Abstract
Bakgrunn
LIM og SH3 protein 1 (LASP-1) er et spesifikt fokus vedheft protein som er kjent for å være involvert i en rekke biologiske og patologiske prosesser. LASP-en overekspresjon har vært beskrevet i flere typer kreft, men dens uttrykk og rolle i klarcellet nyrecellekreft (ccRCC) er ukjent.
Metoder
Ved hjelp av immunhistokjemi, analyserte vi LASP- 1 protein uttrykk i 216 clinicopathologically preget ccRCC tilfeller. Vi har også undersøkt LASP-1 uttrykk i 20 parvise ccRCC vev og i 2 cellelinjer ved real-time PCR og Western blot. Ved hjelp av RNA-interferens, undersøkte vi effekten av LASP-en utarming på tumorceller oppførsel
in vitro
. Statistiske analyser ble benyttet for å bestemme de assosiasjoner mellom LASP-1-nivå, tumor egenskaper og pasientens utfall.
Resultater
LASP-en overekspresjon ble observert i ccRCC vev (
P
0,0001) sammenlignet med adjuvant nontumorous vev, og dens uttrykk nivåer var nært korrelert med total overlevelse og residiv overlevelse (
P
= 0,044 og 0,006, henholdsvis) hos pasienter med ccRCC. RNA-interferens-mediert stanse av den LASP-1 genet i 786-0 ccRCC celler betydelig hemmet cellemigrasjon.
Konklusjoner
Resultatene fra denne studien tyder på at LASP-en kan tjene som en prognostisk biomarkør for ccRCC pasienter og kan være et lovende mål for behandling av ccRCC
Citation. Yang F, Zhou X, Du S, Zhao Y, Ren W, Deng Q, et al. (2014) LIM og SH3 Domain Protein 1 (LASP-1) Overuttrykte var assosiert med aggressiv Phenotype og dårlig prognose i Clear Cell nyrecellekreft. PLoS ONE 9 (6): e100557. doi: 10,1371 /journal.pone.0100557
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 21 mars 2014; Godkjent: 23 mai 2014; Publisert: 23 juni 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle cel-filer er tilgjengelige fra GEO
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Slett nyrecellekarsinom (ccRCC) er en vanlig urologisk kreft på verdensbasis [1]. Selv enorm forbedring har blitt gjort i behandlingen av ccRCC de siste årene, er fortsatt dødeligheten av ccRCC høy, fordi 40% av ccRCC pasienter som gjennomgår nephrectomy vil utvikle lokalt tilbakefall eller metastaser [2]. Derfor er pålitelige prognostiske biomarkører sterkt behov for å forutsi utfallet og identifisere terapeutiske mål for behandling av ccRCC pasienter.
LIM og SH3 protein 1 (LASP-1) har vist seg å spille en viktig rolle i kreftutvikling og progresjon [3], [4]. LASP-1 ble først identifisert fra et cDNA-bibliotek av brystkreftmetastaser, og genet ble kartlagt til humant kromosom 17q21 [5], [6]. Det humane LASP-1-proteinet inneholder 261 aminosyrer med en N-terminal LIM domene, etterfulgt av to actin-bindende domener i kjernen av LASP-1-proteinet som formidler interaksjonen mellom LASP-1 og aktin cytoskjelettet på stedet av cellemembrankoblinger, men ikke langs aktin spenningsfibre [7] – [10]. Den SH3 domene i C-terminus er involvert i protein-protein interaksjoner ved binding til prolin-rike sekvenser, spesielt zyxin, pallidin, lipoma-trukket partner (LPP) og vasodilator-stimulert fosfoprotein (VASP) [6], [11] . LASP-1 er lokalisert på flere steder av dynamisk aktin sammenstillingen, slik som fokale kontakter, fokal adhesjon, lamellipodia membran folder og pseudopodia [12], [13], men de nøyaktige funksjoner av LASP-1 er fortsatt ikke godt forstått.
LASP-1 er blitt rapportert å være overuttrykt i flere typer kreft og metastatiske kreftcellelinjer, slik som brystcancer [14], eggstokk-kreft [4] og tykktarmskreft [15]. Videre LASP-en stanse i metastatisk kreft cellelinjer resulterte i en sterk hemming av celleproliferasjon og migrasjon, og førte til zyxin reduksjoner på de brenn kontaktene [4]. Interessant,
in vitro
stanse av den LASP-1 genet redusert celleproliferasjon og migrasjon og sterkt påvirket zyxin lokalisering [3]. I tillegg genet transfeksjon-mediert LASP-en overekspresjon i SW480 CRC celler resulterte i aggressive kreftceller og fremmet kreft vekst og metastasering [15]. Imidlertid har rollene til LASP-en i ccRCC ikke beskrevet.
I denne studien undersøkte vi uttrykket av LASP-en i ccRCC bruker menneskelig ccRCC vevsprøver og cellelinjer, og vurdert sammenhengen mellom LASP-1 uttrykk og ccRCC utfallet etter reseksjon. Videre utførte vi RNA interferens (RNAi) -mediert genet Slå av LASP-en i ccRCC celler for å undersøke hvilken rolle LASP-en i ccRCC invasjon
in vitro
.
Materialer og metoder
pasienter og vevsprøver
To hundre og seksten nyrekreftprøver og deres tilstøtende nontumorous vev ble oppnådd fra pasienter med ccRCC som gjennomgikk radikal eller delvis nephrectomy ved Institutt for Urologi kirurgi, Xijing Hospital, fjerde Military Medical University fra august 2005 til september 2010. diagnosen ble bekreftet av den postoperative patologisk analyse. Pasienter med tidligere malignitet og de som tidligere hadde fått neoadjuvant terapi ble ekskludert fra studien. Ingen pasienter hadde påviselig fjernmetastaser ved kirurgi. Studiepopulasjonen bestod av 82 kvinner og 134 menn (gjennomsnittsalder, 63 år, aldersgruppe, 18-82 år). I denne studien, ble de kliniske og patologiske funksjoner registrert. Bruke 2010 TNM staging system og Fuhrman grade klassifisering, ble svulster klassifisert i følgende grupper for de statistiske analysene: tidlig stadium (TNM1 og TNM2), sent stadium (TNM3 og TNM4), lav karakter (grad 1 og 2) og høy grad (grad 3 og 4). De clinicopathological karakteristikker av pasienter ble hentet fra medisinske poster oppsummert i tabell 1. oppfølgingsdata ble innhentet via telefon, brev eller poliklinisk kliniske database. Alle pasientene ble fulgt fra datoen for første operasjonen til enten død eller sluttdatoen for denne studien (30 november 2013). Tilbakefall ble oppdaget i 127 pasienter (58,7%) i siste oppfølgningen, og 46 pasienter (31,0%) hadde dødd på grunn av ccRCC relatert sykdom. Gjennomsnittlig oppfølgingstid var 49,3 måneder (range, 1-67 måneder).
For real-time PCR og Western blot analyser, totalt 20 parvise tumorvev og matchet tilstøtende nontumorous vev ble innsamlet fra ccRCC pasienter som gjennomgår kirurgi behandling ved Institutt for Urologi kirurgi, Xijing Hospital, fjerde Military Medical University mellom mars og juni 2013. 20 pasienter inkludert 12 menn og 8 kvinner, med en median alder på 61 år (fra 21-79 år). Etter reseksjon, ble de friske vev umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Både svulsten og nontumourous vev ble bekreftet ved histopatologisk undersøkelse.
Undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av etikkomiteen av fjerde Military Medical University, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før operasjonen. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
Immunohistochemistry
De vevsprøver ble fiksert i 10% formalin og rutinemessig behandlet for parafin innebygging. Vevssnitt (5-mikrometer tykke) ble farget med hematoksylin-eosin og gjennomgått av to patologer å definere kreft og tilsvarende notumorous vev. Immunhistokjemi (IHC) ble utført på parafininnstøpte tumorseksjoner ved hjelp av antistoff mot LASP-1 (1:200, Abcam, Cambridge, UK) etter antigen henting. En negativ kontroll uten det primære antistoff ble fremstilt for alle prøvene. Den midlere LASP-1-ekspresjonen hastigheten ble vurdert ved inspeksjon av minst 5 mikroskopiske felt ved 400 x forstørrelse. LASP-1 uttrykk ble ansett for å være negativ når 10% av kreftceller i mikroskopiske felt demonstrerte farging, og lysbildene ble gjennomgått en gang til for å redusere lesefeil
Cellelinjer
.
786-0 menneskelige ccRCC cellelinjen ble hentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og dyrket i RPMI 1640 medium som var blitt supplert med 10% FBS. Den A498 menneskelige ccRCC cellelinjen ble hentet fra Tiancheng Technology Co, Ltd (Shanghai, Kina) og dyrket i DMEM medium supplert med 10% FBS. Cellene ble høstet i logaritmisk vekstfase for bruk i forsøkene beskrevet nedenfor.
Real-time PCR
Total RNA fra svulsten og nontoumorous vev av de 20 ccRCC pasientene ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) i henhold til produsentens anbefaling. Revers transkripsjon ble utført i en 20 ul reaksjonssystemet med 2 ug av total-RNA som var blitt behandlet med M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) for å syntetisere første-tråd cDNA i henhold til produsentens anbefalinger, etterfulgt av cDNA-amplifisering som tidligere beskrevet. Primersekvensene som ble brukt for real-time PCR for LASP-1 var: (F) 5′-ATGAACCCCAACTGCGCC-3 «og (R) 5′-TCAGATGGCCTCCACGTAGTT-3»
Western Blot
.
Totalt protein ble isolert fra svulsten og nontoumorous vev av seks ccRCC pasienter ved hjelp av Total protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing, Kina). 30 ug protein per spor ble separert ved anvendelse av 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel og overført til en polyvinylidin difluorid-membran. Membranen ble blokkert i 5% skummet melk i 2 timer og deretter inkubert med antistoff mot LASP-1 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK) eller β-aktin (1:5000, Abcam, Cambridge, UK) ved 4 ° C natten over. Etter vasking fire ganger i Tris-bufret saltvann med Tween-20, ble membranen probet med en pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff (1:2000, Proteintech Group, Chicago, Illinois, USA).
liten interfering RNA (siRNA) -mediert LASP-1 genet stanse
uttrykk for menneskelig LASP-en ble slått ned ved hjelp av siRNA tomannsboliger som følgende sekvens: 5′-AAGGTGAACTGTCTGGATAAG-3 «, 5»-CUUAUCCAGACAGUUCACCdTdT-3 «. Negative kontroll sirnas (5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «og 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3») som målretter ukjente mRNA-sekvenser ble anvendt som kontroller. Alle siRNAs ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). En BLAST søk av det menneskelige genom bekreftet at de valgte sekvensene var spesifikke for de aktuelle gener. Celler i eksponentiell vekstfase ble sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 0,5 x 10
5 celler /ml, dyrket i 24 timer og transfektert med 1 ug av siRNA når de hadde nådd 30-50% konfluens ifølge produsentens anbefalte protokoll. Fluorescein (FAM) -merket negativ kontroll siRNA ble anvendt for å visualisere transfeksjonseffektivitet.
In vitro
migrasjonsanalyse
celler i serumfritt medium (1 x 10
5 celler /200 mL) ble tilsatt til de beste kamre 8-mikrometer porestørrelse Transwell kamre (Corning Star, Cambridge, Massachusetts, USA). Bunnkamrene ble fremstilt ved anvendelse av 10% FBS som et kjemotiltrekkende. Cellene ble tillatt å migrere gjennom de porøse membraner i 20 timer ved 37 ° C. Cellene som hadde migrert gjennom membranen og fast til den nedre overflate av membranen ble behandlet med et fiksering /fargeløsning (0,1% krystallfiolett, 1% formalin og 20% etanol) for visualisering. For kvantifisering ble cellene tellet under et mikroskop i fem tilfeldig valgte felt under et Nikon ECLIPS 80i mikroskopi ved en forstørrelse på 400 x. Minst fem kamre fra tre uavhengige eksperimenter ble analysert.
Statistisk analyse
IBM SPSS statistikk 19,0 programmet ble brukt til å gjennomføre alle statistiske analyser. Forskjeller mellom kategoriske variabler ble analysert for statistisk signifikans ved hjelp av en chi-squared test, mens kvantitative variabler ble analysert ved hjelp av paret Wilcoxon test eller uparet
t
-test. Univariate og multivariate Cox-analyser ble brukt for å vurdere effekten av ulike faktorer på prognose. En Kaplan-Meier analyse ble brukt for å vurdere overlevelse og log-rank tester ble brukt for å sammenligne pasientens overlevelse mellom undergrupper. Alle
P
verdiene var tosidig, og
P
. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
LASP-en overekspresjon i RCC vev oppdaget ved hjelp av IHC
for å klargjøre den underliggende rolle LASP-en i RCC progresjon, må vi først undersøkte protein uttrykk nivået LASP-en ved hjelp av IHC i 216 tumorvev og matchet tilstøtende nontumorous vev. Vi fant at LASP-1-ekspresjonen var signifikant oppregulert i tumorvev sammenlignet med de tilpassede tilstøtende nontumorous vev (
P
0,0001; figur 1A, B og C).
LASP-1 protein ekspresjon i parafininnstøpte ccRCC vev (A) og tilstøtende vev nontumorous (B) ved hjelp av immunhistokjemi (forstørrelse 100 x), hvor positive LASP-1-immunfarging viste brun farge. Wilcoxon-analyse viste at tumorvev viste signifikant høyere LASP-1-ekspresjon enn nontumorous vev (C, n = 216). Western blot (D) og real-time PCR (E, n = 20) analyser som bekrefter de funn i immunhistokjemi analyse. Western blot-analyse viste også differensial LASP-1-ekspresjon i humane embrynal nyreceller (HEK-293) og ccRCC cellelinjer (F). T refererer til tumor vev, mens P refererer til peritumor (nontumorous) vev i panel D.
Verifisering av differensial LASP-1 uttrykk ved hjelp Western blot og real-time PCR-analyser i vev og cellelinjer
For å verifisere resultatene som oppnås ved IHC, vi har oppdaget LASP-1 uttrykk i 6 ccRCC vev og deres matchet tilstøtende nontumorous vev (figur 1D). Resultatene viser også økt LASP-1 uttrykk i tumorvev i forhold til nontumorous vev. Real-time PCR ble deretter brukt i 20 ccRCC vev og paret nontumorous vev, og LASP-1 mRNA nivåer ble også funnet å være oppregulert i tumorvev (figur 1E). Videre fant vi ut at LASP-en ble uttrykt i 2 ccRCC cellelinjer og humane embryonale nyreceller (HEK-293) ved hjelp av western blot analyse. I samsvar med resultatene oppnådd i vevsprøvene, høyere LASP-1-nivåer ble påvist i de mer aggressive cellelinje (786-0) enn i den lav-aggressive cellelinje (A498) eller HEK-293-celler (Figur 1F).
Økt LASP-1 uttrykk ble korrelert med tumorprogresjon og dårlig prognose i ccRCC pasienter
korrelasjon mellom LASP-1 uttrykk og clinicopathological egenskaper ble analysert ved hjelp av chi-squared test. Som oppsummert i tabell 1, betydelige korrelasjoner funnet mellom LASP-1 uttrykk og fire kliniske parametre, inkludert tumorstørrelse (
P
= 0,002), TNM stadium (
P
= 0,005), gjentakelse status (
P
= 0,006) og død status (
P
= 0,026). Forholdet mellom Fuhrman klasse og LASP-1 uttrykk viste border betydning (
P
= 0,081). Men det var ingen statistisk sammenheng mellom LASP-1 uttrykk og de resterende parametere, slik som alder og kjønn.
Vi brukte univariate og multivariate Cox regresjonsanalyser for å vurdere sammenhengen mellom LASP-1 uttrykk og utfall i ccRCC pasienter. I univariate analysen (tabell 2), tumor størrelse, Fuhrman klasse, TNM stadium og LASP-en oppregulering ble signifikant korrelert med dårlig total overlevelse (
P
= 0,034, 0,0001, 0,0001 og = 0,003 henholdsvis) og tilbakefall overlevelse (
P
= 0,005, 0,0001, 0,0001 og 0,0001, henholdsvis) i ccRCC pasienter. Da de fire faktorer som var signifikant assosiert med utfall (
P
0,05) i den univariate analysen ble underkastet en multivariat analyse. Den multivariat analyse viste at Fuhrman klasse, TNM stadium, og LASP-en oppregulering var uavhengige prognostiske faktorer for total overlevelse (
P
= 0,001, 0,0001 og 0,044, henholdsvis) og tilbakefall overlevelse (
P
= 0,002, 0,010 og 0,006, respektivt) i ccRCC pasienter (tabell 3). Videre Kaplan-Meier kurve analyse viste også at LASP-en oppregulering var signifikant assosiert med dårligere utfall i ccRCC pasienter (figur 2A og B).
LASP-en stanse hemmet ccRCC cellemigrasjon
in vitro
siRNA transfeksjon ble ansatt for å knockdown LASP-1 uttrykk i 786-0 celler, som viste høy endogen LASP-1 uttrykk. Effektene av siRNA transfeksjon på LASP-1-ekspresjon ble bekreftet ved hjelp av Western blot-analyse. Mengden av LASP-1-protein ble åpenbart redusert sammenlignet med den i de negative kontrollcellene (figur 3A). Videre er transwell invasjon analysen avslørte at stanse LASP-1-ekspresjonen dramatisk redusert celle mobilitet sammenlignet med kontrollceller (figur 3C). En uparet
t
-test ble anvendt for å vurdere forskjellen mellom 786-0 og si786-0 celler i antallet invaderte celler per felt (fig. 3B), som viste at antallet av celler pr invaderte felt ble betydelig redusert etter knockdown av LASP-1 uttrykk (
P
0,0001).
Western blotting ble brukt til å bekrefte knock-down av LASP-1 uttrykk i 786-0 celler ved siRNA transfeksjon (A). En uparet t-test ble anvendt for å vurdere forskjeller i antallet av invaderte celler per felt mellom de 786-0 og si786-0 cellelinjer (B). Transwell resultater for 786-0 og si786-0 cellelinjer er vist (C).
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi LASP-1 uttrykk i en serie av 216 ccRCC vev og har sammenlignet disse data med de som ble oppnådd i klinisk etablert ccRCC for første gang. Resultatene viste at proteinet uttrykket nivåer av LASP-1 var høyere i ccRCC vev enn de sammenkoblede nontumorous vev, som angitt ved IHC og validert ved hjelp av western blot og real-time PCR. Association analyser viste at LASP-en oppregulering var signifikant assosiert med større tumorstørrelse og verre TNM stadium. Tatt sammen, disse resultatene indikerte at LASP-1 kan spille en viktig rolle i progresjon ccRCC. Ytterligere prognostiske analyser indikerte at LASP-en overekspresjon kan være en uavhengig prognose faktor i ccRCC. Men videre studier med store utvalgsstørrelser nødvendig for å bekrefte disse funnene og etablere rollen LASP-en i å forutsi prognosen for pasienter med ccRCC.
Nyere data har vist at høy LASP-1 uttrykk i kreft er viktig for kreftcelle spredning, progresjon og metastasering [16]. Celler med høy LASP-1-ekspresjonen vist sterkere vitalitet og var mer utsatt for dannelse av metastatiske lesjoner på grunn av deres forbedrede evne til å danne kloner [17]. Tidligere studier har rapportert at stanse LASP-1 uttrykk i bryst, ovarier og kolorektal kreft cellelinjer fører til redusert celleproliferasjon og migrasjon [4], [14], [15]. I samsvar med resultatene av disse studiene, resultatene av den foreliggende
in vitro
eksperimenter i ccRCC cellelinjer som tyder på at LASP-1-ekspresjon er nødvendig for cellemigrasjon.
mekanismen som LASP- 1 påvirker kreftcelle spredning og migrasjon er fortsatt uklart. Cellemigrering og den kontrollerte montering og demontering av fokal adhesjon er sterkt integrert flertrinnsprosesser og sentrale trekkene i molekyl patologien av kreft [18]. Hittil har mer enn 50 forskjellige vedheft proteiner som regulerer hastigheten og organiseringen av aktin polymerisasjon og brennvidde heft omsetning i utstikkere blitt identifisert [19], [20]. LASP-1 har blitt vist å interagere med lipoma foretrukne partner (LPP) og zyxin, som begge kan påvirke filament aktin dynamikk [21]. Binding oppstår mellom den C-terminale domene av SH3 LASP-1 og N-terminal prolin-rike domener av zyxin og LPP [4]. Zhao
et al
. har rapportert at genet transfeksjon-mediert LASP-en overekspresjon i SW480 CRC celler resulterte i aggressive fenotyper i kreftceller og fremmet kreft vekst og metastasering [15]. Denne observasjonen understreker viktigheten av LASP-en i kreft.
Nyere studier har vist at LASP-en er transcriptionally oppregulert i respons til morfogen Sonic Hedgehog [22]. Forstyrrelse av the Hedgehog signalkaskade fører til en rekke utviklingsforstyrrelser og spiller en nøkkelrolle i dannelsen av en rekke humane kreftformer. I denne sammenheng er det interessant å merke seg at zyxin har også blitt identifisert som et forskjellig transkribert genet i flere typer kreft ved hjelp av mikromatriseteknologi [15]. Grunewald
et al
. har rapportert at LASP-en overekspresjon formidler menneskelig eggstokkreft celle migrasjon og spredning og påvirkninger zyxin lokalisering [4]. Zyxin er lokalisert i hovedsak på fokale vedheft plaketter og spiller en sentral rolle i aktin filament polymerisasjon i pattedyrceller. Zyxin tie i HeLa celler resulterer i betydelig reduksjon i aktin stresset fiber formasjon, mens etter syklisk strekning, zyxin bare dissosierer fra fokale kontakter og akkumuleres i kjernen, uten at det påvirker vinculin eller aktin filamenter [6]. Den reduserte celle motilitet etter LASP-en stanse kan forklares ved den funksjonelle tap av zyxin som et stillas protein som letter dannelsen av molekylære komplekser, og dermed fremme setespesifikk aktin [8]. I denne studien har vi slått ned LASP-1 uttrykk i 786-0 cellelinjen og observerte dårlig migrasjon evne in vitro, som var i samsvar med resultatene fra tidligere studier.
Konklusjoner
i sammendraget, observerte vi for første gang at LASP-en ble oppregulert i ccRCC, noe som tyder på at det er viktig rolle i utviklingen av ccRCC. LASP-en overekspresjon var assosiert med større svulster og aggressive fenotyper i ccRCC og lyddemping av LASP-1 uttrykk hemmet kreft celle migrasjon
in vitro
. Derfor LASP-en kan være en roman prognostisk biomarkør og et lovende terapeutisk mål for ccRCC.
