Abstract
Sigarettrøyking er en etablert risikofaktor for esophageal kreft. Ja-assosiert protein 1 (YAP1), nøkkeltranskripsjonsfaktor fra pattedyr flodhesten reaksjonsveien, er blitt rapportert å være et onkogen faktor for mange kreftformer. I denne studien finner vi nikotin administrasjon kan indusere kjernefysisk translokasjon og aktivering av YAP1 i ESCC. Konsekvent, observerte vi nukleær translokasjon og aktivering av YAP1 ved knockdown av CHRNA3, som er en negativ regulator av nikotin signalisering i bronkial og esophageal kreftceller. Nikotin administrasjon eller CHRNA3 uttømming vesentlig økt spredning og migrasjon i esophageal kreftceller. Interessant, finner vi at YAP1 fysisk samhandler med nAChR, og nAChR-signale dissociates YAP1 fra sin negative regulatoriske kompleks sammensatt med α-catenin, β-catenin og 14-3-3 i cytoplasma, som fører til oppregulering og kjernefysisk translokasjon av YAP1. Denne prosessen krever sannsynligvis PKC-aktivering, som PKC spesifikk inhibitor Enzastaurin kan blokkere indusert nikotin YAP1 aktivering. I tillegg finner vi nikotin signale også hemmer interaksjonen av YAP1 med P63, noe som bidrar til den hemmende effekten av nikotin på apoptose. Ved hjelp av immunhistokjemi analyse vi observerte oppregulering av YAP1 i en vesentlig del av spiserørskreft prøver. Konsekvent, har vi funnet en signifikant sammenheng mellom YAP1 oppregulering og sigarettrøyking i de kliniske kreftfaren prøver. Sammen utgjør disse funnene tyder på at nikotin aktiverte nAChR-signalreaksjonsveien som ytterligere aktiverer YAP1 spiller en viktig rolle i utviklingen av spiserørskreft, og denne mekanismen kan være av en generell betydning for carcinogenesis av røyke relatert kreft.
Citation: Zhao Y, Zhou W, Xue L, Zhang W, Zhan Q (2014) Nikotin Aktiverer YAP1 gjennom nAChR mediert signale i Esophageal plateepitelkreft (ESCC). PLoS ONE 9 (3): e90836. doi: 10,1371 /journal.pone.0090836
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 9 januar 2014; Godkjent: 06.02.2014; Publisert: 12 mars 2014
Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien har vært støttet av midler fra 973 National Key Fundamental Research Program of China (2009CB521801) og Natural Science Foundation National of China (81021061). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sigarettrøyking er assosiert med økt risiko for både plateepitelkreft og adenokarsinom i spiserøret [1] – [3]. Nylige funn tyder nikotin og dets derivater slik som NNN (N-nitrosonornicotine) og NNK ((4-methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon) kan direkte aktivere nikotiniske acetylkolinreseptorer (nAChR) for å stimulere veksten og angiogenese og undertrykke medikamentinduserte apoptose av kreftceller [4]. Nikotin acetylkolin (nAChR) er en familie av ligand gate ionekanaler som fungerer som de store regulatorer av nikotin og acetylcholinergic signalering i cellene. a-nAChR-er og β-nAChR-er er de vanligste nAChR-er. Ubalanserte uttrykk for forskjellige undertyper av nAChR-er i cellene bidra til patogenesen av sykdommer så som kreft [4]. nAChR er også kjent for å regulere mobil adhesjon og migrasjon gjennom deres interaksjon med RapSyn og herparansulphate proteogly kan for eksempel agrin [5] -. [7]
Overuttrykte og økt kjernefysiske lokalisering av flodhest pathway transkripsjonsfaktor YAP1have blitt observert i flere typer kreft hos mennesker, inkludert leverkreft, tykktarmskreft, eggstokkreft, lungekreft og prostatakreft [8]. Og presiseringer av YAP1 genet locus er observert i intrakranielle ependymomas, muntlig plateepitelkarsinom og Medulloblastomas [8]. YAP1 ble rapportert å være kreft drivende genet i den humane hepatocellulær karsinom (HCC) og brystkreft 11q22 amplikonene [9], [10]. Videre YAP1 var fast bestemt på å være en uavhengig prognostisk markør for total overlevelse av leverkreft og esophageal plateepitelkarsinom [11], [12].
Dasgupta et al. rapportert nikotin kan indusere opp regulering av XIAP og Survivin (BIRC5) i ikke-småcellet lungekreft å hemme apoptose indusert av cellegifter [13]. Og nikotin er kjent for å indusere ekspresjon av CTGF (bindevev vekstfaktor) i gingivale fibroblaster og i periodontal ligament celler som bidrar til patogenesen av periodontal fibrose [14]. Spesielt Survivin og CTGF er to av de konserverte nedstrøms gener reguleres av transkripsjonsfaktor YAP1 av Hippo veien [8], [15]. Nylig, Yu et al. rapportert regulering av Hippo-YAP sti av G-protein-koblet reseptor signalisering [15]. Og β2-nAChR ble rapportert å være fysisk assosiert med G-protein, αG protein-regulerte induktor av neurite ut vekst 1, og G-protein-aktiverte K (+) kanal 1, som indikerer en mulig sammenheng mellom nAChR-signalering og cellulære G protein trasé [ ,,,0],16]. Videre YAP1 ble rapportert å være oppregulert ved esophageal kreft og bestemmes som et onkogen i spiserørskreft [11], [17]. Dermed har vi forsøkt å utforske mulig sammenheng mellom nikotin eksponering og YAP1 aktivering i kreftfaren i denne studien.
Metoder
vevsprøver
Våre ESCC vevsprøver fra 83 pasienter med patologisk T3 stadium esophageal plateepitelkarsinom ble samlet. Pasientene ble fortløpende rekruttert ved Chinese Academy of Medical Sciences Cancer Hospital (Beijing, Kina). Ved rekruttering, ble informert samtykke innhentes fra hvert fag. Samtykkene ble i skriftlig form, ble alle pasientene informert om å signere samtykke til å bruke sine vevsprøver ervervet fra kirurgi for vitenskapelig forskning før prøvene ble tatt. Vi bevart samtykke tabellen i vår medisinske data base, og etikkutvalg /IRB of Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Sciences godkjent samtykke prosedyre og studiet.
Cell Kultur og Transfeksjon and Drug Administration
Humant ESCC cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C under 5% CO2 og mettet fuktighet. Esophageal kreft cellelinjer KYSE510, KYSE30 ble gitt sjenerøst av Dr. Yutaka Shimada (Kyoto University). For de transiente transfeksjoner av plasmid og siRNA ble cellene dyrket på 60-mm plater i 50-90% konfluens og transfektert med 200 p mol av siRNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Tre Stealth sirnas rettet mot CHRNA3 ble designet og bestilt fra Invitrogen, ble TureClone plasmid av tGFP-CHRNA3 kjøpt fra OriGene. Cellene ble transfektert med tGFP-CHRNA3 plasmid eller CHRNA3 siRNA hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. Friskt medium ble tilsatt 6 timer etter transfeksjon. For nikotin administrering, ble cellene inkubert i medium inneholdende 80 nM av nikotin i 48 timer eller lenger. For Enzastaurin administrering ble Enzastaruin tilsatt til mediet i en konsentrasjon på 500 uM i 48 timer.
cellevekstkurve
Vekstkurve målt ved xCELLigence RTCA MP E-plate med 96 brønner, 3 x 10
3-celler ble tilsatt til hver brønn i henhold til protokollen til xCELLigence System, ble cellevekst overvåket i 81 timer. For cellevekstkurver som leses av MTT-analysen, 100 ul av cellekultur inneholdende 3 x 10
3-celler ble tilsatt til 30 brønner i en 96-brønns plate. 20 ul av methanethiosulfonate-reagens (Promega) ble tilsatt til 6 brønner hver gang etter 24 timer intervall i 5 dager, etterfulgt med 1 timers inkubering ved 37 ° C og 5% CO
2, absorbansen ble avlest ved 490 nm med en mikroplateleser.
Transwell migrasjon og invasjon analyser
Migrasjon og invasjon analyser ble utført med Corning 80 mikrometer 24-brønns transwell plate belagt med 30% Matrigel (300 ul /brønn, Falcon) . I alt 1 x 10
5-celler i 100 ul serumfritt medium ble tilsatt til det øvre kammer av anordningen, og det nedre kammer ble fylt med 600 ul av kulturmedium med 20% føtalt bovint serum. Etter 6 timers inkubering ved 37 ° C, ble de ikke-migrerende celler fjernes fra den øvre overflate av membranen med en bomullspinne. Filtrene ble deretter fiksert i metanol i 10 minutter og farget med Giemsa-løsning i 1 time, og telles. Fem tilfeldige mikroskopiske felt (× 100) ble talt opp per brønn, og gjennomsnittet ble bestemt.
Antistoffer og Spesial reagenser
Rabbit YAP1 antistoff, CHRNA3 antistoff ble kjøpt fra Proteintech gourp (Chicago, IL 60612, USA), mus YAP (63,7), ble GAPDH antistoff kjøpt fra Santa Cruz bioteknologi (Dallas, Texas 75220U.SA), Phospho-YAP (Ser127) antistoff og β-catenin antistoff, β-actin antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA 01923), ble CHRNB4 antistoff, CHRNA5 antistoff og 14-3-3 antistoff kjøpt fra Abgent. tGFP antistoff, P63 antistoff, tGFP merket CHRNA3 Tureclonevector ble kjøpt fra OriGene (Beijing, Kina 101 111), ble α-catenin antistoff kjøpt fra Life (Carlsbad, CA 92008). Rekombinant GST merket YAP1 protein ble kjøpt fra Abnova (Taipei City Taiwan114). PKC-hemmer Enzastaurin ble kjøpt fra Selleck Chemicals (München, Tyskland 81 829). Nikotin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO 63103).
immunfluorescens analysen
KYSE510 celler ble sådd på dekkglass i en seks-brønns plate i 24-48 timer, celler ble fiksert med metanol i 10 minutter ved romtemperatur og vasket med PBS. Etter inkubasjon med tilhørende antistoff i 1 time ved romtemperatur, ble platene vasket og incu1’bated med FITC-konjugert geite-anti-kanin-IgG. Etter å ha blitt vasket med PBS ble cellene farget med DAPI og undersøkt med en laser-scanning confocal mikroskop (Leica Micro Heiderg GmbH, Am Friedensplatz 3, Tyskland).
Kvantitativ Real Time PCR
Total RNA fra KYSE510 celler ble ekstrahert med TRIzol (Life-teknologi (Carlsbad, CA 92008)). Første-tråd cDNA ble syntetisert ved hjelp av Superscript II-revers transkriptase sett (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Real-time PCR (qPCR) ble utført ved bruk av SYBR Premiks Ex Taq (Takara) på en ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Alle prøver ble normalisert til GAPDH
genspesifikke PCR primerpar brukt i denne studien.
YAP1 (GGCGCTCTTCAACGCCGTCATGAAC /CCTGTCGGGAGTGGGATTT);
CTGF (CCAATGACAACGCCTCCTG /TGGTGCAGCCAGAAAGCTC) ;
Cyr61 (AGCCTCGCATCCTATACAACC /TTCTTTCACAAGGCGGCACTC);
EDN1 (TGTGTCTACTTCTGCCACCT /CCCTGAGTTCTTTTCCTGCTT);
PPP1ReB (GGACACGTTCTCCTTCGAC /AGATTTTAACTCAGCCCGGAT);
survivin (CCTGGCTCCTCTACTGTT /CTCTATTCTGTCTCCTCATCC);
GAPDH (GCTGAGAACGGGAAGCTTGT /GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT)
Western blot~~POS=TRUNC, Immunpresipitasjon, og GST Pull-down analyser
Western blot analyse ble utført som følger. Cellene ble oppsamlet og sentrifugert for høsting. Cellene ble lysedon is i 40 minutter i RIPA-buffer (10 mMTris, pH 7,4, 150 mMNaCl, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, og 5 mM EDTA) inneholdende Complete Protease Inhibitor Blanding (Sigma). Lysater ble klaret ved sentrifugering ved 12,000relative sentrifugalkraft i 20 minutter ved 4 ° C. For Western blotting, ble 40 ug av totalt protein suspendert i prøvebuffer. For immunoutfelling, ble lysater inkubert med primaryantibody etterfulgt av inkubasjon med protein A-agarose-kuler (Invitrogen). Immunkompleksene ble vasket og suspendedin prøvebuffer. I GST pull-down analysen ble glutation perler (Sigma) inkubert med Escherichia coli-uttrykt GST-YAP1or GST alene i 4 timer. Glutathionebeads ble deretter vasket og inkubert i 4 timer med lysater av KYSE510 celler. Etter vasking ble proteinkomplekser suspendert i prøvebuffer. Alt protein ble fylt i hver wellof en 15% SDS-PAGE. Geler ble overført til PVDF-membraner (Bio-Rad), blokkert med 5% melk /PBS, og inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer. Etter vasking og inkubering med sekundære antistoffer i 5% melk, ble membranen vasket, og de positive signaler ble utviklet med kjemiluminescens-reagens (Amersham). Membranen ble eksponert for medisinsk x-ray film (Fuji Ltd., Tokyo, Japan).
flowcytometrisk analyse
De vitale, apoptotiske og skadede celler ble separert ved flowcytometri. Den kvantitative bestemmelse av prosentandelen av celler som gjennomgår apoptose ble utført ved anvendelse av et annexin-V-FITC apoptose deteksjonssett (Cliniscience S.A.) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, 48 timer etter behandling med nikotin, 2 x 10
5-celler ble merket med fluorescens for påvisning av apoptotiske og nekrotiske celler ved tilsetning av 195 ul av annexin V bindingsbuffer og 5 ul av annexin V-FITC til hver prøve. Prøver ble forsiktig blandet og inkubert ved romtemperatur i mørke i 3 minutter, 10 ul av propidiumjodid (PI; Sigma) ble tilsatt til hver prøve og inkubert ved romtemperatur i 10 min. Før cytometri analyse, ble cellesuspensjonen tilsatt 300 ul av annexin V-bindingsbuffer. Et minimum på 10.000 celler i gated regionen ble kjøpt og analysert med Cell quest software.
Immunhistokjemisk farging og vurdering
Alle vevene ble fiksert i 4% nøytralisert formaldehyd, i parafin. Blokker av parafin-embedded donor vev ble samplet ved hjelp av en manuell Tissue Arrayer 1 instrument (Beecher Instruments, Silver Spring, MA, USA). To kjerner ble kuttet fra hver donor blokk for TMA blokker. Seksjoner (5 um) av vevet matrise blokken ble kuttet og plassert på polylysin-belagte glassplater og behandlet for IHC. Fra prøvene tilgjengelige, ble sju vev array-blokker forberedt som hver inneholder 30 tilfeller med tumor, normale og lymfeknute vev hvis tilgjengelig. Vevet microarray lysbilder ble deparaffinized i xylen og gradient etanol. Antigen gjenfinning ble utført ved å plassere objektglassene i en høy-trykkoker i en 0,01 mM citratbuffer, pH 6,0, i 2,5 minutter ved 100 ° C; de ble deretter avkjølt i 20 min. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved å inkubere seksjon i 3% H
2o
2 i 10 minutter, etterfulgt av skylling i PBS-løsning tre ganger. Snittene ble inkubert med kanin-anti-YAP1 antistoff (Proteintech) i en fortynning på 1:50 ved 4 ° C over natten, ble platene deretter inkubert i 1 time i sekundært antistoff. En EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) ble brukt til å visualisere antistoffbinding, og lysbilder ble senere kontra med hematoksylin. En PBS-bare flekker prøve ble brukt som bakgrunnskontroll. Vevet array-slides ble skannet og analysert med AperioScanScope CS. Basert på farging intensitet, ble esophageal vev delt inn i fire kategorier som YAP1 negativ (-), svak positivitet av YAP1 (+), median positivitet av YAP1 (+ +), sterk positivitet av YAP1 (+ + +). Alle forsøkene ble utført og gjentatt minst tre ganger. Data ble analysert med SPSS 11.5software. Korrelasjoner mellom undergrupper av flekker og sigarettrøyking ble beregnet ved bruk av Pearson χ2 test.
Resultater
Nikotin fremmer vekst og migrasjon av spiserørskreft
Nikotin er kjent for å være en viktig risikofaktor for esophageal kreft. De tidligere rapporter viser at nikotin fremmer cellevekst og migrasjon i ulike typer av kreft hos mennesker [4], [18]. Dermed først testet vi vekststimulerende effekten av nikotin i spiserørskreft KYSE510 cellelinje med xCELLigence RTCA MP E-plate med 96 brønner og observert at nikotin administrasjon vesentlig forbedret vekst på KYSE510 celler (figur 1 A). I tillegg gjennomførte vi transwell assay for å studere effekten av nikotin på migrering av KYSE510 celle og også observert en signifikant økning i migreringen av KYSE510 cellen behandlet med nikotin (figur 1 B).
A. Nikotin administrasjon stimulerer veksten av kreftfaren KYSE510 celle målt ved E-Plateofx CELLigence RTCA MP system. B. Nikotin administrasjon økt invasjonen og migrasjon av esophageal kreft KYSE30 celler i Transwell analyser. C. subcellulære lokalisering av YAP1 undersøkt med confocal fluorescens mikroskop. Translokasjon av YAP1 (grønn) fra cytoplasma til kjernen ble observert etter administrering nikotin i KYSE510-celler i 48 timer. D. KYSE510 celler ble behandlet med nikotin til 48 t, redusert fosforylering av YAP1 og økt defosforylert YAP1 ble observert ved Western blot-analyse. E. Real-time PCR verifikasjon av induksjon av mRNA av gener transcriptionally aktiveres ved YAP1 på nikotin administrasjon. F. PKC-hemmer Enzastaurin blokkert nikotin indusert upregualtion av YAP1 protein nivå, og resulterte i reduksjon av YAP protein nivå, spesielt defosforylert form av YAP1 av Western blot.
Nikotin induserer YAP1 kjernefysisk translokasjon og aktivering
Up regulering og økt kjernefysiske lokalisering av Hippo pathway transkripsjonsfaktor YAP1 ble rapportert å være den uavhengige markør for dårligere overlevelse av spiserørskreft [11]. For å vurdere om nikotin eksponering ville resultert i aktivering av YAP1. Vi undersøkte subcellulære lokalisering av YAP1 i spiserørskreft KYSE510 cellen ved hjelp av konfokal immunfluorescens mikroskop etter eksponering for nikotin. Etter at cellene ble dyrket i media inneholdende nikotin ved en konsentrasjon på 80 nM i 48 timer, ble det observert en øket kjernetranslokasjon av YAP1, som manifestert ved YAP1 opphopning i kjernen etter at celler behandlet med nikotin (figur 1C). Siden nukleær translokasjon og aktivering av YAP1 er regulert ved fosforylering av YAP1 på S127 side [8], vi deretter målt endringer av fosforylering nivå av YAP1 før og etter behandling nikotin. Som vist i figur 1 D, redusert fosforylering av YAP1 og økt proteinnivå defosforylert YAP1 ble observert etter administrering nikotin. Vi videre undersøkt mRNA uttrykk for CTGF, en YAP1 målrettet nedstrøms genet, og fant at mRNA nivåer av CTGF ble løftet av nikotin administrasjon. Men vi ikke observere betydelig oppregulering av YAP1 mRNA etter nikotin administrasjon (figur 1 E). Disse resultatene antyder at nikotin etter administrering, YAP1 gjennomgår nukleær translokasjon og i sin tur aktiviserer transkripsjonelt nedstrømsgener inkludert CTGF.
PKC har blitt rapportert å være nødvendig for aktivering nAChR ved å danne en auto-positiv tilbakekoplingssløyfe for aktivering av nikotiniske acetylcholin-reseptorer [19], [20]. Det har også blitt identifisert som et YAP1 kinase [21]. Således vi behandlede cellene med PKC-spesifikk hemmer Enzastaurin for å se om YAP1 aktivering kan bli blokkert av PKC-inhibering. Vi har observert at Enzastaurin behandling i det vesentlige blokkert YAP1 aktivering indusert av nikotin som antydet med en dramatisk reduksjon av den totale proteinnivå YAP1, spesielt defosforylert YAP1 (figur 1 F). Dette resultat antyder at aktiveringen av YAP1 indusert av nikotin er mediert gjennom PKC.
knockdown av CHRNA3 også indusert YAP1 aktivering
Det har vist seg at CHRNA5 (neuronal acetylcholin reseptor-underenheten a-5) og CHRNA3 (neuronal acetylkolin reseptor subenhet alpha-3) som negative regulatorer av nikotin signale i bronkial kreft og esophageal kreftceller [22]. På grunn av knockdown CHRNA3 og CHRNA5 økt proliferasjon, migrering og kalsiuminnstrømningen av lungekreft cellelinjer, som et resultat av kompenserende økning montering av α7-nAChR på cytoplasma membranen som hadde høyere permeabilitet overfor kalsium i respons til nikotin. Dermed har vi anvendt siRNA tilnærminger til knockdown CHRNA3 i KSYE-510 celle og deretter undersøkt effekten av CHRNA3 uttømming på veksten og migrering av KYSE510 celler, og på aktivering av YAP1 også. Vi observerte en økning på vekst og migrasjon i KYSE510 celler ved CHRNA3 knockdown, noe som ligner på det man ser i nikotin administrasjon (figur 2 A, Figur 2 B). Konsekvent ble en nedgang på YAP1 fosforylering, spesielt på S127 stedet YAP1 vist av western blot (figur 2 C). Med confocal immunfluorescens mikroskop vi også observert kjernefysisk translokasjon av YAP1 i KYSE510 cellene følgende CHRNA3 knockdown (figur 2 D). I tillegg ble den transkripsjonelle induksjon av CTGF og andre YAP1 nedstrømsgener også observert i cellene dempede for CHRNA3 (figur 2 E).
A. Cellevekst kurve målt med MTT-analyse indikerte siRNA mediert knockdown av CHRNA3 økt vekst på KYSE510 celler. B. Transwell analysen indikerte at knockdown av CHRNA3 økt invasjonen og migrasjon av KYSE30 celler. C. Western blot analyse indikerte tre Stealth siRNA konstruerer effektivt slått ned CHRNA3. Nedbryting av CHRNA3 førte til en nedgang på fosforylert YAP1 og en økt av defosforylert YAP1, særlig en redusert S127 fosforylering av YAP1. D. Observasjon av YAP1 subcellulære lokalisering med confocal fluorescens mikroskopi etter uttømming av CHRNA3. Translokasjon av YAP1 (grønn) fra cytoplasma til kjernen ble observert etter siRNA mediert knockdown av CHRNA3 i KYSE510-celler i 48 timer. E. Real-time PCR test indikerte YAP1 målrettede gener ble indusert av CHRNA3 knockdown i KYSE510 celle.
Fysiske interaksjoner mellom nAChR og YAP1
For ytterligere å undersøke regulerende rolle nAChR med YAP1, gjennomførte vi immunoutfellingsstudier eksperimenter for å undersøke om nAChR fysisk samhandle med YAP1. Som vist i figur 3 A, ble de klare interaksjoner mellom YAP1 og CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 identifisert. Samspillet mellom YAP1 og CHRNA3 ble bekreftet med eksogent tilført tGFP-merket CHRNA3 i KYSE510 celler (figur 3 B). I tillegg gjennomførte vi GST trekke ned analyse for å ytterligere bekrefte samspillet mellom YAP1 og CHRNA3 med eksogent uttrykt GST-merket YAP1 (Abnova). GST-trekk ned Forsøket viste også med positiv samhandling mellom endogen CHRNA3 og GST-YAP1 (figur 3 C). Deretter brukte vi konfokal immunfluorescens mikroskop for å undersøke colocalization mellom CHRNA3 og YAP1. Vi har funnet at både CHRNA3 og YAP1 ble colocalized ved membranområdet og i cytoplasma av KYSE510 celler (figur 3 D). Sammen er disse observasjonene tyder nAChR fysisk forbinder med YAP1 i esophageal kreftceller. 14-3-3 er bindende partner av YAP1 i cytoplasma, vi også observert positive interaksjoner mellom 14-3-3 og CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 med immunoprecipitation analysen i KYSE510 celle (figur 3 E).
EN. Endogen IP test viste positive protein interaksjoner mellom YAP1 og CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5 i KYSE510 celler. B. Positiv samhandling mellom tGFP-CHRNA3 og YAP1 ble påvist i cellene transfektert med tGFP-CHRNA3. C. GST Trekk analysen indikerte positive samspillet av eksogent uttrykt GST-YAP1 med CHRNA3 i KYSE510 celle. D. Confocal immunfluorescens mikros observert colocalization av YAP1 og CHRNA3 i KYSE510 celle. De KYSE510 celler ble transient uttrykt tGFP merket CHRNA3 av TureClone vektor (OriGene). YAP1 ble merket med rødt-FITC-konjugert geite-antikanin IgG. Cellekjerner ble visualisert med DAPI. E. endogene IP oppdaget positive interaksjoner mellom 14-3-3 og CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5.
Dissosiasjon av de negative regulatorer av YAP1 av nikotin behandling
transkripsjonen aktivitet og protein nivå YAP1 er kjent for å være negativt reguleres av 14-3-3, α-catenin og β-catenin [8], [23], [24]. Fosforylert YAP1 kan binde med p63, og en slik forening øker stabiliteten av p63 og bidrar til p63-mediert medikament-indusert apoptose [21]. Dermed har vi forsøkt å undersøke effekten av nikotin på interaksjoner av YAP1 med α-catenin, β-catenin, 14-3-3, og p63. Som vist i figur 4, ble interaksjonene mellom YAP1 med α-catenin, β-catenin, 14-3-3, og p63 avbrutt av nikotin administrering (figur 4 A), som er i overensstemmelse med våre observasjoner at nikotin behandling økte atom trans og aktivering av YAP1. Redusert interaksjon mellom YAP1 med 14-3-3, α-catenin, ville β-catenin resultere i en økning av den totale proteinnivå YAP1. Konsekvent, har vi sett en betydelig økning av YAP1 proteinnivå etter forlenget nikotin behandling (figur 4 B). Som p63 er en viktig regulator av apoptose, og endret interaksjonen mellom YAP1 og p63 ville svekke de apoptotiske responser mediert av p63. Konsekvent, observerte vi redusert apoptose av KYSE510 celler behandlet med nikotin (figur 5).
B. KYSE510 celler eksponert for nikotin i mer enn 4 dager førte til oppregulering av total protein nivå av YAP1, inkludert både fosforylert YAP1 og dephosphorylated YAP1 indikert av western blot analyse.
Nikotin behandling redusert den overordnede av apoptotiske celler i nedre høyre kvadrant.
Immunohistochemistry analyse av YAP1 i kliniske prøver
det er vist at esophageal kreftpasienter med oppregulering av YAP1 hadde et dårligere total overlevelse enn de med normal ekspresjon av YAP1 [11]. Dermed har vi brukt kliniske kreftfaren prøver for å undersøke sammenhengen mellom oppregulert uttrykk for YAP1 og sigarettrøyking. Vi samles spiserørskreft prøver fra 83 pasienter på T3 scenen, inkludert 29 ikke-røykere og 54 røykere. Vi har utført immunhistokjemi eksperiment for å analysere uttrykk nivået YAP1 i esophageal kreftprøver, og fant at kreftpasienter med røyking historie viste høy uttrykk for YAP1 sammenlignet med ikke-røykere pasienter (
P
0,05) (figur 6 og tabell 1). Dermed disse Finne gå sammen med våre observasjoner at YAP1 ble aktivert av nikotin administrasjon in vitro. Vi har imidlertid ikke observere en betydelig forskjell i den generelle overlevelse mellom YAP1 høye og YAP1 lave grupper, sannsynligvis på grunn av disse kreft prøvene var fra T3 stadium esophageal kreftpasienter.
Glassene ble skannet av AperioScanScope CS. Vevsprøver ble delt inn i 4 kategorier basert på intensiteten av YAP1 farging.
Diskusjoner
Nikotin er et etablert onkogen faktor som bidrar til patogenesen av mange kreftformer, inkludert esophageal kreft [3], [4]. Og nikotin er kjent for å fremme proliferasjon av kreftceller ved aktivering av katekolaminer signalkaskade [4], [25], [26]. Konsekvent vi observert en økt vekstrate for esophageal kreftceller ved nikotin behandling eller gjennom knockdown av CHRNA3. Flere grupper har rapportert at nikotin eksponering og sigarettrøyking kan fremme anskaffelse av kreft stamcelle ut og epitelial-mesenchymale overgang i kreft i munnhulen, hode og nakke plateepitelkarsinom, lungekreft og brystkreft [27] – [30]. Interessant, Nallet-Staubet al. har vist at YAP1 og TAZ bidra til invasive og metastatisk kapasitet på melanomceller [31]. Og Chen et al. rapportert YAP1 som en viktig formidler av TLR4 /Nanog onkogene vei i å opprettholde tumor-initiere stamceller lignende celler (tics) befolkningen ved undertrykkelse av cytostatisk TGF-β signalering i HCC [32]. Disse observasjoner er i overensstemmelse med den observasjon at tidlig YAP1 homolog TAZ er nødvendig for å opprettholde selvfornyelse og tumor-initiering kapasiteter i brystkreft stamceller [33]. I denne studien har vi vist at nikotin administrasjon eller CHRNA3 uttømming fører til en økning av cellevekst og migrasjon, og induserer resistens mot apoptose i esophageal kreftceller.
G-protein koblede reseptorer (GPCR) kan aktivere eller hemme Hippo-YAP vei avhengig av kombinert G-proteiner. Og lysofosfatidisk syre (LPA) og sfingosin-1-fosfat (S1P) ble rapportert å være oppstrøms agonister i denne signalveien for å aktivere YAP1 /TAZ gjennom regulering lats kinase aktivitet ved å modulere aktin cytoskjelett dynamikk [15]. GPCRs kan aktivere kalsium signalkaskade gjennom PLC /IP3R /PKC vei [34]. Og kalsiumsignalering er kjent for å regulere aktin dynamikk og cellemotilitet gjennom modulering av nedstrøms Rho GTPase signalveier [34], [35]. Dermed nikotin kan aktivere YAP1 gjennom nAChR mediert kalsium tilstrømningen. Interessant, observerte vi PKC spesifikk hemmer Enzastaurin var i stand til å blokkere aktiveringen av YAP1 av nikotin administrasjon, som er konsistent med PKC rolle i potenkalsiumkanaler for å øke kalsium tilstrømningen [36].
I denne studien har vi bestemt samspillet mellom nAChR og YAP1, indikerer nAChR mediert signalering kan ha en direkte effekt på YAP1 aktivering, som er videre støttet av observasjoner som CHRNA3 co-lokaliserer med YAP1. Videre har vi observert endret fysiske sammenhenger mellom YAP1 og α-catenin /β-catenin /14-3-3 ved aktivering av YAP1 av nikotin administrasjon i esophageal kreftcelle. Det har tidligere blitt rapportert α-catenin og β-catenin fysisk samvirke med YAP1 til negativt regulert YAP1 aktivitet og dens degradering [23], [24]. Sammenhengen mellom YAP1 og α-catenin medieres av 14-3-3 og det IQGAP1 er en av høy tillit bindingspartnere av YAP1 [23]. Interessant, 14-3-3 kommuniserer med nAChR-er og tjoringene nAChR-er i spesifikke membrandomener gjennom en interaksjon med et multi-subenhet kompleks, som består APC, EB1, IQGAP1 og MACF, som er forankret til den mikrotubul cytoskjelettet [37]. 14-3-3 fremmer også den fremre transport av N-cadherin /p-catenin komplekser fra ER [38]. I tillegg samhandler β-catenin med RapSyn å regulere gruppering av nAChR i muskelceller [39]. I denne studien ble det observert positive interaksjoner mellom 14-3-3 og CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 i KYSE510 celle. Disse funnene tyder på nAChR-er, 14-3-3, IQGAP1, α-catenin og β-catenin kan danne et cytoskjelett forankret negativ regulering kompleks med YAP1, og 14-3-3 tjener som felles binding adapter av komplekset. Dette komplekset regulerer negativt YAP1 aktivering og kjernefysisk translokasjon og tjore YAP1 til cytoskjelettet i cytoplasma. Således nAChR regulere aktiveringen av YAP1 ved dissosiering av komplekset som reaksjon på oppstrømssignaler.
Interessant vi også observert en redusert P63 assosiasjon med YAP1 av nikotin administrering, som fremmer nedbrytning p63 og hemme apoptose.
