstår å fastslå om oral toleranse kan overvinnes etter tumorvekst er etablert. I studier av toleranse, har det vist seg at den adoptiv overføring av Tregs inn i murine modeller kan overvinne immunmedierte sykdommer [5]. I denne studien undersøkte vi hvorvidt fjerning av Tregs kan tillate utvikling av en cytotoksisk T-cellerespons til en subkutan tumor. Etter foring av tumor og etablering av oral toleranse, en enkelt doseringsregime med anti-CD25 Ab fjernet tumorvekstfordel som normalt ville bli sett i fravær av anti-CD25 Ab behandling. Videre administrasjonen av anti-CD25 Ab førte til kurer i alle mus skjuler subkutane svulster. Vi har vist at selv en etablert oral toleranse til en tumor Ag, og den resulterende aggressiv tumorvekst og overlevelse dårligere, kan overvinnes ved Treg dempning terapi. Dette resultatet tyder på at kreft i øvre mage-tarmkanalen vil være mottakelig for terapier som forsøker å inaktivere etablerte Treg celleaktivitet. Det er også viktig å merke seg at anti-CD25 Ab terapi ikke påvirke den systemiske treg populasjonene i behandlede mus etter behandling, sammenlignet med naive mus. Dette er viktig ettersom den begrenser muligheten for at anti-CD25 Ab terapi av autoimmune sykdommer kunne fjerne Tregs helt eller permanent
Resultatene av denne studien viser en mekanisme av toleranse -. En T-celle-mediert undertrykkelse av en antitumorimmunrespons. Identiteten til svulsten Ag (s) har ennå ikke etablert; men dette studium bekrefter og utvider seg på observasjoner av tidligere rapporter hvor matingen av tumor Ags ble vist å svekke antitumor cytotoksisitet og således støtter den hypotese at svulsten Ags som utskilles i den øvre mage-tarmkanalen og behandles av slimhinneimmunsystemet kan resultere i ned
