Abstract
Cisplatin-basert kombinasjonskjemoterapiregime er et rimelig alternativ til cystektomi i avansert /metastatisk blærekreft, men oppkjøpet av cisplatin motstand er vanlig hos pasienter med blærekreft. Tidligere studier viste at tap av homeodomain-veksel proteinkinase-2 (HIPK2) bidrar til celleproliferasjon og tumorigenesis. Imidlertid er rollen til HIPK2 i å regulere chemoresistance av kreft celle ikke fullt ut forstått. I denne studien fant vi at HIPK2 mRNA og protein nivå er betydelig redusert i cisplatin-resistente blærekreft celle
in vivo Hotell og
in vitro
. Nedregulering av HIPK2 øker cellenes levedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte i løpet av cisplatin behandling, mens overekspresjon av HIPK2 reduserer cellenes levedyktighet. HIPK2 overekspresjon delvis overvinner cisplatin motstand i RT4-CisR celle. Videre viste vi at Wip1 (villtype p53-indusert fosfatase 1) ekspresjon blir oppregulert i RT4-CisR celle sammenlignet med RT4 celle, og HIPK2 regulerer negativt Wip1 ekspresjon i blærecancercelle. HIPK2 og Wip1 uttrykk er også negativt korrelert etter cisplatin-basert kjemoterapi
in vivo
. Til slutt viste vi at overekspresjon av HIPK2 sensitizes kjemoresistent blærekreft celle til cisplatin ved å regulere Wip1 uttrykk.
Konklusjoner
Disse dataene tyder på at HIPK2 /Wip1 signale representerer en ny vei som regulerer chemoresistance, og dermed tilby et nytt mål for kjemoterapi av blærekreft
Citation. Lin J, Zhang Q, Lu Y, Xue W, Xu Y, Zhu Y, et al. (2014) nedregulering av HIPK2 øker motstanden av blærekreft Cell til Cisplatin ved å regulere Wip1. PLoS ONE 9 (5): e98418. doi: 10,1371 /journal.pone.0098418
Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, Tyskland
mottatt: 24 januar 2014; Godkjent: 02.05.2014; Publisert: May 20, 2014
Copyright: © 2014 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Menneskelig blærekreft er den tiende vanligste kreftformen hos. kvinner, og den fjerde mest vanlig hos menn [1], [2]. Patologiske studier indikerer at blærekreft omfatter to store grupper. Den vanligste blærekreft er urothelial karsinom (UC) som vanligvis gjentar seg, men sjelden videre [3], [4]. I tillegg er blærekreft mer aggressiv, og halvparten av pasienter med blærekreft utvikle fjern metastase [5], [6]. Chemoradiation er et rimelig alternativ til cystektomi i avansert /metastatisk blærekreft, men motstanden mot kreft kjemoterapi er et vanlig fenomen, spesielt i metastatisk blærekreft [7]. Har imidlertid fremskritt i kjemoterapi for formålet av blærekreft behandling vært begrenset fordi de underliggende mekanismene som forårsaker chemoresistance ikke er kjent. Avsløre den molekylære mekanisme av chemoresistance er uunnværlig for å utvikle effektive kjemoterapeutiske midler.
homeodomen-veksel proteinkinase-2 (HIPK2) er en serin /treonin kinase det som er vist å være involvert i tumor suppressor [8], [9], [10]. HIPK2 aktiveres som reaksjon på forskjellige typer av DNA-skadende midler, slik som cisplatin, ultrafiolett og roscovitine kjemoterapeutiske medikamenter [9]. HIPK2 fosforylerer p53 for spesifikk aktivering av proapoptotiske målgener, inkludert p53AIP1, PIG3, Bax og Noxa og bidrar til regulering av p53-indusert apoptose [11], [12], [13]. Puca
et al
viste at HIPK2 er en viktig regulator av p53-aktivitet i respons til et kjemoterapeutisk medikament [14]. HIPK2 er uttrykt på en annen måte i forhold til følsomme kjemoresistent cellene i respons til forskjellige kjemoterapeutiske medikamenter (dvs. cisplatin og adriamycin). HIPK2 inhibering undertrykker den adriamycin-induserte apoptose i kjemoresistent kreftceller, mens overekspresjon av HIPK2 utløser apoptose i celler kjemoresistent, assosiert med induksjon av p53Ser46-target-genet AIP1 [14], [15], [16]. Lazzari
et al
viste at HIPK2 knockdown induserer resistens mot forskjellige anticancer medikamenter, selv ved targetingΔNp63α i p53-null-celler [17].
Wild-type p53-indusert fosfatase 1 (Wip1) er en p53-induserbare serin /treonin-fosfataser som slår av DNA-skade sjekkpunkt responser ved defosforylering av visse proteiner, slik som p38-mitogen-aktivert protein kinase, p53, kontrollpunktet kinase 1 og kontrollpunktet kinase 2 [18], [19]. Wip1 er målrettet av HIPK2 for degradering [20]. Vekst data indikerer også at Wip1 er overuttrykt i forskjellige humane tumorer, og er forbundet med chemoresistance [19]. Wang
et al
viste at Wip1 knockdown øker DNA skade signalering og re-sensitizes muntlig plateepitelkarsinom (SCC) celler til cisplatin [21]. Ved hjelp av xenograft tumormodeller, viste de at overekspresjon av Wip1 fremmer tumordannelse og dens hemming forbedrer tumor respons på cisplatin [21]. Motsatt, Goloudina
et al
viste at Wip1 overekspresjon sensitizes tykktarmskreftceller HCT116 (p53
– /-) for å cisplatin i RUNX2 avhengig transkripsjonen induksjon av proapoptotiske Bax protein [22]. Imidlertid er rollen til Wip1 i å regulere cisplatin følsomhet av blærekreft celle ikke fullt ut forstått.
Basert på disse funnene, undersøkte vi om HIPK2 regulerer kjemosensitivitet ved å målrette Wip1 i blærekreft celle. Her fant vi at oppregulering av HIPK2 hemmer Wip1 uttrykk, som sensitizes kjemoresistent blærekreft celle til cisplatin.
Materialer og metoder
Cellelinjer og vevsprøver
De protokollene som brukes i studien ble godkjent av sykehusets beskyttelse av menneske fag komiteen. Blodprøver ble kjøpt med skriftlig informert samtykke fra Beijing Friendship Hospital Affiliated til Capital University of Medical Sciences. Hele 31 unresectable /metastatisk blærekreftpasienter ble inkludert i studien, og alle pasientene fikk cisplatin-basert kjemoterapi mellom 12/2011 og 08/2013 (median alder 62,3, range 51-80).
Humant blærekreft cellelinjer med villtype p53 (RT4 og 253J) ble oppnådd og opprettholdt som anbefalt av American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den cisplatin-resistente underlinjen RT4-motstand (RT4-CisR) ble etablert av kontinuerlig eksponering for økende konsentrasjoner av cisplatin over en periode på 12 måneder, som rapportert tidligere [23].
Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celler eller vev ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og revers transkripsjon (RT) reaksjoner ble utført i henhold til produsentens protokoll. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en standard protokoll fra SYBR Grønn PCR kit (Toyobo, Osaka, Japan). p-aktin ble brukt som referanser for mRNA. ΔCt verdier ble normalisert til p-actin nivåer. De to
-ΔΔCt metode ble anvendt for å bestemme den relative mengdebestemmelse av genuttrykk nivåer. Hver prøve ble analysert i triplikat.
Western blot-analyse
Western blot-analyse for å vurdere HIPK2, Wip1 og β-aktin-ekspresjon ble utført som tidligere beskrevet [24]. HIPK2 (ab28507) og Wip1 (ab72000) primære antistoffer ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). P-aktin primære antistoffer ble innkjøpt fra Sigma (MO, USA).
Celleviabilitet assay
Celler ble sådd ut og dyrket i 96-brønns plate i 0,1 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 10 % (v /v) føtalt kalveserum ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble mediet skiftet og 0,1 ml friskt medium inneholdende angitte medikament ble tilsatt, og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer. Antall levedyktige celler ble bestemt ved å bruke 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse som beskrevet [25].
RNAi og overekspresjon
RNAi ble utført som beskrevet tidligere [26], [27]. De sirnas brukt i denne studien var blandinger av tre sirnas og ble kjøpt fra Genepharm (Shanghai, Kina). pcDNA-HIPK2 og pcDNA-Wip1 ble konstruert for å overuttrykke HIPK2 eller Wip1 ved å innføre et fragment inneholdende HIPK2 eller Wip1 forløper inn i plasmid pcDNA.
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som middel ± standard avvik (SD) fra minst tre separate forsøk. Forskjellene mellom gruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
test. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant på
p
. 0,05
Resultater
HIPK2 uttrykk er redusert i chemo-resistente blærekreft celle
Cisplatin er foreløpig de mest effektive antitumormiddel mot avansert blærekreft. Imidlertid motstand mot cisplatin-baserte kombinasjonskjemoterapi er et vanlig fenomen, spesielt i metastatisk blærekreft. For å klargjøre de molekylære mekanismene bak cisplatin motstand i blærekreft, ble totalt 31 metastatiske blærekreftpasienter inkludert, og HIPK2 uttrykk nivå ble analysert etter cisplatin-basert kombinasjonskjemoterapi. Figur 1A viste at HIPK2 uttrykk hos pasienter som er chemo-resistente er betydelig redusert sammenlignet med chemo-sensitive pasienter. Da har vi etablert et cisplatin-resistent underlinjen fra den menneskelige blærekreft cellelinje RT4 (RT4-CisR), og analysert uttrykket nivået av HIPK2. Som vist i figur 1B, HIPK2 mRNA-nivåene var lavere i RT4-CisR-celler sammenlignet med celler RT4. Tilsvarende ble HIPK2 protein nivåer nedregulert i RT4-CisR celler (figur 1C). Disse data indikerer at nedregulering av HIPK2 kan være relatert til cisplatin motstand av blærecancerceller.
(A) ble utført Analysen av HIPK2 ekspresjonsnivået i blodprøver med cisplatin-sensitive pasienter (n = 19) og cisplatin-resistente pasienter (n = 12). Total RNA ble ekstrahert og utsatt for real-time RT-PCR for å analysere den relative nivået av HIPK2 i hver prøve. Relativ ekspresjon ble beregnet og normalisert med hensyn til p-aktin mRNA. Alle data ble uttrykt som ganger endring i forhold til en vev (kontroll, ekspresjon = 1). Resultatene ble uttrykt som Log10 (2
-ΔΔCt). *
p
0,05. (B) Den cisplatin-resistente sublinje RT4-CisR ble etablert ved kontinuerlig eksponering til økende konsentrasjoner av cisplatin i løpet av en periode på 12 måneder, og HIPK2 nivåene ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR. Relative HIPK2 nivåer ble beregnet i forhold til kontrollen. *
p
0,05. (C) Western blot-analyse av HIPK2 proteinnivå i RT4-CisR og RT4 celler (opp). Vi viste også relativ kvantifisering av HIPK2 proteinnivå (nederst, n = 3). *
p
0,05
HIPK2 knockdown øker cellenes levedyktighet under cisplatin behandling i blærekreft celle
For å undersøke hvilken rolle HIPK2 i cisplatin motstand, separat. overekspresjon og ablasjon forsøkene ble gjort ved hjelp av enten pcDNA-HIPK2 eller HIPK2 siRNA under cisplatin behandling og celleviabilitet ble analysert. Figur 2A viste at HIPK2 uttrykk nivåer ble redusert i RT4 celler behandlet med HIPK2-siRNA. Deretter RT4 celle ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin (0, 1, 2, 3, 4, 5 og 6 uM) i 48 timer. Som vist i figur 2B, HIPK2 inhibisjon øker markert RT4 cellenes levedyktighet sammenlignet med negativ kontroll (N.C). Ventet, knockdown av HIPK2 øker RT4 cellelevedyktigheten etter cisplatinbehandling i tidsavhengig måte (figur 2C). I RT4-CisR celler, cisplatin behandling resulterte i en beskjeden hemming av cellelevedyktighet, mens overekspresjon av HIPK2 re-sensibiliserte RT4-CisR celler til cisplatin (figur 2D og E). Tilsvarende ble HIPK2 ekspresjon hemmet i 253J celler etter HIPK2-siRNA behandling (figur S1), og HIPK2 inhibisjon øker 253J celleviabilitet i tidsavhengig måte (figur 2F). Disse dataene antyder at HIPK2 øker cisplatin følsomheten av blære kreft celler.
(A) RT4 celler ble transfektert med HIPK2-sirnas og HIPK2 uttrykk nivå ble analysert ved real-time PCR. N.C = negativ kontroll (kryptert) siRNA. (B) RT4-celler ble behandlet med HIPK2-sirnas, og cellenes levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT etter cisplatinbehandling (1 til 6 uM). Resultatene viser data fra seks uavhengige forsøk, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05. (C) RT4-celler ble behandlet med HIPK2-sirnas, og ved de angitte tidspunkter, ble cellenes levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT etter cisplatinbehandling (6 uM). Resultatene viser data fra seks uavhengige forsøk, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05. (D) RT4-CisR celler ble transfektert med pcDNA-HIPK2 og HIPK2 uttrykk nivå ble analysert ved real-time PCR. (E) HIPK2 ble overuttrykt i RT4-CisR celler, og cellenes levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT etter cisplatinbehandling (1 til 6 uM). Resultatene viser data fra seks uavhengige forsøk, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05. (F) 253J-celler ble behandlet med HIPK2-sirnas, og cellenes levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT etter cisplatinbehandling (6 uM). *
p
. 0,05
HIPK2 regulerer negativt Wip1 uttrykk
Tidligere studier har vist at HIPK2 regulerer tumorprogresjon og legemiddelresistens via flere potensielle mål gener, slik som Bax, p53AIP1, Noxa, etc [14]. HIPK2 spiller også en viktig rolle i initieringen av dobbel tråd bryte reparasjon signalering ved å kontrollere Wip1 nivåer som respons på ioniserende stråling [20]. Nyere studier viser at Wip1 er overuttrykt i forskjellige humane tumorer, og er forbundet med chemoresistance [19]. Men lite er kjent om hvorvidt HIPK2 regulerer cisplatin motstand ved å målrette Wip1. Vi først analysert uttrykket nivået av Wip1 i RT4 og RT4-CisR celler. Figur 3A og B viste at Wip1 mRNA og proteinnivåer signifikant oppregulert i RT4-CisR sammenlignet med RT4 celle. Vi deretter analysert hvorvidt HIPK2 regulerer negativt Wip1 uttrykk. HIPK2 knockdown økt Wip1 uttrykk nivåer i blære kreft cellelinjer (figur 4A), mens HIPK2 overekspresjon bemerkelsesverdig hemmet Wip1 mRNA nivå i blæren kreft cellelinjer (figur 4B). Western blot analyse viste at HIPK2 knockdown øker Wip1 proteinnivå (Figur 4C).
In vivo
, er en betydelig negativ korrelasjon også observert mellom HIPK2 nivåene og Wip1 nivåene hos pasienter med blærekreft etter cisplatin-basert kjemoterapi (
r
2 = 0,1507,
p
= 0,0063, figur 4D). Disse dataene viste at nedregulering av HIPK2 resulterer i en økning av Wip1 uttrykk.
(A og B) Wip1 mRNA og protein uttrykk nivåer ble analysert i RT4 og RT4-CisR celler, henholdsvis. *
p
. 0,05
(A) Wip1 mRNA nivåer ble evaluert av real-time PCR etter HIPK2 hemming i RT4 celler og 253J celler. *
p
0,05. (B) Relativ Wip1 mRNA nivå etter HIPK2 overekspresjon i RT4 celler og 253J celler. *
p
0,05. (C) Western blot-analyse av Wip1 nivå etter HIPK2 inhibering i RT4 og 253J-celler. (D) negative korrelasjonen mellom HIPK2 nivåer og de Wip1 nivåer i 18 pasienter med blærekreft etter cisplatin-basert kjemoterapi (
r
2 = 0,1507,
p
= 0,0063) . Relativ Wip1 eller HIPK2 ekspresjon ble beregnet og normalisert med hensyn til p-aktin mRNA. Alle data ble uttrykt som ganger endring i forhold til en vev (kontroll, uttrykk = 1).
HIPK2 overekspresjon sensitizes kjemoresistent blærekreft celle til cisplatin ved å regulere Wip1 uttrykk
Vi neste undersøkt rolle Wip1 i å regulere cellenes levedyktighet i løpet av cisplatin behandling. Figur 5A viste at Wip1 overekspresjon økt celle levedyktighet i RT4 cellene under cisplatin behandling. HIPK2 hemmer Wip1 uttrykk og minsker cisplatin motstand, og en betydelig negativ korrelasjon er observert mellom HIPK2 og Wip1. Vi har derfor spekulert i at rollen HIPK2 i å regulere cisplatin motstand formidles av Wip1. Figur 5B viste at HIPK2 hemming markert øker RT4 celleviabilitet sammenlignet med N.C, mens Wip1 hemming i HIPK2-downregulating celler dels reduserer celle levedyktighet. Tilsvarende Wip1 hemming i HIPK2-downregulating celler dels reduserer 253J celle levedyktighet (figur 5C). Mer viktig er celleviabilitet redusert med HIPK2 overekspresjon, mens Wip1 overekspresjon økt HIPK2-overekspresjon celle levedyktighet (figur 5D). Disse data bekrefter at HIPK2 overekspresjon sensitizes kjemoresistent blærekreft celle til cisplatin ved å regulere Wip1 uttrykk.
(A) Wip1 ble overuttrykt i RT4 celler og celle levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT følgende cisplatin behandling (6 mm). Resultatene viser data fra seks uavhengige forsøk, uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05. (B og C) RT4 og 253J-celler ble behandlet med HIPK2-siRNA eller HIPK2-siRNA plus Wip1-siRNA, og ved de angitte tidspunkter, ble cellenes levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT etter cisplatinbehandling (6 uM). (D) HIPK2 eller HIPK2 pluss Wip1 ble overuttrykt i RT4-CisR celler, og cellenes levedyktighet ble analysert ved hjelp av MTT etter cisplatinbehandling (6 uM). *
p
. 0,05
Diskusjoner
Menneskelig blærekreft er en av de mest dødelige kreftformer over hele verden, og forekomsten er økende i mange land. I tillegg til kirurgiske behandlinger, systematisk kjemoterapi, spiller en viktig rolle i blærekreft behandling, spesielt for pasienter med fremskreden eller metastatisk kreft i blære [28], [29]. Imidlertid, til tross for en rask krymping i tumormasse følgende kjemoterapeutiske sykluser, det chemoresistance av kreftceller ofte resulterer i den etterfølgende tilbakefall og metastasering av kreft [30], [31]. Med tanke på dårlig prognose for pasienter med blærekreft, hovedsakelig på grunn av sen diagnose og lav respons på kjemoterapi, forsøkte vi å identifisere prediktive markører for behandlingsrespons og molekylære mål å øke følsomheten for behandling.
Våre studier gir en begrunnelse for potensiell bruk av HIPK2 transduksjon å bevisst kjemoresistent blæren kreftceller til cisplatin. Vi viste at HIPK2 uttrykk nivåer er betydelig nedregulert i cisplatin-resistente RT4 celle (RT4-CisR) sammenlignet med RT4 celle. Nedregulering av HIPK2 øker cisplatin motstanden i en dose- og tidsavhengig måte i RT4 celle, mens tvangs ekspresjon av HIPK2 reduserer cellenes levedyktighet i løpet av cisplatin behandling. Videre overekspresjon av HIPK2 delvis overvinner cisplatin motstand i RT4-CisR celle. Tidligere studier har vist at HIPK2 aktiveres som reaksjon på forskjellige typer av DNA-skadende midler, slik som cisplatin, ultrafiolett og roscovitine kjemoterapeutiske medikamenter [14], [32], og er en viktig regulator av p53-aktivitet i respons til et kjemoterapeutisk medikament [ ,,,0],11], [14]. Overekspresjon av HIPK2 i p53 villtype re-sensitizes kjemoresistent eggstokkreft celler til kjemoterapi ved formidling av p53 fosforylering. Imidlertid er den molekylære mekanisme av HIPK2 i å regulere chemoresistance av kreftcelle ikke fullt ut forstått.
Wip1 er et p53-induserbar serin /treonin-fosfataser som slår av DNA-skade sjekkpunkt responser ved defosforylering av visse proteiner involvert i DNA reparasjon og cellesyklus sjekkpunkt [19]. Den Wip1 genet blir amplifisert i mange tumortyper [33]. Song
et al
viste at Wip1 samhandler med og dephosphorylates BAX å undertrykke BAX-mediert apoptose som svar på y-bestråling i prostatakreftceller [19]. Stråling-bestandig LNCaP celler viste dramatiske økninger i Wip1 nivåer og nedsatt BAX bevegelse til mitokondriene etter c-bestråling, og disse effektene ble falt av en Wip1 inhibitor [19]. Wang
et al
viste at Wip1 er et effektivt medikament mål for forbedret kreftbehandling [21]. Wip1 hemming øker DNA skade signalering og resensitizes muntlige SCC celler til cisplatin. Wip1 oppregulering fremmer tumordannelse og dens inhbition forbedrer tumor respons på cisplatin. I samsvar med ovennevnte resultatene, fant vi at uttrykket nivået av Wip1 er oppregulert i RT4-CisR celle sammenlignet med RT4 celle, og Wip1 overekspresjon øker cellenes levedyktighet under cisplatin behandling i RT4 celler. Viktigere, viste vi at HIPK2 regulerer negativt Wip1 uttrykk i blærekreft celle. HIPK2 og Wip1 uttrykk er også negativt korrelert etter cisplatin-basert kjemoterapi
in vivo
. Tvunget uttrykk for HIPK2 sensitizes kjemoresistent blærekreft celle til cisplatin ved å regulere Wip1 uttrykk. Konklusjon: Disse dataene viste at HIPK2 /Wip1 signale representerer en ny vei å regulere chemoresistance. Dermed denne studien viser at HIPK2 /Wip1 er et effektivt medikament mål for forbedret kreftbehandling.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
HIPK2 uttrykk nivå ble analysert ved real-time PCR i 253J celler. N.C = negativ kontroll (kryptert) siRNA. *
p
0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0098418.s001 plakater (TIF)
