Abstract
Gene enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) har blitt grundig studert i forbindelse med utvikling og prognose for ulike kreftformer. Imidlertid har den potensielle rolle av genetisk polymorfisme av kreft stamcelle (CSC) markørgener med hensyn til kreftrisiko ikke blitt undersøkt. Vi gjennomførte en case-control studie som involverte totalt 1000 pasienter (500 lungekreftpasienter og 500 alderstilpassede kreftfrie kontroller) fra nordøstlige Kina. Lungekreft ble analysert i en logistisk regresjonsmodell i forbindelse med genotyper av fire lunge CSC markørgener (CD133, ALDH1,
Musashi-en
, og EpCAM). Ved hjelp av univariat analyse,
Musashi-en
rs2522137 GG genotype ble funnet å være assosiert med en høyere forekomst av lungekreft sammenlignet med TT genotype. Ingen signifikante assosiasjoner ble observert for genvarianter av CD133, ALDH1, eller EpCAM. I multivariat analyse,
Musashi-1
rs2522137 var fremdeles signifikant assosiert med lungekreft når miljø- og livsstilsfaktorer ble innlemmet i modellen, herunder lavere BMI; familiehistorie med kreft; før diagnosen kronisk obstruktiv lungesykdom, lungebetennelse, eller lungetuberkulose; yrkesmessig eksponering for plantevernmidler; yrkesmessig eksponering for bensin eller diesel; tyngre å røyke; og eksponering for tung matlaging utslipp. Verdien av arealet under mottakeren ende karakteristikk (ROC) kurve (AUC) var 0,7686. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten for å vise en sammenheng mellom en
Musashi-en
genotype og risiko for lungekreft. Videre kan prediksjon modellen i denne studien være nyttig i å bestemme personer med høy risiko for lungekreft
Citation. Wang X, Hu J-F, Tan Y, Cui J, Wang G, Mrsny RJ, et al. (2014) Cancer Stem Cell Marker
Musashi-1
rs2522137 Genotype er assosiert med økt risiko for lungekreft. PLoS ONE 9 (5): e95915. doi: 10,1371 /journal.pone.0095915
Redaktør: Olga Y. Gorlova, Geisel School of Medicine ved Dartmouth College, USA
mottatt: 22 desember 2013; Godkjent: 01.04.2014; Publisert: 02.05.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China tilskudd (81071920, 81372835), Jilin-provinsen Science and Technology Department Grant (201201023), nøkkelen klinisk prosjekt Helsedepartementet av folke~~POS=TRUNC Kina Grant (2001133), National Institutes Helse stipend (1R43CA103553-01), California Institute of regenerativ medisin (CIRM) stipend (RT2-01942), Jilin International Collaboration Grant (20120720), Stiftelsen National Natural Science of China tilskuddet (81272294), og tildeling av Key Prosjekt av kinesiske utdanningsdepartementet 311015). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest vanlige ondartede sykdommer diagnostisert og den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i verden [1]. Sigarettrøyking er ansett som en viktig risikofaktor for lungekreft. Men bare 10-15% av røykere utvikle lungekreft, noe som tyder på at individuell variasjon i genetisk disposisjon for lungekreft i befolkningen kan spille en rolle. Cancer stamceller (cscs) er et lite mindretall av celler i en heterogen tumor befolkning som driver tumor vekst og har blitt assosiert med resistens mot kjemoterapi og stråling-terapi [2] – [4]. Det har blitt demonstrert at lunge cscs spiller en viktig rolle i startfasen [5], [6]. CDCs deler også noen likheter med normale stamceller, inkludert selvfornyelse og differensiering, i tillegg til deres potente tumor-drivende evne [7] – [10]. Cscs er kjennetegnet ved ekspresjon av bestemte molekylære markører som spiller en viktig rolle i å fremme stamcelleselvfornyelse og vedlikehold [11].
Aberrant ekspresjon av CSC markører er assosiert med initiering og utvikling av lungekreft, herunder klynge av differensiering 133 (CD133), Musashi RNA-bindende protein 1 (
Musashi-en
), aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1), epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM), B-celle-spesifikke Moloney murine leukemi virus integreringssete 1 (BMI-1), Octarner bindende faktor 4 (OKT-4), og Glycine dehydrogenase (GLDC) [12] – [20]. CD133, først beskrevet som en overflate antigen bestemt for menneske blodkreft stamceller [21], [22], blir nå brukt som et isolert markør for cscs fra lungekreft [23].
Musashi-1
, en RNA-bindende protein, er uttrykt i ulike epitel-stamceller og spiller en viktig rolle i regulering av vedlikehold og differensiering av stammen /forløperceller [24] – [26].
Musashi-en
er over-uttrykt i flere tumorvev, inkludert lungekreft [17], hjernesvulst [27], intestinal adenomer [28], [29] og hepatomas [30], noe som tyder på en sammenheng med onkogene utvikling. ALDH1 er ansett som en overflate markør for cscs i lungekreft [31] – [33]. ALDH positiv lungekreft stilk-lignende celler har lengre telomerer enn de ikke-CSC celler [34]. EpCAM, en type I transmembrane glykoprotein av ~40 kDa, er overuttrykt i en rekke av epiteliale tumorer, inkludert lungekreft [18] – [20]. EpCAM er involvert i intercellulær adhesjon og virker sammen med E-cadherin å indusere celleadhesjon [35]. Overekspresjon av EpCAM er knyttet direkte til stimulering av cellesyklusen og proliferasjon av oppregulering c-myc og cyklin A /E [36]. Hemming av EpCAM av små hemmende RNA avtar celleproliferasjon, migrasjon og invasivitet [37]
Sammen har disse observasjonene korrelert avvikende funksjon av CSC markør molekyler med cellulære kjennetegnene til kreft:. Hyper og metastaserende atferd. Mens SNPs har blitt grundig studert for deres tilknytning til risiko og prognose av kreft, er lite kjent om den potensielle rolle SNPs i CSC markørgener med hensyn til kreft. I denne studien undersøkte vi foreningen av lungekreft i en kinesisk befolkning med polymorfismer av de veletablerte CSC markørgener CD133, ALDH1,
Musashi-1 Kjøpe og EpCAM. En prognosemodell ble bygget ved hjelp av CSC markør SNPs og epidemiologiske faktorer; Resultatene gir en ny metode for å forutsi personer med økt risiko for å utvikle lungekreft.
Metoder
Study befolkningen
Vi gjennomførte en sykehusbasert, case-control studie som involverer totalt 1000 individer fra nordøstre Kina (Changchun i Jilin-provinsen). Alle fag var lokale innbyggere av Han avstamning, bestående av 500 pasienter klinisk diagnostisert med lungekreft og 500 kreftfrie kontroller. Pasientene hadde histologisk bekreftede primær lungekreft uten tidligere kreft historie, ikke fikk strålebehandling, cellegift eller andre anti-kreft terapi. Kontrollene ble tilfeldig valgt normale individer som fikk rutine fysiske undersøkelser i samme sykehus. Sak matching ble utført basert på alder, kjønn og bosted. Studien ble godkjent av etikkomiteen av det første sykehuset i Jilin Medical University, og gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen prinsipper. Alle forsøkspersonene ble gitt skriftlig informert samtykke.
Diagnostiske kriterier og datainnsamling
Et standardisert intervju ble gjennomført av erfarne intervjuere i sykehus eller hjemme hos deltar i programmet. Informasjon om sosiodemografiske opplysninger, medisinsk historie, familiehistorie, livsstil historie, og kreftdiagnose ble registrert. Risikofaktor informasjon og perifere blod lymfocytter ble samlet ved diagnosetidspunktet for kreftpasienter eller den dagen intervjuet for kontroller.
CSC markørgenet polymorfisme utvalg
Vi brukte en kandidat genet tilnærming [ ,,,0],38] – [40] for å velge SNP’er for denne studien. Fire veletablerte CSC markørgener (CD133, ALDH1,
Musashi-1 Kjøpe og EpCAM) ble valgt i studien design. Uttrykk av disse fire proteinene hadde blitt rapportert som en markør for å identifisere lunge cscs [41], [42]
Tre forhåndsdefinerte kriterier ble brukt for CSC SNP valg:. (A) mindre allel frekvens (MAF) ≥5 % i HapMap CHB befolkningen; (B) SNPinfo nettsted (https://snpinfo.niehs.nih.gov) for kandidat CSC genet SNP valg, og (c) publikasjoner som viser kliniske sammenhenger med kreftrisiko /utfall eller tilbakefall. Ved hjelp av disse kriteriene, ble fem CSC kandidat SNPs valgt i vår modell analyse: Rs2286455 i CD133 genet, rs1342024 og rs13959 i ALDH1 genet, rs2522137 i
Musashi-en
genet, og rs17036526 i EpCAM genet ( tabell 1). Basert på litteratur informasjon, ekskluderte vi polymorfismer tidligere innblandet i KOLS eller lungekreft. I tillegg har vi ikke velge SNPs i gener som koder for proteiner involvert i veier av cellesykluskontroll, oksidasjonsmiddel respons, apoptose og luftveier betennelse. Endelig unngås vi SNP’er kjent for å ha enten funksjonelle effekter på in vitro-testing, eller var ikke-synonyme eller på regulatoriske områder.
genotyping og kvalitetskontroll
Genomisk DNA ble isolert fra perifere blodlymfocytter. MassArray (Sequenom, San Diego, CA) ble brukt til å genotype CSC markører bruker allel bestemt MALDI-TOF massespektrometri. Grunning og multiplex reaksjonene ble utviklet ved hjelp av RealSNP.com nettstedet. Samstemmighet blant de 3 kontroll genomiske DNA-prøver som er tilstede i duplikat var 100%. Av de SNPs med genotyping data, prøven ringeprisene var mer enn 95%.
Statistisk analyse
Hardy-Weinberg likevekt (HWE) ble testet av en best mulig passform chi-square (χ
2) test som sammenlignet forventet genotypefrekvensene med observerte genotypefrekvensene i kreftfrie kontroller. Modellen ble også brukt til å bestemme tilstedeværelsen av betydelige forskjeller i genotype og allel fordeling samt SNP frekvens mellom klinisk diagnostisert lungekreft og kontroller. En logistisk regresjonsmodell ble brukt til å identifisere uavhengige risikofaktorer for lungekreft. Termin trinnvis likelihood ratio-metoden ble benyttet til skjerm variabler i modellvalg, hvor cut-off for variablene i modellen var 0,05 og cut-off for variabler utenfor modellen var 0,10; en optimal modell med minimum Akaike informasjon kriteriet ble valgt. Alle kategoriske variabler ble definert som dummy-variabler, og den første kategorien av hver variabel ble valgt som grunnlinje. Klassifiseringen evne til modellen ble evaluert ved hjelp av arealet under mottakeren opererer karakteristikk (ROC) kurven (AUC), og det optimale driftspunkt (OPP) ble gitt etterpå. Alle analyser ble utført ved bruk av SPSS v19.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle p-verdier var tosidig, og P-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Distribusjon av genotype og dens egenskaper i kreft og kontrollpopulasjoner
Vi rekrutterte 500 tilfeller av lungekreft og 500 kreft gratis kontroller mellom 2010 og 2012. Tabell 2 viser fordelingen og hyppigheten av studiespesifikke risikofaktorer mellom kreftpasienter og kontroller.
Association of CSC markør gen SNPs med lungekreft i univariat analyse
Vi vurderte først risikoen for lungekreft ved hjelp av univariat analyse. Blant CSC markør genet SNPs utvalgte,
Musashi-en
rs2522137 GG genotype hadde en tendens til en høyere forekomst av lungekreft enn rs2522137 GG genotype både recessive modell (P = 0.004) og additiv modell. Men ingen signifikante forskjeller ble lagt merke til for SNPs i andre CSC markørgener i dominant, recessiv, additiv eller multiplikative modeller (Tabell 3).
Association of SNPs med lungekreft i multivariat analyse
Neste, vi evaluert uavhengige risikofaktorer for lungekreft ved hjelp av multivariat analyse. Ved å innlemme miljø- og livsstilsparametre, fant vi at i recessive modell,
Musashi-en
rs2522137 var fremdeles signifikant assosiert med lungekreft. Disse miljø- og livsstilsparametre inkludert lavere BMI, familiehistorie med kreft, før diagnosen KOLS, lungebetennelse eller lungetuberkulose, yrkesmessig eksponering for plantevernmidler, yrkesmessig eksponering for bensin eller diesel, tyngre å røyke, og eksponering for tyngre matlaging utslipp (tabell 4). Disse dataene antyder at
Musashi-en
rs2522137 GG genotype er en betydelig genetisk risikofaktor for lungekreft.
ROC analyse
Klassifiseringen evne multivariate modellen ble ytterligere evaluert ved hjelp av arealet under ROC-kurven (AUC) og det optimale driftspunkt (OPP). Figur 1 viser ROC kurve utledet fra vår modell; AUC ble beregnet som 0,7686. Videre ble OPP oppnådd når avskjæringen ble innstilt på 0,47. De estimerte falske positiver, sanne positiver, og Youden indeksen ble bestemt til å være 0,28, 0,72 og 0,44 kroner.
ROC AUC var 0,7686. Den rette linjen representert ROC kurven forventes ved en tilfeldighet alene.
Sammenheng mellom SNPs og lungekreft typen
Til slutt, så vi for sammenhenger mellom CSC SNPs og lungekreft type (plateepitelkreft , adenokarsinom, småcellet) sammen med debutalder og kjønn for lungekreft. Vi observerte ikke statistisk signifikante forskjeller mellom disse CSC SNPs og alder eller kjønn på utbruddet av lungekreft (Bord 5). I patologi-stratifisert analyse, men CD133 SNP rs2286455 var signifikant korrelert med lungekreft type (P = 0,048) (Tabell 6). Det ble ikke observert forskjeller mellom de resterende SNPs som vurderes med lungekreft type.
Diskusjoner
enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) har blitt grundig undersøkt i praktisk talt alle krefttyper i et forsøk på å identifisere arvet kreft mottakelighet gener og deres samspill med miljøfaktorer. Cancer stamceller (cscs) spiller en viktig rolle i startfasen, metastaser, og gjentakelse. Vi har undersøkt mulighetene korrelasjon mellom SNPs stede i cscs og sannsynligheten for lungekreft. Dette er spesielt viktig siden SNP’er i CSC-kobler gener kunne gi en genetisk kobling til kreftformer som er spesielt vanskelig å behandle. Mens typiske kreft terapi kan fjerne det meste av tumormasse kan en liten bestand av cscs med potensial til å fylle den på svulsten forbli [5]. Det er generelt akseptert at cscs er preget av den unike uttrykk av celleoverflatemolekyler som kalles CSC markørgener. CSC markører spille en viktig rolle i opprettholdelsen av selvfornyelse og resistens mot apoptose bane aktivering i disse cellene. I denne studien har vi innhentet informasjon for å støtte hypotesen om at kliniske utfall i lungekreftpasienter kan være påvirket av genetiske varianter av CSC markørgener.
Den potensielle effekten av CSC markør genet polymorfismer på lungekreft mottakelighet har ikke vært tidligere utforsket. I denne studien tok vi fordelen av en hypotese-drevet kandidat-gen tilnærming [38] – [40] for å identifisere potensielt funksjonelle SNP’er assosiert med histologisk bekreftet lungekreft. I motsetning til genom-wide forening (GWA) og kvantitativ egenskap locus (QTL) nærmer kandidaten genet tilnærming er økonomisk og har ganske høy statistisk styrke [38]. Vi har fokusert på fire CSC markørgener som har blitt brukt for å isolere cscs: CD133, ALDH1, EpCAM, og
Musashi-1 product: [41], [42]. Bruke kandidat genet tilnærming, valgte vi et panel av SNPs i disse CSC genloci fra SNP nettsteder og peer-reviewed litteratur. SNPs identifisert til å ha høy allelfrekvens ble genotypet i 500 lungekreft tilfeller sammen med 500 alderstilpassede kontroller. Våre resultater har identifisert
Musashi-en
variant som en selvstendig risikofaktor for lungekreft. Det er også interessant å merke seg at
Musashi-en
rs2522137 genotype ble fortsatt forbundet med risikoen for lungekreft i en multivariat regresjonsmodell at vurdert flere miljø- og livsstilsfaktorer. Til sammen gir denne studien den første bevis for å korrelere
Musashi-en
rs2522137 SNP variant med lungekreft.
Foreløpig vet vi svært lite om de detaljerte molekylære mekanismer som
Musashi-en
rs2522137 polymorfisme kan bidra til lungekreft utvikling.
Musashi-en
er en evolusjonært konservert RNA-bindende protein som har dyptgripende konsekvenser i cellulære prosesser, for eksempel stamcelle vedlikehold, nervesystemet utvikling, og tumorigenesis.
Musashi-en
er sterkt uttrykt i mange kreftformer, mens i normalt vev, er dens uttrykk begrenset bare til stamceller. Det er nå klart at dette RNA-bindende protein er involvert i celle-asymmetrisk fordeling og er nødvendig for å opprettholde stamcelle identitet [43] – [45]. Interessant,
Musashi-en
mRNA transkripsjon inneholder en 1811-bp lang 3′-utranslatert region (3′-UTR). 3′-UTR av mRNA transkripter begraver vanligvis målstedet for regulatoriske mikroRNA (miRNA). SNP’er i 3′-UTR har vist seg å ha funksjonelle effekter for kontroll av mRNA-stabilitet og /eller translasjonsbevegelse effektivitet ved regulering av miRNA. Bindingen av miRNAs til 3′-UTR kan spille en viktig overordnet rolle i genuttrykk.
3′-UTR av modne
Musashi-en
mRNA potensielt målrettet av flere tumor suppressor mirnas, inkludert MIR-34a, -101, -128, -137 og -138 [46]. I tillegg har
Musashi-en
mRNA 3′-UTR inneholder flere auto- og U-rike sekvenser som er rettet av en evolusjonært konservert RNA-bindende protein Hur [47]. Hur er medlem av Hu /ELAV (embryonale dødelig unormalt syn) familie, som er sterkt uttrykt i svulstvev og forbedrer tumorigenesis ved å samhandle med en undergruppe av mRNA som koder for proteiner i regulering av celleproliferasjon, celleoverlevelse, angiogenese, invasjon og metastase [48], [49]. Bruk av nettstedet SNPinfo (https://snpinfo.niehs.nih.gov/), fant vi at
Musashi-en
3′-UTR begraver også potensielle måls for mirnas HSA-MIR-1275, HSA -miR-1285, HSA-MIR-483-5p, HSA-MIR-486-3p, HSA-MIR-612, og HSA-MIR-625. Det er verdt å merke seg at
Musashi-en
rs2522137 ligger innenfor disse miRNA og Hur bindingssteder. Fremtidige studier er nødvendig for å avgrense om rs2522137 varianter kan påvirke binding av disse regulatoriske miRNAs og Hur protein. Antagelig
Musashi-en
rs2522137 GG variant kan forstyrre bindingen av miRNAs og Hur faktor, og dermed øke stabiliteten av
Musashi-en
mRNA. Hvis det stemmer, kan denne mekanismen gi grunnlag for
Musashi-en
rs2522137 variant for å opprettholde selvfornyende lungekreft stamceller.
SNPs representerer nedarvede genetiske variasjoner som oppstår i løpet av levetiden til en individuell. Det er velkjent at ikke-genetiske risikofaktorer, slik som alder, tidligere lungesykdom, og røykevaner er også svært viktig og kan kombineres for å utvikle risikobaserte modeller av kreft. Robert et al [50], [51] har foreslått at SNP’er trenger å bli kombinert med andre risiko variabler for å identifisere individer som er mest utsatt for å utvikle lungekreft. Likeledes øker risikomodellen Liverpool Lung Prosjekt sin prediktiv evne til lungekreft ved å legge en markør SNP (rs663048) i SEZ6L genet [52], [53]. I denne studien, identifiserte vi en korrelasjon mellom lungekreft og en spesifikk SNP innenfor et CSC markørgen. Miljø- og livsstilsfaktorer som inngår i denne analysen, for eksempel yrkesmessig eksponering for plantevernmidler, yrkesmessig eksponering for bensin /diesel før diagnosen lungetuberkulose, og matlaging utslipp, gi en tilsvarende sammenheng i forhold til en alders matchet kontrollgruppe.
Oppsummert denne studien viste en signifikant økt risiko for lungekreft for CSC markør
Musashi-en
rs2522137-GG sammenlignet med -TT og -TG SNPs i en kinesisk befolkning. ROC AUC for vår modell var 0,7686, noe som indikerer muligheten for å identifisere høy-risiko individer i den kinesiske populasjonen ved å fokusere på informasjon som lett kan oppnås i den primære behandling innstilling. Endelig, dette risikoen for lungekreft prediksjon modell diskriminert mellom høy- og lav-risiko individer. Videre studier er nødvendig i større kohorter av uselekterte saker og kontroller for å ytterligere validere og omfang disse innledende observasjoner.
Takk
Vi takker Li Deng for teknisk assistanse i prøvetaking og forberedelse samt Lina Jin og Hua Han for deres hjelp i data og statistisk analyse.
