Abstract
Utviklingen av kreft innebærer genetisk predisposisjon og en rekke miljøeksponeringer. Genom-wide binding analyser gir bevis for signifikant binding til mange sykdommer i følsomheten loci på kromosom 8p23, plasseringen av det humane genet defensin klynge. Menneskebeta defensins (hBDs) er viktige molekyler av medfødt immunitet. Denne studien er designet for å analysere uttrykk og genetiske variasjoner i hBDs (HBD-1, HBD-2, HBD-3 og HBD-4) og deres antatte tilknytning til tykktarmskreft. HBD genekspresjon og relativ protein uttrykk ble evaluert av Real-Time PCR (qPCR) og immunhistokjemi, henholdsvis fra 40 normale pasienter og 40 alderstilpassede pasienter med tykktarmskreft i Saudi-Arabia. I tillegg ble HBD polymorfismer genotypede av ekson sekvensering og av arrangøren metylering. HBD-1, HBD-2, HBD-3 og HBD-4 basal messenger RNA ekspresjon var signifikant lavere i tumorvev sammenlignet med normalt vev. Flere innsetting mutasjoner ble oppdaget i forskjellige eksoner av de analyserte hBDs. Men ingen metylering i noen hBDs arrangører ble oppdaget på grunn av begrenset antall CpG øyer i disse regionene. Vi demonstrerte for første gang en kobling mellom HBD uttrykk og tykktarmskreft. Dette tyder på at det er en signifikant sammenheng mellom medfødt immunitet deregulering gjennom forstyrrelse av kationiske peptider (hBDs) og potensiell utvikling av tykktarmskreft
Citation. Semlali A, Al Amri A, Azzi A, Al Shahrani O, Arafah M, Kohailan M, et al. (2015) uttrykk og New Exon Mutasjoner av Human Beta defensins og deres tilknytning på Colon Cancer Development. PLoS ONE 10 (6): e0126868. doi: 10,1371 /journal.pone.0126868
Academic Redaktør: Isabelle A. Chemin, CrCl-INSERM, FRANCE
mottatt: 25 juli 2014; Godkjent: 08.04.2015; Publisert: 03.06.2015
Copyright: © 2015 Semlali et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. forfatterne utvide sin takknemlighet til den deanship av vitenskapelig forskning ved kong Saud universitet for finansiering av arbeidet gjennom forskergruppen prosjektet No: RGP-VPP-260 og av en bevilgning fra Fonds Émile-Beaulieu (Laval-universitetet Foundation)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarmskreft ( CRC) er den tredje vanligste diagnosen kreft blant menn og den fjerde mest vanlig blant kvinner over hele verden [1]. The American Cancer Society anslår at det vil være over 96 000 nye tilfeller av tykktarmskreft fører til ca 50 000 dødsfall i 2014 (American Cancer Society 2014). I Saudi-Arabia (KSA), er tykktarmskreft en av de hyppigste sykdommene [2], med en median alder på 60 år for menn og 58 år for kvinner [3]. Kreftutvikling er blitt rapportert å involvere genetiske faktorer [4] og også en rekke miljøeksponeringer [5]. Genetisk disposisjon for kreft er multifaktoriell, inkludert somatiske genetiske endringer, for eksempel mutasjoner i onkogener eller tumorsuppressorgener [6], og endringer i genuttrykk profilering eller DNA metylering. Genuttrykk profilering har tilbudt en ny måte å klassifisere humane tumorer [7]. Basert på mRNA ekspresjonsnivåer av spesifikke gener kan forskjellige undertyper av kreft bli identifisert. DNA-metylering er den mest studerte epigenetisk markør [8]. DNA hypermethylation-induserte genet Slå er et vanlig arrangement i mange ondartede sykdommer, som tjener som en alternativ mekanisme for å genetisk mutasjon for å påvirke tap av tumorsuppressorgener funksjoner [9,10]. Oppdagelsen av global DNA hypometylering i humane tumorer ble etterfulgt av identifikasjon av hypermethylated tumorsuppressorgener, og nylig, inaktivering av mikroRNA (miRNA) av DNA metylering har også blitt beskrevet [11,12]. Denne formen for epigenetisk endring kan bidra til tumor initiering og progresjon gjennom transkripsjonen stanse av tumorsuppressorgener. Faktisk har flere gener vist seg å være epigenetiske inaktivert ina bredt spekter av tumorer [13]; dermed kan begrepet «hypermethylation profil «av svulster har potensielle kliniske anvendelser [14-16]. Hypermethylated gener kan inkludere de som er involvert i cellesyklusregulering (p16INK4a, p15, Rb) [17], DNA-reparasjon (BRCA1, MGMT), motstand (MGMT), cellulær differensiering, angiogenese (THBS1) og metastasering [13]. Det finnes imidlertid begrenset informasjon om rollen til dereguleringen av medfødt immunitet gener og deres plausible tilknytning til tykktarmskreft. Videre bevis for rollen av det naturlige immunsystemet i beskyttelse mot tumorutvikling er blitt demonstrert ved undersøkelser som involverer immunkompromitterte pasienter [18]. Det er godt dokumentert at en svak immunrespons har en direkte og omvendt korrelasjon med mange typer kreft [19,20]. Alle cellene i kroppen har flere linjer med forsvar mot celle transformasjon, og menneskets immunsystem er en flott og godt koordinert nettverk av celler, organer og kjertler som beskytter kroppen mot upassende fysiologiske dereguleringer. En optimalisert immunsystem er nøkkelen til god helse og lang levetid. Videre har det medfødte immunresponsen betydelig spesifisitet mot konserverte molekylære mønstre av mikroorganismer komponenter, som kalles patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs). Reseptorene på immunceller som gjenkjenner PAMPs kalles mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS). Toll-lignende reseptorer (TLR) er en stor klasse av PRRS, og hver TLR gjenkjenner en annen PAMP [21-23]. Aktivering av en medfødte immunrespons fortsetter selv om binding til mønstergjenkjenning reseptorer så som TLR’ene. Disse TLRs er sentrale sensorer av invaderende patogener, i stor grad aktiveres av medfødt immunitet aktører som epitelceller [23]. TLR signalkaskade kan innebære aktivering av adaptermolekylet MyD88, og begge kaskader føre til aktivering av NF-kB å fremme transkripsjon av pro-inflammatoriske cytokiner, kjemokiner og kationiske peptider også kjent som human beta-defensiner (hBDs). Disse hBDs tilhører en familie av antimikrobielle peptider som utgjør en viktig del av det medfødte immunforsvaret. Hittil har fire hBDs (1-4) blitt identifisert i humant vev. HBD-1 blir konstitutivt produsert ved hjelp av forskjellige epitelvev, slik som luftveiene og huden [24], mens uttrykkene i hBDs er induserbar [25]. Spesifikt blir HBD-2 sterkt uttrykt i normale epitelceller etter kontakt med mikroorganismer eller cytokin (TNF-a og IL-1) stimulering [26,27].
Deres genomiske struktur består av to eksoner og en intron. Det første ekson koder for signalpeptid, og den andre koder for et modent peptid innledes med en kort anionisk pro-peptid. Den modne peptidet oppnådd etter den proteolytiske spaltning av signalsekvensen. Til tross for de lave sekvens likheter mellom disse proteinene, deres 3D-strukturer har en lignende defensin lignende topologisk fold som består av tre tråder anordnet i tre anti-parallelle plater begrenset av tre intra-molekylære disulfidbroer [28,29]. Beta-defensiner ha en klynge av kationiske rester (Lys, Arg) i nærheten av karboksyl termini av peptidene. Den C-terminale positivt ladede aminosyrer spiller en avgjørende rolle i antimikrobiell aktivitet [30,29]. De positive netto kostnad og hydrofobe egenskaper fremme hBDs samspill med mikrobiell membraner. hBDs utøve direkte antimikrobiell virkning og er aktive mot bakterier, sopp og virus; parallelt, i henhold til nyere data, har de flere biologiske aktiviteter, særlig immunmoduler seg [29], og er innblandet i den anti-tumorrespons.
Formålet med denne studien var å undersøke dereguleringen av hBDs genekspresjon profil, hBDs ekson mutasjoner, og formidler metylering av hBDs samt foreningen av disse funnene med tykktarmskreft opprykk i mennesker. Fra et klinisk synspunkt, kan proteiner som er involvert i disse banene tjene som mål for kreftbehandling, gjennom den potensielle bruken av HBD /TLR-immunoterapi.
Resultater
Kliniske data for pasienter diagnostisert med tykktarmskreft via koloskopi
De kliniske kjennetegn ved 40 Saudi pasienter, inkludert alder, nasjonalitet, familiehistorie, røykevaner, stadium av tykktarmskreft, medisiner og tilstedeværelse av andre sykdommer, ble samlet og sammenlignet mellom tykktarmskreft og kontrollpasienter. Den utvalgte populasjonen for ikke-røykere uten familiehistorie med tykktarmskreft og uten allergi. Studiepopulasjonen alder varierte mellom 45 og 75 år, med et gjennomsnitt på 60 ± 16,56 år for menn og 55 ± 13,74 år for kvinner (tabell 1). Det er også interessant å merke seg at et høyt antall av deltakerne som lider av kreft i tykktarmen ikke var gjennomgår kjemoterapi eller strålebehandling.
Differensial HBD genuttrykk i tykktarm kreft vev
For å analysere ekspresjon av de forskjellige hBDs (1-4) på mRNA-nivået, kvantitativ real-time revers transkripsjon-PCR ble utført ved anvendelse av tykktarmskreft vev og normale vev isolert fra den samme pasient. Som vist i figur 1, ble uttrykket nivåer av alle hBDs redusert i kreftvev, sammenlignet med normale vev. Spesielt de HBD-1-nivåer betydelig redusert (p 0,0001) fra 0,99 ± 0,02 i normalt vev til 0,29 ± 0,14 i kreftvevet (figur 1A). HBD-2 nivåer falt fra 1,03 ± 0,08 i kontrollene til 0,36 ± 0,18 i kreftvevet, med p 0,0001 (figur 1B). HBD-3 ble redusert fra 1,11 ± 0,11 i kontrollvevet til 0,48 ± 0,09 i kreftvev (figur 1C), og HBD-4 falt fra 0,99 ± 0,03 i kontroll vev til 0,46 ± 0,10 i kreftvev (Fig 1 D) .
Totalt cellulært RNA ferske hentet fra normale og tykktarm kreft vev ble revers transkribert til cDNA og deretter brukt til å måle HBD mRNA uttrykket (Panel1A til 1D).
Immunhistokjemisk sammenligning mellom forskjellige antimikrobielle peptider
For å bekrefte mRNA uttrykk data, bestemt vi hBDs protein uttrykk ved immunhistokjemi. Som vist i figur 2A, ble positive immunofarging for hBDs generelt observert hos normale tykktarm epitelceller og også i noen stromale celler. Imidlertid er intensiteten av fargingen for alle hBDs var lavere i de adenokarsinom kolon tumorvev. For å kvantitativt bestemme differensial uttrykk for hBDs i tykktarm kreft vev i forhold til normalt vev, telte vi positive celler og fastsettes en vilkårlig uttrykk nivå, som presentert i figur 2B til 2D. Disse resultatene bekrefter den lave nivåer av hBDs i kreftvev, sammenlignet med normale vev. Den observerte lave HBD proteiner bekrefter funn av lave nivåer av HBD genekspresjon.
Vev ble immunostained med bestemte HBD antistoffer (Panel 2A). hBD- positive celler i vev ble beregnet som følger: 0 poeng, ingen positiv farge; 1 poeng, 20% positiv farging; 2 poeng, 21-50% positiv farging; 3 poeng, 51-75% positiv farging; og 4 poeng, 75% positiv farging. Dette er presentert i panel B.
Prevalens av HBD ekson mutasjoner i kolon kreftpasienter
For å undersøke sammenhengen av HBD mutasjoner og deres lavere uttrykk i kolon kreftpasienter, ekson sekvensering for alle hBDs ble analysert.
de novo
mutasjonsraten av hBDs er estimert i tabell 2, for HBD-1; tre mutasjoner ble detektert i ekson 1 (to i den 5’UTR område før den oversatte sekvens og en i promotoren). Disse mutasjonene påvirker ikke proteinstruktur, men kan påvirke ekspresjon og stabilitet av mRNA. To andre innsetting av mutasjoner ble detektert i den oversatte område av exon 2 som førte til en umoden protein. Vi har også funnet fem mutasjoner i den 3′-ikke-translaterte området (3’UTR). Den 3’UTR er kjent for å inneholde regulatoriske elementer som er essensielle for den riktige ekspresjon av flere gener. ble funnet to typer mutasjoner: 8 (80%) ble innsettinger og 2 (20%) ble overganger. Som angitt i tabell 2, kan den samme pasient inneholde en eller flere mutasjoner i hBD1 region (eksempel T17 = tykktarmskreftpasient nummer 17 hadde 3 forskjellige mutasjoner av HBD-1-genet). Overgangen mutasjon i 3’UTR av HBD-1-genet er ikke assosiert med kreft i tykktarmen, men er i stedet forbundet med Saudi befolkning, som det ble funnet i alle normale og kreftdeltakere, unntatt i ett tilfelle (T4).
HBD-2, ble fire totalt mutasjoner detektert i colon cancer vev, men ikke i normalt vev: tre i promoteren (en overgang mutasjon og to innsettings mutasjoner), ingen mutasjoner i de oversatte sekvenser for exon 1 og ekson 2, og to overgangs mutasjoner i 3’UTR region (en overgang i 3’UTR er ikke forbundet med kreft i tykktarmen, men med den Saudi populasjonen). I HBD-2, ble tre typer av mutasjoner oppdaget: 1 (20%) var et transversjon, 2 (20%) var et innførings og 3 (60%) var overgangs mutasjoner. Alle mutasjoner som detekteres i HBD-2 ikke har noen konsekvens på proteinstrukturen, men kan påvirke HBD-2-ekspresjon og genet stabilitet. I HBD-3, alle mutasjoner (100%) ble detektert innsetting mutasjoner (tabell 2): en innsettings ble detektert i den 5’UTR region, en innførings ble funnet i den oversatte sekvens av ekson 1 som induserer en komplett sekvens starter ved endring residuet 4, såvel som tre andre mutasjoner i den oversatte område av exon 2 (ett av disse innskudd var i nærheten av stoppkodon), og tre innsetninger ble påvist i 3’UTR regionen av HBD-3-genet. Innsett 7 og 8 var spesifikk for Saudi befolkningen og var ikke forbundet med tykktarmskreft; alle svulster og alle normale vev presenteres disse mutasjonene (tabell 2). I HBD-4, ble tre totalt mutasjoner detektert: en i det 5’UTR som ikke påvirker den HBD-4 proteinstruktur og to i exon 2 som genererer et ufullstendig sekvens, med fullstendige sekvensen endring som starter ved restene 22 og 56. To typer av mutasjoner ble detektert i HBD-4: 1 (30%) var en overgang og 2 (60%) ble insersjoner (tabell 2). Men ingen metylering i noen hBDs arrangører ble oppdaget på grunn av begrenset antall CpG øyer i disse regionene.
Struktur-funksjon analyse
Vi har undersøkt genproduktet av hvert exon påvirket av en ramme-skiftmutasjon som en konsekvens av de observerte nukleotid-innsettinger. De resulterende sekvens oversettelser for hver HBD med berørte ekson produkter er illustrert i figurene 3 og 4. De to innsettinger på exon 2 av HBD-1, som rapportert i tabell 2, bevirker rammeskiftmutasjoner etter at peptidet signalsekvensen (fig 3A) . Følgelig kan ingen modne hBD1 proteinet bli syntetisert. Ingen innsetting ble funnet på exon 2 på den menneskelige HBD-2-genet (figurene 3B og 4B). Fem innsett ble funnet på HBD-3 genet i tykktarmskreft. Innsetting 1 resulterer i en ramme-skiftmutasjon fra residuet tre i peptid-signalsekvensen, uten noen modne HBD-3-syntese (figur 3C). Innsetting 2 fører til en ramme-shift mutasjon som påvirker 5 av 6 C-terminal rester, C63 → L, R64 → P, R65 → K og K66 → E (Fig 3C). I tillegg er et innsatt isoleucin funnet i sekvensen til det muterte HDB-3 ved den C-terminale ende (figur 3C). For å evaluere, konsekvensen av mutasjonen på strukturen av HBD-3, vi bygget en HBD-3 molekylær modell med mutasjonene påvirker den C-terminale ende. Figur 4C og 4D illustrerer posisjonene av mutasjonene i en tre-dimensjonal modell av HBD-3 sammenlignet med villtype-proteinet. Som vist på figur 4C og 4D, i kreftvev, er mutant to mangler den tredje disulfidbinding Cys63-Cys45 på grunn av Cys63 → Leu-mutasjon. Vi forutsi at denne mutant vil ha en mindre stabil struktur enn den til villtypeproteinet. S3 tabell viser virkningene av de andre mutasjoner. Vi har beregnet spådommer om protein stabilitet på den molekylære strukturen av HBD-tre med både popmusikk [31] og CUPSAT [32] programmer. Fig 3C og fig 4C og 4D viser de observerte ramme-shift mutasjon typer og de tilsvarende stabiliserende /destabiliserende effekt på HBD-tre struktur. Mutasjoner Cys63 → Leu og Arg64 → Pro påvirke aminosyrer som er nedgravd i strukturen og var fast bestemt på å være energisk destabiliserende, tyder på en reduksjon av protein stabilitet. Mutasjoner Arg66 → Lys og Lys67 → Pro påvirke løsemiddel eksponert rester og var fast bestemt på å være energisk stabiliserende (tabell 3). Innsetting 3 på exon 2 produsert Lys67 → Glu og den ytterligere rest I68, som ikke har noen virkning på strukturstabiliteten. Innsetting 4-2 ville produsere et protein med en ekstra C-terminal leucin (Fig 3C).
Mutasjoner er uthevet i rødt for hver hBDs genet.
når det gjelder HBD-4, kan innførings 1 forårsake ramme-skiftmutasjoner utgangs to rester etter signalpeptidet sekvensen, noe som resulterer i inhibering av modne HBD-4-proteinsyntese. Innsetting 2 introduserer en ramme-shift mutasjon fra rester 55-63, produsere en avkortet HBD-4 mutant protein
Diskusjoner
Tykktarmskreft er en betydelig offentlig helserisiko; det har vist seg å være den nest vanligste kreftformen i Saudi befolkningen [33] og ble rangert som nummer to i kreft dødelighet i USA [34]. Mange genetiske og epigenetiske mekanismer har vært fast bestemt på å bidra til tykktarmskreft, inkludert CpG hypermethylation, ikke-kodende RNA-endringer, somatiske mutasjoner og lysin acetylering av histoner [35]. Svært få studier har fokusert på de epigenetiske modifikasjoner ansvarlig for utviklingen av denne sykdommen. I denne studien, viste vi for første gang en klar sammenheng mellom HBD uttrykk /produksjon og tykktarmskreft. Våre data viser en signifikant reduksjon av hBDs i kreftvev, sammenlignet med normale vev. Disse dataene er støttende for de som tidligere er rapportert med HBD-1i nyre- eller prostatakreft [36-38] og også i muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) [39,40]. Interessant nok ble lignende data rapportert med HBD-2, som viser at HBD-2-mRNA og protein ekspresjon ble betydelig redusert i spyttkjertel kreft [41]. Andre studier ved bruk av forskjellige kreftcellelinjer har også vist at HBD-2 kan kontrollere cellevekst via arrest av G1 /S overgang og aktivering av pRB i maligne epitelceller [42]. HBD-3 er kjent for å undertrykke kreftcellemigrering [43]. I muntlig plateepitelkarsinom, menneske beta-defensin 1, 2 og 3 utstillings motsatte effekter på cellevekst. Derfor HBD-1 kan defineres som et tumorsuppressorgen, mens HBD-2 og -3 kan være proto-onkogener [44].
Dereguleringen av genekspresjon er ventet å påvirke 1-3% av transkriptom [45], inkludert medfødt immunitet gener hvis uttrykk er overveiende nedregulert i kreftvevet. DNA-metylering av CpG-rikt promotorområdene er å få anerkjennelse som en sentral mekanisme i inaktivering av de samme genene som er involvert som medfødt immunitet og tumorsuppressorgener i kreftceller [46]. En annen mekanisme for genet inaktivering er somatiske mutasjoner. Avhandlinger mutasjoner bidra til kreftdannelse. Vår hypotese var at nedregulering av HBD genekspresjon i colon cancer vev kan være på grunn av tilstedeværelsen av epigenetiske modifikasjoner, spesielt mutasjoner i HBD eksonene. I stedet, var det ingen påvisbar metylering i alle hBDs promo normale tykktarm vev og kreft tarmkreft (data ikke vist). Dette kan være på grunn av det reduserte antall av CpG øyer i HBD promotorer. Vi har fått bekreftet at pasienter med en ramme-shift mutasjon, den HBDs protein var helt fraværende. Den økende interessen for beta defensins stadig forbedre vår kunnskap om ulike aspekter av deres gen beliggenhet og uttrykk mønstre og transkripsjonsfaktorer som er involvert i deres regulering. Den HBD genomiske strukturen består av to eksoner og en intron. Det første ekson koder for signalpeptid, og den andre koder for et modent peptid innledes med en kort anionisk pro-peptid. I tillegg til å ha tilsvarende proteinfolding og struktur, strukturer av HBD-1, -2, -3 og har også avslørt at hvert protein er stabilisert ved tre disulfidbroer mellom konserverte cysteiner. I denne studien ble mange nye mutasjoner, innsettinger generelt, ble detektert i forskjellige eksoner (1/2). Disse mutasjoner bidra til betydelige endringer i proteinstrukturen av hBDs (dvs. HBD-1, HBD-3 og HBD-4). HBD-1-mutasjoner og mutasjon av en HBD-3 er de mest skadelige fordi de fører til avkortede pre-proteiner uten forutsagte modne HBD-1 proteinsyntese. HBD-3-mutasjon 2-proteinet er sterkt destabilisert på grunn av fraværet av en disulfid-bro forårsaket av substitusjon av Cys63 → Leu. I tillegg, i den samme mutant, innfører Lys67 → Glu substitusjon et negativt ladet, sur rest i en positivt ladet, hydrofobe C-terminale delen. Som det ble fastslått at aggregering av positive ladninger ved den C-terminale delen er viktig for antimikrobiell aktivitet [47], er innføring av en negativt ladet rest spådd å påvirke proteinfunksjonen. Begge HBD-4-mutanter er anslått å ha noen funksjonell peptid på grunn av endringer i proteinsekvensen. Ingen struktur forutsigelse kunne bli utført for denne mutant fordi dens struktur ikke er tilgjengelig. De andre mutasjoner funnet i HBD promoter regionen er spådd å påvirke uttrykket /stabilitet av de regulatoriske områder (5’UTR og 3’UTR) i tykktarm kreft vev, noe som forklarer hvorfor uttrykket av disse hBDs ble redusert i tykktarm kreft vev sammen med normale vev. Flere andre mutasjoner ble detektert i intronene i alle hBDs, som enten primært fantes i alle vev i Saudi-populasjonen (normal og kreft) eller bare ble funnet i vev fra pasienter med kreft i tykktarmen (data ikke vist). Disse intron mutasjoner kan ha en mulig rolle i tykktarmskreft, og dette funn krever videre undersøkelse. Fordi hBDs spille en aktiv rolle i det medfødte immunsystemet, kan tilstedeværelsen av ekson mutasjoner i hBDs føre til feilregulering av medfødt immunitet og senere hemme immunovervåkning mot tykktarmskreftutvikling.
Materialer og Metoder
Generelle reagenser
RNA stigen ble hentet fra Ambion /Life-teknologi (Burlington, ON, Canada). DNA /RNA-sett var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). Primere ble innhentet fra Life Technologies /Invitrogen (Burlington, ON, Canada). Den høye kapasitets cDNA revers transkripsjon kit var fra Applied Biosystems (Warrington, USA). SYBR Green ble hentet fra Bio-Rad (Mississauga, ON, Canada). HBD antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, U.S.A..). HBD-1 (N-20) er anti-kanin IgG for N-terminal, HBD-2 (C-17) er anti-Goat IgG for N-terminal. HBD-3 (FL-67) er anti-kanin IgG for N-terminal. HBD-4 (FL-72) er anti-kanin IgG for N-terminal. Mega BACE kit for sekvensering ble innhentet fra GE Health Life Science (Buckinghamshire, UK), og EpiTect Bisulfite kit for DNA metylering ble innhentet fra Qiagen (Toronto, Canada).
Pasientprøver
Prøver ble samlet inn fra 40 pasienter diagnostisert å ha kreft i tykktarmen (24 hanner og 16 hunner, mellom 45 og 75 år, med et gjennomsnitt på 60 ± 16,56 år for menn og 55 ± 13,74 år for kvinner og 40 alderstilpassede normale kontroller med ingen kreft. studien ble godkjent av Institutional Review Board av etikkomiteen ved King Khalid universitetssykehus i Riyadh, KSA nummer 12/3352 /IRB. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Normal vev i fjernt margin til svulsten ble samlet ved endoskopi. diagnosen kreft var basert på standard kliniske, endoskopisk radiologisk og histologiske kriterier. klinisk og demografiske karakteristika ble registrert, inkludert alder ved diagnose, kjønn, familiehistorie, røyking vaner, sykdom atferd, sykdom stedet, og behovet for kirurgi (tabell 1). Vevsprøvene ble brukt for RNA ekstraksjon, immunhistokjemi, og genomiske DNA-ekstraksjon.
Vevsprøver som skal brukes for RNA-analyse ble umiddelbart neddykket i RNA senere løsning (Ambion, Courtabeuf, Frankrike).
RNA isolering, revers transkripsjon og genekspresjon ved real-time RT-PCR
Totalt vev RNA ble ekstrahert ved hjelp av DNA /RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Konsentrasjonen, renhet og kvalitet av den isolerte RNA ble bestemt ved bruk av Agilent 2100 Bio-analysesystem og Agilent små RNA-analyse kit henhold til instruksjonene fra produsenten (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland).
RNA (1 pg av hver prøve) ble reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av en høy kapasitet cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Warrington, USA). Betingelsene for fremstilling av cDNA-templater for PCR-analyse var 10 min ved 25 ° C, 2 timer ved 37 ° C og 5 minutter ved 85 ° C. Kvantitativ PCR (qPCR) ble utført som tidligere beskrevet [48-50]. Mengdene av mRNA-transkripter ble målt ved anvendelse av Applied Biosystems 7500 Fast real-time PCR deteksjon system. Reaksjoner ble utført ved anvendelse av en PCR SYBR grønn Supermix fra Applied Biosystems. Primere ble tilsatt til reaksjonsblandingen ved en sluttkonsentrasjon på 250 nM. Fem mikroliter av hver cDNA-prøve ble tilsatt til et 20-pl PCR-blanding inneholdende 12,5 pl av SYBR grønn Supermix og 0,5 ul av spesifikke primere (HBDs eller GAPDH (S1 tabell)) og 7 ul av RNase- /DNase-fri vann. Hver reaksjon ble utført i en 7500 rask sanntid PCR Thermal Cycler. De termocykling betingelser for hBDs ble etablert som 5 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 36 sykluser på 15 sek ved 95 ° C, 30 s ved 63 ° C (bortsett fra HBD3 ved 52 ° C), og 30 s ved 72 ° C, med hver reaksjon utført i tre eksemplarer. Spesifisiteten av hvert primer-par ble bekreftet ved nærværet av et enkelt smeltetemperatur topp. GAPDH produsert ensartede uttrykk nivåer som varierer med mindre enn 0,5 CTs mellom prøvebetingelser, og ble derfor brukt som en referanse gen for denne studien. De amplifiserte produktene ble kjørt på en agarosegel for å bekrefte at det ikke var noen uønskede produkter forsterket i løpet av syklusene. Resultatene ble analysert ved hjelp av 2
-ΔΔCt (Livak) relative uttrykk metode.
Utarbeidelse av biopsier for immunhistokjemi
parafininnstøpte blokker av tykktarmskreft vev og normal tykktarm vev prøvene ble skåret i 3-mikrometer tykke seksjoner. Seksjonene ble montert på saltvann-belagte objektglass og inkubert i 15 til 20 minutter i en varm luft ovn ved 60 ° C. Vevssnitt ble deparaffinized med EZ Prep (Ventana, Arizona, USA) ved 75 ° C, varme forbehandlet i Cell Conditioning 1 (CC1, Ventana, Arizona, USA) ved hjelp av en «standard celle condition» protokoll for antigen gjenfinning ved 100 ° C, og deretter inkubert med en dråpe av inhibitor-løsning i fire minutter ved 37 ° C og deretter vasket. Platene ble inkubert i 32 minutter ved 37 ° C med en av de følgende antistoff (fortynnet 1: 100): anti-human-HBD-1, anti-human-HBD-2, anti-human-HBD-3 eller anti- human-HBD-4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Deretter ble det sekundære antistoff Ultra universell HRP-multimer tilsatt. Den immunolocalizedhBD-1, HBD-2, HBD-3 og HBD-4-proteiner ble visualisert ved hjelp av en kobber-forbedret DAB reaksjon. Negative tomme kontroller ble fremstilt under fargingen, hvori det første antistoffet ble utelatt og erstattet med PBS. Glassene ble kontra farget med Hematoxylin II og Bluing Reagent (Ventana, Arizona, USA) i 30 minutter ved 4 ° C, og deretter, flytende deksel-slip (LCS) ble tilsatt som en barriere mellom de vandige reagenser og at luften forhindre fordampning, for derved å tilveiebringe prøven stabilitet. Etter dette ble prøvene for montering i DPX dehydratisert ved sekvensielle vaskinger i graderte alkoholer: 70% etanol, 96% etanol og absolutt etanol og to endringer i xylen. Etter det, la vi til en liten dråpe DPX til prøven som beløper medier. De immuno-farget seksjoner ble analysert ved en Olympus BX51 lysmikroskop og DP72 Olympus digitalkamera (forstørrelse 200X og 400X) (Olympus America Inc, Center Valley, PA, USA).
Poeng ble gitt i henhold til nivået og omfanget av den farge som følger: 0 poeng, ingen positiv farge; 1 poeng, 20% positiv farging; 2 poeng, 21-50% positiv farging; 3 poeng, 51-75% positiv farging; og 4 poeng, . 75% positiv farging
Bisulfite behandling
Hvis du vil kontrollere metylering status for promoter-regionen bisulfit behandling og gjenvinning av prøver ble utført med den EpiTect Bisulfite (Qiagen) ved å følge produsentens instruksjoner. I korte trekk ble 2 mikrogram DNA i 20 ul volum anvendt for hver reaksjon og blandet med 85 ul bisulfitt blanding og 35 ul DNA beskytte buffer. Bisulfitt omdannelse ble utført på en termocykler som følger: 99 ° C i 5 minutter, 60 ° C i 25 min, 99 ° C i 5 minutter, 60 ° C i 85 min, 99 ° C i 5 minutter, 60 ° C i 175 min og 20 ° C på ubestemt tid. Bisulfitt-behandlede DNA ble gjenvunnet ved EpiTect spinnkolonne og deretter sekvensert for å bekrefte effektiviteten av bisulfitt konvertering. Den eluerte genomisk DNA ble anvendt for promoter-regionen amplifikasjon og sekvensering.
Polymerase kjedereaksjon og sekvensering
Genomisk DNA ble ekstrahert fra alle prøver ved å bruke en DNA-kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland). DNA-konsentrasjon av hver prøve ble målt ved bruk av en NanoVue ultrafiolett spektrofotometer. Alle eksoner i hBDs (1, 2, 3 og 4) ble amplifisert ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) primere (S2 Table). Forover- og revers ekson primerpar anvendt i PCR-reaksjoner er beskrevet i Tabell S2. PCR Blandingen inneholdt 50 ng DNA, 5 pmol /L hver primer, 2.5nmol /ml hver dNTP, og 1,25 U Taq-DNA-polymerase i 20 pl buffer med 0,04 umol /L Mg2 +. Etter en innledende denatureringstrinn ved 94 ° C i 5 minutter, ble 35 PCR-sykluser utført, som omfattet 45 s for denaturering ved 94 ° C, 30 s for annealing ved 60 ° C, og 45 s for forlengelse ved 68 ° C. PCR-produktene ble analysert ved 1% agarosegel-elektroforese. Etter å ha observert klare og nøyaktig store band, amplifikasjonsproduktene ble deretter renset og direkte sekvensert på en Sanger sekvens deteksjonssystem (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, USA).
Strukturell analyse av mutasjonene
3D-strukturen til de humane beta defensiner (Protein Bank datainngangs 1KJ6) [51] ble anvendt for å anslå virkningen av utvalgte genet frame-shift mutasjoner på strukturen av enzymet. 0,05 ansett som statistisk signifikant.
