Abstract
rolle
WDR3
genet på genomisk ustabilitet har blitt evaluert i en gruppe på 115 differensiert skjoldbruskkjertelen (DTC) pasienter. Genomisk ustabilitet har blitt målt i henhold til responsen av lymfocytter fra perifert blod for ioniserende stråling (0,5 Gy). Responsen har blitt målt med mikrokjerne (MN) test evaluere frekvensen av binucleated celler med MN (BNMN), både før og etter bestråling. Ingen forskjeller mellom genotyper, for BNMN frekvenser tidligere bestråling, ble observert. Likevel betydelig nedgang i DNA skader etter bestråling ble observert hos personer som bærer variant lene for hver av de tre genotypede SNPs: rs3754127 [-8,85 (-15,01
for bedriften -2,70), P 0,01]; rs3765501 [-8,98 (-15,61
for bedriften -2,36), P 0,01]; rs4658973 [-8,70 (-14,94
for bedriften -2,46), P 0,01]. Disse verdiene tilsvarer de som oppnås forutsatt en dominerende modellen. Denne studien viser for første gang at
WDR3
kan modulere genom stabilitet
Citation. García-Quispes WA, Pastor S, Galofré P, Biarnés J, Castell J, Velázquez A, et al . (2012) Mulig rolle
WDR3
Gene på Genome Stabilitet i tyroideacancer. PLoS ONE 7 (9): e44288. doi: 10,1371 /journal.pone.0044288
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 17 april 2012; Godkjent: 01.08.2012; Publisert: 26.09.2012
Copyright: © García-Quispes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Spanske departementet for lærerutdanning og naturvitenskap (SAF2007-6338) og Generalitat de Catalunya (CIRIT; 2009SGR-725). W.A. García-Quispes ble støttet av en predoctoral fellesskap fra Universitat Autónoma de Barcelona (PIF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kromosom region 1p12 har vært knyttet til ulike typer kreft, inkludert differensiert skjoldbruskkjertelen karsinom (DTC) [1], [2]. Tidligere studier utført av vår gruppe i denne regionen har funnet at
WDR3
genet, kartlagt i denne regionen, viser en signifikant sammenheng med DTC, noe som tyder på sin innblanding i etiologien av skjoldbruskkjertelkreft [3].
det finnes lite informasjon om rollen til
WDR3
, men det er kjent at den tilhører en familie av eukaryote gener bærer WD gjentar [4]. WD gjentakelser er minimal konservert regioner av ca 40 aminosyrer, vanligvis alternative av Gly-His og Trp-Asp, som kan legge til rette for dannelsen av heterotrimeric eller multiprotein komplekser. Siden WD-gjenta proteiner ikke eksisterer i prokaryote genomer, antas det at trolig de oppsto i den umiddelbare forløperne eukaryoter [5]. Proteiner som tilhører WD gjenta familien er involvert i en rekke cellulære prosesser; inkludert cellesyklusprogresjon, signaltransduksjon, apoptose, og genregule [6]. Med hensyn til
WDR3
gen, skal det nevnes at det koder for et kjerneprotein av 943 aminosyrer inneholdende 10 WD gjentar [4]. Dette genet er involvert i cellesyklusprogresjon og signaltransduksjon [7], og, selv om den spesifikke funksjon av
WDR3
er ukjent, en rolle i ribosom biogenese er nylig blitt rapportert [8].
siden ingen av funksjonene tilskrives WDR3 kan være spesielt knyttet til skjoldbruskkjertelen, hypotese vi at det kanskje er involvert i mer generelle mekanismer opprettholde genomisk stabilitet. Følgelig variasjoner i
WDR3
funksjon i forbindelse med eksistensen av genetisk polymorfisme kan generere genom instabilitet som kan resultere i en økt kreftrisiko. I denne sammenheng må det angis at ribosomale proteiner er blitt rapportert å være involvert i å opprettholde integriteten genomet [9].
Selv om genomiske ustabilitet er en sammensatt parameter, en generell karakteristikk av individer som viser sykdommer som Fanconis anemi eller ataxia telangiectasia er en dårlig respons mot midler som påvirker integriteten av genomet, som det er tilfellet med ioniserende stråling (IR). Således er Radiosensitivity betraktes som en biomarkør for genomisk instabilitet [10]. For å bestemme om en kandidat gen som er involvert i genomisk stabilitet må det påvises at celler som bærer forskjellige genetisk polymorfisme er spesielt følsomme i foran IR handlingen.
Her, vurderte vi forholdet mellom tre ikke-kodende enkelt nukleotid polymorfismer av
WDR3
genet og hyppigheten av mikrokjerne, både spontan og etter IR eksponering. Studien ble utført i lymfocytter fra perifert blod fra en gruppe av 115 DTC-pasienter, og nivåene av DNA-skade har vært evaluert ved hjelp av cytokinese-blokken mikrokjerne assay (CBMN), fordi det er et veletablert cytogenetisk teknikk med mange fordeler fremfor andre cytogenetisk tilnærminger. I denne sammenheng må det understrekes at det har vært godt demonstrert at CBMN analysen er svært nyttig som en markør for spontane og induserte DNA-skader [11] – [13].
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av etikk komiteer fra Hospital Universitari Vall d’Hebron i Barcelona, og Hospital Universitari Doctor Josep Trueta i Girona (Spania).
Befolkning studert
undersøkelsen ble gjennomført i totalt 115 tyroideacancer, 93 (81%) kvinner og 22 (19%) menn, rekruttert fra både Hospital Universitari Vall d’Hebron i Barcelona, og Hospital Universitari Doctor Josep Trueta i Girona (Spania). Gjennomsnittsalderen ved diagnose var 43,30 ± 15,07 (gjennomsnitt ± SD) år og 49,76 ± 16,49 når prøven ble innhentet. I henhold til tumortypen, 99 (86%) av pasientene ble klassifisert som papillær og 16 (14%) som follikulær.
Blodprøver ble tatt før behandlingen jod (
131I), etter å skaffe et skriftlig informert samtykke fra alle pasienter. Alle deltakerne på et spørreskjema, som dekker standard demografiske spørsmål, samt en kort yrkes, medisinsk og slektshistorie. Histologisk klassifisering av svulsten ble hentet fra medisinske poster. Alle deltakerne undertegnet en skriftlig tillatelse.
Cell kultur og behandling med IR
cytokinese-blokken mikronukleus (CBMN) ble utført ved hjelp av cytokalasin B teknikk og følge en standard prosedyre [14]. Blodprøver ble tatt ved venepunksjon og 0,5 ml heparinisert blod ble fortynnet med 4,5 ml komplett kulturmedium bestående av RPMI 1640, supplementert med 15% føtalt bovint serum, 1% antibiotika (penicillin og streptomycin) og 1% L-glutamin; alle kjemiske ble oppnådd fra PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike. Lymfocytter ble stimulert til å dele med 1% fytohemagglutinin (PHA) (Gibco San Diego, USA) umiddelbart etter behandling med IR.
Fire kulturer ble etablert per hver donor. To ble bestrålt med 0,5 Gy 137Cs gammastråler, mens de to andre forblir ubehandlet. Bestråling ble utført ved Unitat Tecnica de Protecció Radiologisk (UTPR-UAB) av Universitat Autónoma de Barcelona. Doseraten var 6,00 Gy min
1. Lymfocytter (bestrålte og ikke-bestrålte) ble dyrket ved 37 ° C i 72 timer. 44 timer etter stimulering PHA, ble 10 ul (3 mg /ml) av cytokalasin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) tilsatt for å gi en sluttkonsentrasjon i kulturen til 6 mikrogram /ml. Kulturer ble holdt ved 37 ° C og 5% CO
2.
Cell høsting og MN anledninger
Celler ble oppsamlet ved sentrifugering (10 minutter ved 120 g). Supernatanten ble kastet etter hver sentrifugering. Den hypoton behandling ble utført tilsetning av 5 ml av KCl 0,075 M ved 4 ° C i 10 min. Deretter ble cellene sentrifugert og et metanol /eddiksyre-blanding (03:01 v /v) ble forsiktig tilsatt. Denne fiksering trinnet ble gjentatt to ganger, og de resulterende cellene ble resuspendert i et lite volum av fikserløsningen. Lufttørkede preparater ble laget og objektglassene ble farget med 10% Giemsa (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) i fosfatbuffer (pH 6,8) i 7 min. Lysbilder ble kodet av en person ikke er involvert i scoring.
For å oppdage nivået av genetisk skade, ble hyppigheten av binucleated celler med mikrokjerner (BNMN) evaluert. En blindet scoring på 1000 binucleated celler per prøve (bestrålt og ikke-bestrålt) ble analysert for å bestemme tilstedeværelsen av mikrokjerner, i henhold til standardkriterier [14].
SNP utvalg
polymorfismer brukt i denne studien ble valgt i henhold til våre tidligere analyser [3]. Derfor valgte vi tre tag SNPs viser haplotype forbindelse med skjoldbruskkjertelen, rs3754127 (C /T, 5 «nær genet), rs3765501 (G /A, intron) og rs4658973 (T /G, intron).
DNA-ekstraksjon og SNP genotyping
DNA ble isolert fra perifert blod, ved hjelp av standard fenol-kloroform-metoden. SNP genotyping ble utført ved Centro Nacional de Genotipado (CeGen) ved hjelp av iPLEX (Sequenom) teknikk, og det ble vellykket genotypet i henhold til kvalitetskontroll kriteriene til CeGen (https://www.cegen.org). For å sikre den pålitelighet genotyping, ble 10% av prøvene tilfeldig valgt og dobbelt genotypet ved replika i multiple 96-brønners plater. I tillegg ble to HapMap referanse trioer innlemmet i plater og genotype concordance og korrekt Mendels arvelover ble bekreftet.
Statistisk analyse
I analysen av forskjeller, koblingsulikevekt og haplotype frekvensestimering ble utført ved hjelp av web verktøy for SNP analyse SNPStats [15]. Lineær regresjonsmodell for dominant og codominant arv ble utført. Alle analyser ble justert for alder, kjønn og histologisk diagnose. Haplotype analysene ble utført ved hjelp av samme web-verktøyet. Haploview programvare [16] ble brukt til å undersøke LD mellom SNPs. Andre statistisk analyse ble gjort ved hjelp av R-versjon 2.12.1 [17].
Resultater
Generelle trekk ved de utvalgte DTC pasienter er oppsummert i Materiale og metode delen. Som antydet, kvinneandelen var høyere enn for menn, noe som reflekterer den høyeste forekomsten av DTC i kvinner. I tillegg er den forhøyede forekomst av papillær thyroid kreft indikerer overvekt av denne histologisk subtype.
Tabell 1 viser at den midlere av spontan BNMN frekvens i de 115 pasienter som var 6,87 ± 0,55 (gjennomsnitt ± SE). De BNMN Verdiene viste en 4,6 ganger økning (31,35 ± 1,5) etter eksponering for 0,5 Gy av ioniserende stråling, med hensyn til de spontane nivåer. Disse forskjellene mellom den spontane og etter bestråling BNMN frekvens var, som ventet, statistisk signifikant (P 0,001). Dessuten, selv om den midlere spontane BNMN var høyere hos kvinner (7,19 ± 0,65) enn hos menn (5,51 ± 0,94) denne forskjell ikke oppnå statistisk signifikans (p = 0,339). På den annen side ble det ikke observert forskjeller mellom kvinner og menn etter bestråling (31,19 ± 1,70 og 31,01 ± 3,11, henholdsvis, P = 0,833).
De spontane BNMN verdier i undertype av pasienter med papillær skjoldbrusk kreft viste en svak, men ikke signifikant reduksjon i sammenligning med den follikulære subtype (6,64 ± 0,57 og 8,31 ± 1,82, henholdsvis, p = 0,559). Verdiene av BNMN etter bestråling heller ikke vist signifikante forskjeller mellom begge undertyper (31,71 ± 1,50 og 29,13 ± 5,53 henholdsvis, p = 0,553).
I figur 1 er det observert god korrelasjon som eksisterer mellom den spontane BNMN verdier og de som ble observert etter bestråling (R
2 = 0,28, P 0,001). Dette skulle tilsi en underliggende genetisk årsak.
Vi har også vurdert den cellulære proliferasjonsrate bruker cytokinese-blokkert spredning indeks (CBPI). Den CBPI verdien angir gjennomsnittlig antall cellesykluser per celle [18]. Resultatene (data ikke vist) indikerer en betydelig reduksjon av CBPI i kulturer som er utsatt for ioniserende stråling (P 0,001).
Forskjellene og deres 95% konfidensintervall ble beregnet ved lineær regresjonsanalyse bruke som en referanse homozygot genotype for den hyppigste allelet, med justering for alder, kjønn og diagnoser. Tabell 2 viser de forskjellene som ble observert på spontane BNMN verdier, i henhold til de forskjellige polymorfismer, tar hensyn til codominant modell av arv. For den spontane BNMN frekvens små forskjeller mellom genotyper ble funnet for alle de evaluerte polymorfismer. Interessant, i alle tilfeller BNMN verdiene var høyere i referanse genotyper (homozygote for det felles allelet), men disse forskjellene ikke oppnå statistiske betydninger.
haplotype analyse ble utført for de tre SNPs av WDR3 og resultatene er angitt i tabell 3. Tre haplotyper ble anslått å ha en frekvens 0,01. De andre haplotyper ble spådd å være for rart for menings statistisk analyse. Det ble ikke observert signifikante forskjeller for noen av de mest hyppige haplotyper med spontane BNMN verdier.
De midler for BNMN frekvensene var signifikant forskjellig av genotype blant de tre
WDR3
polymorfismer (tabell 4) . Vi har observert betydelig lavere midlere BNMN frekvenser i nærvær av den mindre allelet etter ioniserende stråling som tyder på en dominant modell av arv. For eksempel, den rs3754127 C /T-T /T genotyper viste en redusert BNMN frekvens sammenlignet med CC individer (se tabell 4). På samme måte, har vi også funnet en reduksjon i den strålingsinduserte skader ved haplotype ved kombinasjon av den mindre allelet av hver av de tre genotypede SNP’er [-4,9 (-9,16
til
-0,63), p = 0,026] (se . Tabell 5)
Når ble utført analysen stratifisering befolkningen av hvilken type svulst på diagnose (follikulær eller papillær), viste papillær gruppen verdier etter bestråling som ligner på de av den samlede befolkningen: rs3754127 [-8.39 (-14,45 til -2,33), P 0,01]; rs3765501 [-8,83 (-15,37 til -2,29), P 0,01]; rs4658973 [-8,36 (-14,46 til -2,27), P 0,01], alt for dominerende modellen. På den annen side, den effekt som observeres for den follikulære subtype etter bestråling var høyere enn i den papillære og i den samlede DTC pasienter; men forskjellene var ikke statistisk signifikant, trolig på grunn av lavt antall personer: rs3754127 [-27,78 (-55,54 til -0,02), P = 0,074]; rs3765501 [-28,67 (-62,46 til 5,12), P = 0,12]; rs4658973 [-29,10 (-60,26 til 2,06), P = 0,094], alt for dominerende modellen.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist en signifikant sammenheng mellom de tre utvalgte polymorfismer av
WDR3
genet og nivåer av DNA-skader etter en behandling med IR. Dette skulle tilsi en rolle WDR3 i vedlikehold av genomisk stabilitet.
WDR3
genet koder for et kjernefysisk protein inneholder 10 WD gjentar med ukjent funksjon [4] og medlemmer av denne store familie er strukturelt beslektet, men funksjonelt mangfoldig. Noen av de cellulære funksjoner eller veier som reguleres av medlemmer av denne familien omfatter genregulering, signaltransduksjon, RNA-prosessering og skjøting, lymfocytt homing, regulering av cellesyklusutvikling, celledeling /kromatin separasjon, og celle /vev differensiering, blant annet, som anmeldt [5], [6]. Men til nå er det ikke opplysninger som indikerer en mulig involvering med reparasjonsmekanismer eller innflytelse, i vedlikehold av genomisk stabilitet for
WDR3
, eller for et medlem av sin familie.
Sikter til finne en fornuftig forklaring på sammenhengen observert mellom
WDR3
polymorfismer og DTC forekomst, har vi allerede rapportert oppregulering av
WRD3
i ulike skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer, noe som tyder på det er mulig innblanding i skjoldbruskkjertelen kreft tumorigenesis [3]. Dette vil være enig med studier utført i bryst carcinoma-cellelinjen MCF-7 som viser at undertrykkelsen av
WDR3
redusere celleproliferasjon, redusere cellestørrelsen og redusere foci dannelse, noe som indikerer at
WDR3
ensidige vekst og proliferativ fordel på kreftceller [8]. Den WDR3 protein er omfordelt i kjernen når ribosomet biogenesis blir forstyrret. Cellular hendelser ser ut til å være påvirket av regulering av uttrykk for
WDR3
endre ribosom biogenesis [8]. Redusert forbigående endringer på nivåene av DNA-skade reparasjon proteiner (ikke-homologe end-bli med proteiner) har blitt observert i nucleolus etter ioniserende stråling; Derfor synes det mulig at disse endringene gjenspeiler en biologisk relevant svar på DNA dobbel tråd pause skade [19].
Våre funn tyder på en sammenheng mellom de mindre frekvens alleler for rs3754127, rs3765501, rs4658973 polymorfismer og lavere verdier av DNA-skade, etter behandling med ioniserende stråling. Selv om SNPs anvendt i vårt studium ikke frembringer forandringer av aminosyrer i proteinsekvens, er det kjent at ikke-kodende enkeltnukleotidpolymorfi kan endre genekspresjon [20]. Modifikasjoner nær promotersekvensen (rs3754127) kan forstyrre den riktige vekselvirkning med transkripsjonsfaktorer endrer fullstendig genekspresjonen eller påvirke nivået av ekspresjon [21]; Dette betyr at transkripsjonen av WDR3 kan avhenge av genetisk variasjon ved dens promoter-regionen. Selv om alternativ spleising, på grunn av tilstedeværelsen av SNP, sannsynligvis forekomme [22], [23], det må påpekes at alternative transkripter blir også indusert av ioniserende stråling [24]. Således kan polymorfismer ved rs3765501 og /eller rs4658973 også påvirke alternativ spleising, ikke bare på grunn av dens tilstedeværelse, men også av ytterligere eller forskjellige effekter med ioniserende stråling effekter. Alternativt kan noen av disse polymorfismer være ansvarlig for reduksjon av DNA skader etter IR, men de fungerer som genetiske markører for genetiske varianter av WDR3 direkte involvert i WDR3 genomisk stabilitet.
De observerte effekter, noe som indikerer involvering av
WDR3
i å opprettholde genomisk stabilitet etter eksponering for IR, vil være enige med foreningen funnet med DTC og med rollen tilskrives i ribosomet biogenesis. Dermed vil endringer i uttrykket av
WDR3
forstyrre signalveier som eksisterer mellom ribosom biogenesis og p53-aktivering [8]. Alle disse resultatene tyder til sammen en viktig rolle
WDR3
i å opprettholde stabilitet genom så vel som i karsinogenese og cellesyklusregulering. Interessant, foreløpige resultater med tykktarmskreftpasienter (V. Moreno, personlig kommunikasjon) synes å indikere en endret uttrykk for
WDR3
i tykktarmskreft, som støtter vårt syn, foreslår en rolle WDR3 i genomisk stabilitet og kreft. Våre data er interessant nok til å gjennomføre ytterligere studier i
WDR3
genuttrykk å bekrefte denne hypotesen.
Takk
Vi takker alle fag som deltar i denne undersøkelsen, samt til medlemmene av Nuclear Medicine Service, Hospital Vall dHebron (Barcelona) og Endokrinologi Enhet for sykehuset Josep Trueta (Girona) for å gi pasientblodprøver.
