Abstract
Aneuploidy med kromosom ustabilitet er en kreft kjennetegn. Vi studerte kromosom 7 (Chr7) eksemplar nummer variasjon (CNV) i hjernesvulst og i primærkulturer avledet fra dem. Vi fant svulst heterogenitet med celler som har Chr7-CNV ofte oppstår i hjernesvulst, med en høyere prosentandel av celler i høy klasse hjernesvulst med mer enn 2 eksemplarer av Chr7, sammenlignet med lavgradige gliomer. Interessant, alle Chr7-aneuploide celletyper i foreldrenes kultur etablerte glioma cellelinjer dukket opp igjen i encellede-avledet subkulturer. Vi så preget biologi tre syngene glioma kulturer som domineres av ulike Chr7-aneuploide celletyper. Vi fant fenotypiske avvik for celler etter Chr7 mis-segregering, som hadde fordel samlede tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Matematisk modellering antydet involvering av kromosom ustabilitet og interaksjoner mellom celle subpopulasjoner i å gjenopprette den optimale likevekt av tumorcelletyper. Både vårt eksperimentelle data og matematisk modellering viste at kompleksiteten av tumor heterogeniteten kan styrkes ved eksistensen av kromosomer med strukturell abnormalitet, i tillegg til sine mis-segregations. Samlet sett våre funn viser, for første gang, involvering av kromosom ustabilitet i å opprettholde svulst heterogenitet, som ligger til grunn for økt vekst, utholdenhet og behandling motstand av kreft
Citation. Hu Y, Ru N, Xiao H , Chaturbedi A, Hoa NT, Tian XJ, et al. (2013) Tumor-Specific kromosom Mis-Segregering Controls Cancer Plastisitet ved å opprettholde Tumor heterogenitet. PLoS ONE 8 (11): e80898. doi: 10,1371 /journal.pone.0080898
Redaktør: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, USA
mottatt: May 30, 2013; Godkjent: 17 oktober 2013; Publisert: 25.11.2013
Copyright: © 2013 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av UC Irvine oppsett midler og en sjenerøs Stern Familie gave (YHZ og ML), tilskudd gitt av UC Cancer Research Coordinating Committee, UC Irvine komité for forskning, Cancer Center Seed Grant (Award Number P30CA062203 fra National Cancer Institute), Musella Foundation for hjernesvulst Research Informasjon, og stemme mot Brain Cancer (YHZ), National Science Foundation DMS-0969417 (JX), VA Merit omtale Grant (MRJ). Zhenyu Jia er delvis støttet av Guizhou Normal College, Guiyang, Guizhou, Kina, QKHJ [2013] 2238. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Liping Yu er ansatt i Ziren Research LLC, Irvine, CA, USA. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ifølge Nowell innledende klonal evolusjon hypotese [1], er kreftutvikling en evolusjonær og økologisk prosess, på mange måter likner darwinistisk evolusjon [2]. Denne hypotesen støttes av prediksjon av tumorprogresjon med genetisk klonal mangfold i esophageal adenokarsinom [3], og nå er allment akseptert som en forklaring på svulsten heterogenitet observert i de fleste kreftformer på tidspunktet for klinisk diagnose, både originalen og metastatisk sider [4], [5]. Konseptet med kreft som en utviklingsprosess, med tumorer som har genetisk og fenotypisk variert celle subpopulasjoner er i overensstemmelse med den siste kreftstamcelle modellen, noe som understreker viktigheten av kreft som har en celletype som er i stand til å generere andre celletyper i en ensrettet måte [6 ] – [9]. Imidlertid funn av fenotypiske inter-konvertering mellom tre subpopulasjoner av celler i løpet av brystkreftcellelinjer, som fører til en cellepopulasjon likevekt [10] avslørte muligheten av kreft til å gjenopprette biologisk mangfold fra mer enn bare stilk-lignende celle subpopulasjon. En slik evne til å gjenopprette likevekt forhold etter en forstyrrelse er en funksjon karakteristisk for en etablert, godt balansert økosystem. Spørsmålet er hvorvidt, og hvordan, kreftcelle fenotypiske overgang manifesterer seg som en arvelig egenskap.
Samler bevis støtter forestillingen om at mitotiske feil årsak kromosom ustabilitet, som driver kreft evolusjon, med naturlig utvalg som skuespiller i en kreft økologi nivå å unngå cytogenetisk kaos. Tilsynelatende var den ikke-tilfeldig fordeling av kromosomale Avvik sett i bestemte tumortyper er en kombinert virkning av kromosom ustabilitet og seleksjon for spesifikke fenotyper blant store endringer av den transkriptomet [11] – [15]. Hjernesvulst er primære ondartede hjernesvulster har astrocytic og /eller oligodendroglial funksjoner i varierende malignitet. Den høyeste karakteren, dessverre mest sett glioma, er glioblastoma multiforme (GBM, grad IV), morfologisk, genetisk, og cytogenetisk heterogen, og jevnt fatale på grunn av sin raske mobilnettet spredning og sterkt krenkende oppførsel [16] – [19]. Det er kjent at endring av kromosom 7 (Chr7) eksemplar nummer oppstår i både høy og lav grad av hjernesvulst og at disse endringene ser ut til å være assosiert med invasiv og proliferativ celle fenotyper [20] – [24]. Her kan vi rapportere studier av Chr7-Aneuploidy-relaterte celle mangfold og rollen til Chr7 mis-segregering (Chr7-MS) med å opprettholde den fenotypiske mangfoldet av gliomer celle subpopulasjoner, som frembringer en synergistisk effekt på den samlede tumorvekst.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
frosne og ferske glioma prøvene ble levert av Tissue Banks fra University of California, Irvine og University of Arkansas for Medical Sciences, med Institutional Review Board godkjenning.
Animal arbeid og subkutan (sc) og intrakranielle (sc) xenografter
dyret arbeidet ble godkjent av Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra University of California, Irvine. For studier med intrakraniell (IC) xenografter, glioma celler (1 x 10
5/3 pl DMEM /F12) ble injisert i frontallappen av 4-6 uker gammel, kvinne, naken mus (flekk NCrNu-M, Taconic , Hudson, NY), godkjent følgende IACUC kirurgiske prosedyrer. Etter i.c. implantasjon, mus ble observert daglig og periodisk veid for døende tegn (pukkelrygg holdning, merket vekttap og gangart verdifall). Mus ble avlivet da de utviklet hjerne-skade symptomer (ataksi, hemiparesia, etc) og /eller 20% av kroppsvekten tap, og neste dag var posten som overlevelse dato for overlevelsesanalyse.
For studier med subkutan (SC) xenografter,-celler (1 x 10
6 celler /50 ul DMEM /F12) ble subkutant injisert inn i nakne mus, fremre til deres høyre og venstre lår, på begge sider. Tumormålinger ble tatt hver 3-4 dager etter implantering, og tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen V = (L * W
2) /2 (L, lengde; W, bredde). Mus ble avlivet ved et forutbestemt tidspunkt for eksperimentet, eller når tumorvolum over 1,5 cm
3.
gliom primærkulturer og cellelinjer
Friske humane glioma vev ble dissosiert enzymatisk (0,05% trypsin-EDTA i 30-45 min ved 37 ° C), avbrutt mekanisk (passerer gjennom en glasspipette i DMEM /F12 inneholdende 0,10 mg /ml DNase og 10% serum), og dyrket i både kollagen-belagte (3-4 ug /cm
2) kulturskåler i DMEM /F12 supplert med 5% føtalt bovint serum, betegnet som serum tilhenger (SA) dyrkningsbetingelser, og agar (1%) – belagte kulturskåler i DMEM /F12 supplert med epidermal vekstfaktor (EGF, 20 ng /ml), basisk fibroblast vekstfaktor (FGF, 10 ng /ml), og 1-5% B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), betegnet som nevrale sfære (NS) dyrkningsbetingelser. De flercellede glioma sfærer dannet i NS dyrkningsforhold ble vedtatt i fibronektin (1 mikrogram /cm
2) belagt retter i samme dyrkingsmedium før frysing eller utsette til FISH analyse.
Den menneskelige glioma cellelinjer ( A172, LN229, LG11, T98G, U251, og U87) ble hentet fra Department of Neuro-Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center. De genetiske profiler (7-STR markører som tilbys av IDEXX RADIL, Columbia, MO) som brukes av denne studien var identiske eller svært lik den genetiske profiler rapportert for hver cellelinje (tabell S1). A172 rapportert her ble opprinnelig kalt som D54, men bærer genetiske profiler som antyder en variant av A-172 rapportert av American Type Culture Collection (ATCC). U251 rapporterte her ble opprinnelig navngitt som U251HF, med genetisk profil som tyder på en variant av U251, sammenlignet med U251 i NCI-60 Cancer Cell linje Panel. Sammenligningene av U251 varianter (Tabell S2) ble levert av Beth Bauer (IDEXX RADIL).
Alle glioma cellelinjer (foreldre) ble dyrket i SA forhold. De avledede SA og NS kloner ble etablert fra enkeltkolonier ble dannet i 0,3% myk agar på toppen av et lag av bunn-agar (0,5%) i DMDM /F12 supplert med 5% kvegserum eller EGF /bFGF /B27 som for NS kulturer, plukket av et glass pipette, og utvidet i SA eller NS forhold. For U251 samme homozygot mutasjoner av PTEN [E242fs * 15 (723 724 insTT)] og TP53 (R273H) i foreldre og SA og NS-subkulturer ble identifisert ved Mariam Youssef, Nirvi Shah og Anthony Wong (UC Irvine).
fluorescens in situ hybridisering (FISH)
metafase-spredningsglass ble oppnådd ved å eksponere 80% confluently voksende celler til nacadozole oppløsning (100 pg /ml sluttkonsentrasjon, Sigma) i 1 time. Deretter ble cellene trypsinert (0,25% trypsin /EDTA, Invitrogen) for å samle cellepelleter, som ble behandlet med en hypoton løsning (fosfatbuffer) i 5 minutter ved 37 ° C. Cellepelletene ble løst (metanol: iseddik = 03:01) i minst 30 minutter. Til slutt, ble cellesuspensjoner slippes på objektglass for å få metafase-kromosom oppslag. Standarden B-banding ble gjort for lysbildene som de ble gjort som (samtidig) behandling med trypsin, og farget med Giemsa flekk (Invitrogen). FISH ble utført på metafase spreads og frosne tumorsnitt (7 mikrometer) med direkte fluorescerende DNA Probe Kits med CEP X /CEPY, EGFR /CEP 7 og PTEN /CEP10 (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL). Hybridisering, vasking, og kontra ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. 250-300 celler per prøve ble talt under et fluorescerende mikroskop med en 100 × linse.
lentivirusinfeksjon
Infeksiøs lentivirus ble produsert av co-transfeksjon av lentiviral vektor plasmid pGIPZ-Tom og pTRIPZ -tom (Open Biosystems) med emballasje plasmid psPAX2 og konvolutt plasmid pCMV-VSVG i HEK-293T celler, etter produsentens protokoll.
Immunofluorescensanalyse analyser av ic xenografter
De frysesnitt (7-8 mikrometer) av mus hjerner med i.c. xenotransplantater ble montert for direkte observasjon av fluorescens uttrykkes ved RFP og GFP-merket kreftceller ved hjelp av 2 × og 20 × objektiver av en Keyence BZ8100 fluorescens mikroskop, etter atom farging med DAPI. Tilstøtende frysesnitt ble underkastet immunfluorescens analyser med 15 ug /ml kanin BMI1 (ab38432, Abcam), 15 ug /ml mus CD133 (130-090-422, Miltenyi Biotec), 10 ug /ml mus CD31 (CBL1337, Chemicon), 15 ug /ml geite-GFAP (sc-6170, Sana Cruz), 10 ug /ml kanin MELK (A01390, GenScript), og 15 ug /ml mus SPARC- (SC-73051, Sana Cruz) primære antistoffer, etterfulgt av passende sekundært antistoff, esel anti-mus, kanin, rotte, geit eller Alexa Fluor 350 (blå), Alexa Fluor 488 (grønn), og Texas Rød (Invitrogen), som følge av immunofluorescens fremgangsmåte som tidligere beskrevet [25]. Vevssnittene ble montert med forlenge gull antifade reagens (Invitrogen), vises med en 40 x objektiv av et fluorescens mikroskop og avbildes med en flekk kamera. Samlokalisering bilder ble kjøpt og analysert ved hjelp av et Nikon to-laser (HeNe og Argon) PCM 2000 Confocal System på en Eclipse E800 mikroskop med 100 × objektiv (Melville, New York) _ENREF_20.
Neural stamcelledifferensiering assay
glioma-celler (5-10 x 10
3) holdes i neurale sfære kulturbetingelser ble sådd på 8-brønns glir forhåndsbelagt med fibronektin (10 ng /ml) over natten kultur i originalmediet ( undifferentiation), eller i poly-L-lysin (15 ug /ml) belagte brønner i DMEM /F12 inneholdende 1% FBS i 7-10 dagers dyrking (differensiering); et halvt volum av friskt medium ble tilsatt hver 3. dag, før fiksering for immunofluorescens analyser. Cellene ble fiksert med 4% PFA og blokkert med 10% esel serum. Primære antistoffer (kanin nestin (1:1000) fra Millipore (AB5922), mus MAP2 (1:200) fra Abcam (ab11267), og geit GFAP (1:300) fra Sana Cruz (sc-6170), mus Beta Tubulin III (1:200) fra Chemcon (MAB1637)), mus CD133 (01:50) fra Miltenyi Biotec (130-090-422), kanin MELK (1:200) fra GenScript USA (A01390) og kanin BMI (1: 200) fra Abcam ble inkubert med celler over natten ved 4 ° C og er utviklet ved hjelp AlexaFluor sekundære antistoffer (mus eller kanin Alexa Fluor 488 nm og 594 nm (1:200) fra Invitrogen).
Sanntidssammenlignende kvantitativ polymerase chain reaction (CQ-PCR) og kvantitativ revers transkripsjon (qRT-) PCR
DNA-prøver fra frosne glioma prøvene ble isolert ved hjelp av en DNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA). CQ-PCR standard (produkt CQ101) og PCR primere for å kvantifisere
EGFR Hotell og tre referanse gener i 2q34 (
SPAG16
), 3p14.3 (
ERC2
), og 5q31.2 (
SPOCK1
) var fra Ziren Research LLC (Irvine, California). Det er en rekombinant DNA inneholdende PCR-fragmenter av
EGFR
og referanse gener i ett stykke for å bestemme CNV som tidligere beskrevet [26]. Real-time PCR ble utført ved bruk av FAST-START SYBR-Grønn Jeg Master Mix (Roche).
Total RNA (~ 1 mikrogram) utvinnes ved hjelp Ultraspec (Biotecx) fra SA og NS-tilhenger kulturer, etter en 24-timers kultur i basalmedium, ble omdannet til cDNA ved anvendelse av 5 enheter av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen). CDNA prøvene ble fortynnet og kvantifisert for genekspresjon av real-time QRT-PCR (SYBR Grønn I) ved hjelp av en enkel standard for markør og referansegener [27], normalisert til
ACTB
. Kvantifisering av
GAPDH
ble også utført for å sammenligne med genet av interesse. Primersekvensene for gener i QRT-PCR og CQ-PCR er tilgjengelige fra Ziren Research LLC (www.zirenresearch.com) på forespørsel.
Comparative genome hybridisering (CGH)
DNA (1,5 mikrogram) prøver av glioma celler og kontroll (en pool av seks normale menneskelige blod DNA-prøver) ble ulikt merket med Cy5 og Cy3-dUTP, henholdsvis, renset og deretter hybridisert til en Agilent human Genome CGH 244 k Mikromatrise. Dataene ble statistisk analysert og visualisert ved hjelp av to uavhengige metoder, inkludert Agilent Genomisk Workbench 6.5 (Agilent) med Z-score algoritme og et program skrevet i R (https://www.r-project.org/), som oppdaget det samme kromosomavvik. Terskelen for Z-score brukes til Agilent metoden ble satt til 4.
Gelatin zymografi, enzym immunometriske analyser, Western blotting, og immunocytofluorescence
Proteiner i 24-timers klimaanlegg celledyrkningsmedier ble utfelt med 4 volumdeler kald aceton, sentrifugert umiddelbart ved 14.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C og resuspendert i radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer (RIPA) inneholdende protease inhibitor cocktail (Roche). Den samme mengde protein kondisjonert medium ble brukt til å kjøre gelatin zymografi. Kondisjonert medium ble utsatt for enzym-tilknyttede immunosorbent assay (ELISA) for VEGFA (VEGF-165) og SPP1 (osteopontin) med kits fra analysen Designs (Ann Arbor, Michigan), og PTN fra R 0,01 ble brukt som betydningen verdi for å justere for multiple sammenligninger uten overinflating Type II feil
Matematisk modellering
Matematisk modell Construction.
Betegne x1, x2, x3, x4, x5 som Forekomsten av celler med 1-5 kopier av Chr7. Vi neglisjert celler med 6 eksemplarer, forutsatt at de var anaphase stadier av tre-kopi Chr7 celler. Vi hadde ikke forventet at resultatene nedenfor vil bli betydelig påvirket av denne antagelsen ettersom andelen av de seks-kopi celler er lav i alle målingene. For enkelhets skyld antar vi også at mis-segregering forekomst av normal og unormal Chr7 er de samme. For pinner (2Chr7: 1n, 1d), antar vi at cellene kan enten dele symmetrisk, eller har en Chr7 mis-segregering, som oppsummert under
På samme måte for TMCs (3Chr7: 2n, 1d), har vi
parametere
r
i er vekstraten konstant arter
i
, p
2 og p
3 refererer til sannsynligheten for asymmetrisk (mis-) segregering av ett par Chr7 i pinner og TMCs per celledeling, henholdsvis. Generelt er disse sannsynlighetene avhenger av x, men for enkelhet vi forsømmer slik mulig avhengighet. Legg merke til at for det TMCs, kan dobbelt mis-segregering av to par Chr7 resultere i enten 1 + 5 eller 3 + 3, som vi anta en lik sannsynlighet. For celler med andre Chr7 kopiere tall, siden deres prosenter er svært lav, forsømte vi enda mindre bidrag fra mulige kromosom mis-segregering hendelser. De styrende rente ligningene er
For å forenkle diskusjonen vi også betegne prosentandel av hver undergruppe α på et gitt tidspunkt jeg så. Disse mengdene var det målt eksperimentelt ved hjelp av FISH.
Vi vurderer tre tilfeller
Ingen mis-segregering, dvs. p
2 = p
3 = 0 SC’er og MCs har ingen direkte gjensidig påvirkning
det finnes Mis-segregering, pinner og TMCs har ingen direkte gjensidige påvirkninger
Missegragation eksisterer, pinner delvis hemme veksten av TMCs, som er modellert etter en Hill-funksjon som, og MCs aktivere veksten av SC’er, som er modellert som der og er de veksthastighetskonstant på TMC når STIC prosenthenholdsvis og, og og er veksthastighetskonstant på STIC når henholdsvis TMC prosent og,. Vi har faktisk også vurdere saken med Hill koeffisient 4 i stedet for to, men resultatet viser ingen signifikant endring
Numerisk metode
De ovennevnte ordinære differensialligninger ble løst ved hjelp av Matlab. I begynnelsen av hver passering, rescale vi så. Eksperimentelt. For vår matematisk modellering eksakt antall N
0 påvirker ikke resultatene. For passasje 1, brukte vi verdiene av ρ brukt eksperimentelt som startverdier. For påfølgende passasjer, har vi brukt verdiene ρ beregnet ved slutten av foregående passasje som startverdier.
for hvert enkelt tilfelle, det beste sett av parametre ble oppnådd ved å minimalisere hvor og refererer til de beregnede og målte prosentandeler subpopulasjon α ved enden av passasjen i, henholdsvis. Vi brukte down-hill simplex tilnærming [28] for å utføre minimalisering. Med hver beste sett med parametere, spådde vi doblingstidene.
Resultater
Tumor heterogenitet spesifisert av Chr7-CNV vanligvis finnes i høy og lav klasse hjernesvulst
For å avgjøre Chr7 kopiantall variasjon (CNV) på celle undergruppe nivå, vi utførte fluorescerende
in situ
hybridisering (FISH), med to prober for
EGFR
genet og centromeric regionen av kromosom 7 (CEP7 ). Vi undersøkte GBM og oligodendroglial tumor (OT), den nest mest vanlige gruppen av hjernesvulst, preget av oligodendroglial funksjoner. OT inkluderer oligodendroglioma (OG, klasse II), oligoastrocytoma (OA, klasse II); og anaplastic oligodendroglioma (AO, klasse III), basert på kriteriene til Verdens helseorganisasjon. Antallet Chr7 sentromerer pr kjerne, som detekteres av FISH CEP7 probe, ble bestemt ved telling over 250 celler pr tumor, og disse data ble brukt for å fastslå nivået av tumor heterogenitet med hensyn til Chr7-CNV. Vi utførte en sammenligning av forskjeller i likevektstilstanden for svulst heterogenitet basert på Chr7-CNV data fra 14 GBMS og 12 OGer. Det var en betydelig høyere andel av celler som frakter mer enn 2 eksemplarer av Chr7 (forsterkning) i GBM sammenlignet OG (
P
0,0005) (figur 1A). I motsetning til OG, det Chr7-CNV i OA og AO var nær det av GBM, med representative data som er vist i figur 1B.
A, trefoldig tomt på befolknings proporsjoner med en kopi (sletting), 2 eksemplarer (normal), og tre eller flere (forsterkning) kopier av Chr7, basert på CEP7 signaler i Ffuorescent
in situ
hybridisering (FISH) av 14 glioblastom multiformes (GBMS,
Red trekant
) og 12 oligodendroglial tumor (OGer
svart firkant
),
P
= 0,0012 fra MANOVA analyse. B, sammenligning av tumor heterogenitet med hensyn til kromosom 7 (Chr7) Aneuploidy i den opprinnelige tumor (T) og tilsvarende 3-4 uker gamle primære kulturer i henhold til serum tilhenger (SA) eller neural sfære (NS) dyrkningsbetingelser. C-D, mønstre av celler med Chr7-CNV i sekvensielle og høy-EGFR forsterket GBMS. Representative FISH bilder av celler som bærer 1-4 kopier av Chr7 med fokus EGFR forsterkning.
For å finne ut om Chr7 CNV-preget tumorcellepopulasjoner er levedyktig og bidra til klonal mangfoldet innenfor hver svulst, vi undersøkte kortvarig (4-6 uker med 1-2 passeringer) primære kulturer i henhold til serum tilhenger (SA) og /eller neural sfære (NS) dyrkningsbetingelser. Vi fant undergruppe celler med Chr7-CNV i alle undersøkte glioma primærkulturer (Figur 1b). Det var en høyere prosentandel av celler med Chr7-forsterkning i kulturer fra GBM enn i de fra OG. I begge tilfeller er prosentandelen av celler med Chr7-ampliciation var høyere i primære kulturer enn i den tilsvarende tumor. For AO, som er en mer progressiv type OT, vi også observert en lignende Chr7-amplifikasjon i tumor og i dens avledede primærkulturen. Interessant, i oligo-astro blandet OT, kalt «OA», likevekt i celle sammensetning for Chr7-heterogenitet i de opprinnelige svulster var lik som i GBM. Men i OA-avledede primære kulturer, ble det observert heterogenitet påfallende som minner om OG, med et flertall av celler som har to Chr7 kopier og færre enn 40% av celler som bærer tre eller flere kopier av Chr7 (figur 1B).
Vi deretter sammenlignet mønstre av Chr7-heterogenitet i oG eller GBM med tilbakevendende og
de novo
status, og fant ingen sammenheng. Men det var mindre økninger i andelen av celler med Chr7-forsterkning i sekvensielle GBMS (dvs. svulster samplet over tid ved tilbakefall eller progresjon) fra en pasient med nevrofibromatose (figur 1C). Dette er i overensstemmelse med analysen ovenfor viser en raskere vekst evne for celler med Chr7-amplificaiton.
En direkte konsekvens av molekyl Chr7 forsterkning er forsterkningen av oncogenet EGFR oppholder seg inne i den, som gir en vekstfordel. Focal forsterkning av EGFR er vanligvis sett i den klassiske undertype av GBM [29]. Vi derfor sammenlignet Chr7-CNV med EGFR-CNV, bestemmes av sanntids komparative kvantitativ PCR. Vi har funnet en balansert
EGFR
i forhold til referansegener (forhold 0,7-1,3, gitt en 20-30% variasjon i mengde) i alle oligodendroglial tumorer (n = 17) og i 53% av GBMS (n = 51), og et lavt nivå av
EGFR
forsterkning (ratio 1,4 til 2) i 23,5% av GBMS, alle godt korrelert med beregnet
EGFR
nivåer, basert på prosentandelen av celler og deres Chr7 nummer. I de resterende 23,5% av GBM, har vi funnet en høy grad av
EGFR
forsterkning (forhold mellom 5-48), som ble bekreftet ved EGFR /CEP7 fisk som skal fokal EGFR forsterkning (figur 1D). I EGFR (fokale) amplifiserte GBMS, ble det mønster av Chr7-tumor heterogenitet funnet å være lik den som er i GBMS uten EGFR (fokal) amplifikasjon.
Tatt sammen, vi har observert en betydelig grad av tumor heterogenitet, med celler som viser Chr7-CNV vanlig forekommende i både lav- og høy klasse hjernesvulst. Monosomi av kromosom 10 er også et kromosom ustabilitet funksjonelt relatert til tumor malignitet [30] og forekommer i omtrent 80% av GBM tumorer. Når den er tilstede, er monosomi 10 vist homogent, i motsetning til heterogeniteten sett for Chr7. Denne forskjellen tyder på at det må være en aktiv fremgangsmåte for å opprettholde Chr7 heterogenitet i tumorer, som vi har identifisert til å være Chr7-MS. For ytterligere å studere denne prosessen vi undersøkte Chr7-MS og Chr7-CNV i etablerte glioma cellelinjer.
Chr7-MS er involvert i å opprettholde celle heterogenitet i etablert glioma cellelinjer
Vi utførte B- banding bruker Giemsa flekk på kromosom sprer av seks menneske ondartede glioma cellelinjer og bestemmes omfanget av hele kromosomtall (WCN) gruppert rundt modus basert på mer enn 7 celler. EGFR /CEP7 FISK ble utført og tellingene av CEP7 signaler i mer enn 250 interfase-celler ble anvendt for å bestemme prosentandelen av celler som bærer forskjellige antall av Chr7 (figur 2A). Alle glioma cellelinjer viste sameksistens av forskjellige celle subpopulasjoner basert på Chr7-CNV, med en betydelig prosentandel av celler som bærer 2-, 3-, og 4-kopier av Chr7 med en nær-diploid karyotype (U251, U87 og LG11) , 4-, 5- og 6-kopier av Chr7 i nesten triploids /tetraploid (A172 og LN229), og 6-, 7- og 8-kopier av Chr7 i nærheten-pentaploid Karyotyper (T98G).
A-B, prosentandelen av celler med Chr7-CNV i glioma cellelinjer, og deres SA og NS-subkulturer fra single (for eksempel 1, 2), eller blandet (mix) soft-agar kolonier, respektivt. Hele kromosomtall (WCN) som strekker seg nær den modusen ble funnet i 50% av cellene i hver glioma cellelinje. D, FISH bilder som viser normal (n) og derivatet (d) Chr7 og det ukjente (?) Kromosomet som bærer en translokert EGFR fra et representativt metafase celle for hver cellelinje. Kromosomet er vist ved DAPI (blå), er cent og EGFR vist ved FISH prober for CEP7 (grønn) og EGFR (rød).
Under SA-dyrkningsforhold som har blitt brukt til kultur disse glioma cellelinjer, etablerte vi subkulturer fra encellede plating eller enkelt soft-agar kolonier av glioma cellelinjer, som vi kalt SA kloner (SA1, SA2, etc). FISH viste gjen utseende av Chr7-celle heterogenitet i hver av de SA kloner (figur 2B), beholder karakteristiske trekk ved Chr7 og
EGFR
amplifisering og /eller translokasjon som ble funnet i foreldre kulturer (figur 2D) . Interessant, andelen av de cellene som hadde vært i flertall i foreldrekulturen redusert i de klonale SA subkulturer. Unntaket var LN229, som opprinnelig besto av to subpopulasjoner av celler nesten lik i prosent. Øyensynlig, ble tumor heterogenitet opprettholdt i den etablerte gliomer cellelinje ved Chr7-MS. Det indikerer også at en etablert cellelinje er en dyrket økosystem med celle-subpopulasjoner som når viss likevekt over tid. Vi lurte på da om ved å endre dyrkingsforhold kan vi endre heterogenitet likevekt, slik som å la en tidligere mindretall celle subpopulasjon å bli dominerende i henhold til nye dyrkningsforhold. Hvis det viste seg å være tilfelle, vil vi være i stand til å variere dyrkningsforhold for å oppnå tilstrekkelig antall ulike minoritets celler for videre studier av deres fenotyper og bidrag til samlet vekst.
Vi utsettes glioma cellelinjer til NS dyrkingsbetingelser, som opprinnelig ble utviklet for dyrking av nevrale stamceller og deretter modifisert for å anrike glioma-celler som uttrykker neuralstamceller-lignende cellefunksjoner [31], [32]. Vi har funnet at etter en måneds kultur i NS forhold, der det var en massiv dør av celler, (med de døde cellene gjentatte ganger fjernet ved å føre cellene frem og tilbake mellom ikke-adherente og fibronektin-mediert adherente betingelser i NS medium), en mindretall celle subpopulasjon i foreldre linjen kom til å dominere NS subkulturer. Vi videre etablert klonale NS subkulturer fra enkeltkolonier dannet i soft-agar tilberedt med NS medium, og kalte disse «NS kloner» (NS1, NS2, etc). Figur 2C viser representative fiskedata av NS subkulturer av glioma cellelinjer. Disse dataene viser re-opptredener av Chr7-celle heterogenitet fra klonale NS subkulturer.
Det tok 4 uker for kolonier å danne i myk agar, før de overføres til SA eller NS kultur forholdene for videre vekst. Etter overføringen, tok det ca 2 uker å få nok celler (2 × 10
5) for FISH analyse. Den tid som kreves for å re-etablere kultur heterogenitet fra en enkelt celle var mindre enn 18 celledelinger, som tok omtrent 6-7 uker. Re-få av heterogene cellekulturer med Chr7-CNV i klonale SA og NS subkulturer fra alle studert glioma cellelinjer viste at Chr7-MS kan skje i et undergruppe celle til å kjøre svulst befolkningen mangfold, mens dyrkningsforholdene bestemmes heterogenitet likevekt av tumorcelletyper.
dramatiske endringer i likevekt av celle subpopulasjoner mellom SA og NS kulturene ble notert for de to gliom cellelinjer med i nærheten av diploide Karyotyper, U251 og U87.
