Abstract
Bakgrunn
Int-6 plakater (integrering side 6) ble identifisert som et onkogen i en skjerm av tumorigent mus brystsvulstvirus (MMTV) innsettinger.
INT6
uttrykket er endret på kreft hos mennesker, men den nøyaktige rollen som forstyrret
INT6
i tumorigenesis er fortsatt uklart, og en dyremodell for å studere
Int-6
fysiologisk funksjon har vært mangelfull.
hovedfunnene
Her skaper vi en
in vivo
modell av Int6 funksjon i sebrafisk, og gjennom genetiske og kjemiske-genetiske tilnærminger implisere Int6 som en vev -spesifikk modulator av MEK-ERK signalering. Vi finner at Int6 er nødvendig for normal ekspresjon av MEK1 protein i humane celler, og for signalering i Erk sebrafisk embryoer. Tap av enten Int6 eller Mek signale forårsaker defekter i kraniofaciale utvikling, og Int6 og Erk-signale har overlappende domener av vev uttrykk.
Betydningen
Våre resultater gir ny innsikt i fysiologiske rollen til virveldyr Int6, og har implikasjoner for behandlingen av humane tumorer Viser endret
INT6
uttrykk
Citation. Grzmil M, Whiting D, Maule J, Anastasaki C, Amatruda JF, Kelsh RN, et al . (2007)
INT6
Cancer Gene og MEK signalveier Converge under Sebrafisk Development. PLoS ONE 2 (9): e959. doi: 10,1371 /journal.pone.0000959
Academic Redaktør: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 03.08.2007; Godkjent: 02.09.2007; Publisert: 26.09.2007
Copyright: © 2007 Grzmil et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av en MRC tilskudd til EEP, og med tilskudd fra CRUK og AICR til CJN. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i utformingen eller gjennomføringen av studien, i innsamling, analyse, eller tolkning av data, eller i forberedelse, vurdering, eller godkjenning av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Embryonic utvikling og tumor utvikling ofte dele underliggende molekylære mekanismene-et konsept illustrert ved identifisering av gener avbrutt av musebrysttumorvirus (MMTV) i mammary kreft [1]. Et viktig eksempel er
Int-en
genet som er en felles integrasjonssete for MMTV i brystsvulster, koder homolog av
Drosophila vingeløse
genet [2], [3] og var senere navnet
Wnt1 plakater (vingeløse /Int) i erkjennelse av dette bevart funksjon. Wnt signalering er nå kjent til å være forstyrret i mange humane krefttyper, spesielt kreft i tykktarmen [4]. Andre
Int
gener, for eksempel
Int-2 Hotell og
4 plakater (Fgf3, 4), og
Int-3 plakater (Notch4), kode mitogener og regulering av utvikling som også misactivated i mange kreftformer [1], [5].
i de fleste tilfeller, aktiverer MMTV
Int
genuttrykk som følge av førvirus integrering oppstrøms av den promoter-regionen. Bemerkelsesverdig, alle tre MMTV innsetninger som finnes i
Int-6
, som koder for en komponent av den eukaryote oversettelses initieringssammenkoblingsfasen faktor 3 (eIF3), ble funnet å ligge innenfor introner, og i motsatt transkripsjons-orientering i forhold til
Int-6
genet, og skaper en avkortet
Int-6
mRNA [1], [6]. Ektopisk uttrykk for ekvivalent avkortet
Int-6
kan forvandle cellekulturer [7], [8], og fremme vedvarende bryst alveolar hyperplasi og tumorigenesis i transgene mus [9].
Til tross for viktige bevis i favør av en rolle for INT6 i human tumorgenesen [10] – [12], det molekylære grunnlaget for INT6 i kreftutvikling forblir uløst. Svært konservert i eukaryoter, inneholder INT6 en PCI-domene, som finnes i proteiner av 19S regulatoriske lokket til proteosomet, den COP9 signalosome (CSN), og den eIF3 translasjons-initierings-kompleks; alle tre komplekser dele totale strukturelle likhet, og INT6 er funnet forbundet med hverandre [13]. Når overuttrykt i gjær, Int6 induserer multimedikamentresistens ved å aktivere et AP-1-transkripsjonsfaktor [14], [15], og i humane celler, utvalget av INT6-funksjonen omfatter ordnet progresjon gjennom mitose [16], regulering av proteosomet -avhengig stabilitet MCM7 [17] og HIF2α [18], og tull mediert mRNA råte [19].
med ingen dyremodell for Int6 tap-av-funksjon tilgjengelig, vi tenkte at en forståelse av
INT6
under utvikling ville tilveiebringe ny innsikt i INT6 funksjon i normale virveldyrceller, for derved å tilveiebringe et nytt perspektiv på INT6 funksjon i kreft formasjon. Her, ved hjelp av sebrafisk og pattedyrceller, beskriver vi først Int6 tap-av-funksjon fenotype i et dyr, og knytte Int6 med en signalveien, som liker den virksomhet som utøves av andre
Int
gener, er avgjørende for både utvikling og kreft.
Resultater
Int6 er avgjørende for sebrafisk embryogenese
Vi valgte å studere fysiologiske rollen til sebrafisk Int6 under utvikling, ved hjelp morfolino oligonukleotider (MOS) for å redusere int6 protein, samt en
int6
hi2470
insertional mutant linje (vennlig levert av N. Hopkins, A. Amsterdam og MIT S. Farrington.). Sebrafisk Int6 er over 90% identisk i sin aminosyresekvens til human INT6 (
Ensembl
ENSDARG00000002549) og ved hjelp av en Int6 antistoff reist mot N-terminalen av den menneskelige INT6 [20] vi fastslått at
int6
MO resulterte i tap av Int6 (figur 1A). Som INT6 har vært innblandet i G2 /M-fase cellesykluskontroll, må vi først fullført hele montering immunhistokjemi med sen G2 /M fase markør, fosfor-histon H3, og fant bare litt redusert antall celler i slutten av G2 /M fase i
int6
morphant sammenlignet med kontrollgruppen (figur S1). Viktigere, fant vi at embryoer injisert med
int6
MO hadde spesifikke utviklingsforstyrrelser (Figur 1B-N), særlig redusert melanisation 2 dager etter befruktning (DPF:
int-6
MO n = 51/53, con MO n = 0/35;
int-6 5MM
n = 3/31); forlagt pigmentceller i halen tre DPF (
int-6
MO n = 46/49, con MO n = 3/30); og unormal kjeve morphogenesis, med brusk elementer redusert eller feil på 4 og 5 dpf (
int-6
MO n = 81/85 4 dpf, n = 76/83 5 dpf, con MO 1/67 4 dpf , n = 1/61 5 dpf). De kraniofaciale og pigmentcelleskader observert i
int-6
morphant og
hi2470
mutant tyder på at
int-6
kan bidra til utvikling av neural crest-celle (NCC ) derivater. Vi brukte flere markører for NCCer og deres derivater for å vurdere når disse fenotyper oppstår, og fant Int6 så ikke ut til å være nødvendig for spesifikasjon eller organisasjon premigratory og trekkende brusk forløpere (Figur S2). I kontrast, Alcian blå brusk farging avslørte et bestemt tap av de fem ceratobranchial brusk elementer i
int6
morphants, mens Meckels, palatoquadrate, og hyoid brusk var alle til stede, om enn bulkete (5,5 dpf
int6
MO n = 45/53, con MO n = 1/34 Figur 1I-L, Figur S3). Uttrykk for
int6
mRNA restaurert normale kraniofaciale elementer til
int6
morphant (
data ikke vist
); og
int6
hi2470
mutant hadde en nesten identisk craniofacial fenotype (figur 1 M, N) som indikerer en ekte krav for Int6 i kraniofaciale utvikling.
(A) Western blot analyse av Int6 (*) i sebrafisk embryoer injisert med en kontroll (con) MO eller
int6
MO. (B)
int6
morphant melanocytter er mindre mørkt pigmentert. (C-F) Int6 er nødvendig for pigment celle plassering i halen, som
int6
morphants og
int6
hi2470
mutanter har forlagt pigmentceller i halefinnen (D, pil ). Ambient lys lyser opp iridophore «star-light» mønster sett i
int6
hi2470
embryoer (F, pil). (G-H) Ved 5 dpf, embryoer injisert med en con MO har klart synlige certobranical buer, mens
int6
morphants ikke ha synlige certobranical buer, i tillegg til andre abnormiteter, inkludert unconsumed plommesekken, hjerte og øye utvikling. (I). Alcian blå farging av 5 DPF embryoer viser et tap på ceratobrancial buer 1 til 5. M, Meckels; PQ, palatoquadrate; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial.
Tap av Int6 endrer MEK protein og Erk signale
Biokjemisk bevis i fisjon gjær antyder at Int6 er en del av et spesialisert eIF3 oversettelse initiering kompleks som kan målrette bestemte mRNA for oversettelse [21]. Gitt involvering av INT6 i celleproliferasjon [16], Western blot ved hjelp av et panel av antistoffer mot proteiner involvert i cellesyklusen og tilhørende signalbaner som ble utført ved anvendelse av lysater fra kontroll og INT6 siRNA transfektert MDA-MB-231-celler. Av 16 proteiner som er undersøkt på denne måte, ble bare MEK1 nivåer forandres ved INT6 siRNA transfeksjon (figur 2). Som tidligere rapportert [20], har vi funnet
INT6
-siRNA cellelysater hadde reduserte nivåer av INT6 protein sammenlignet med utransfekterte og omvendt
INT6
-siRNA sekvens. Vi fant også en dramatisk reduksjon av MEK1 protein nivåer som korrelerte med tap av INT6, mens BAX, tubulin og aktin protein nivåer dukket upåvirket i
INT6
-siRNA transfekterte celler (figur 2A). Tapet av MEK1 var spesifikt på proteinnivået, som semi-kvantitativ PCR-viste normale nivåer av
MEK1
mRNA i
INT6
-siRNA behandlede celler, så vel som de forventede reduserte nivåer av den INT6 meldingen i
INT6
-siRNA transfekterte celler (figur 2B). Muligheten for at
INT6
kan påvirke MAPK signaliserer gjennom kontroll av MEK protein nivåer bedt oss om å undersøke fosforylering tilstand av ERK1 /2, nedstrøms målene for Mek kinaser, i
int6
morphant sebrafisk embryoer . Sammenlignet med kontroll MO embryoer,
int6
morphant embryo lysatene hadde redusert fosfor-ERK nivåer (Figur 2C). Disse data tyder på en ny funksjon for Int6 ved regulering av MAPK signalering i utvikling av embryo, eventuelt ved direkte kontroll av MEK1 proteinnivåer.
A. Osteosarkom U2-OS celler utransfekterte (U), eller transfektert med siRNA rettet mot
INT6
mRNA (SI) eller omvendt rekkefølge (R), viser reduserte nivåer av INT6 og MEK1 protein spesifikt etter transfeksjon med
INT6-
siRNA, men ingen reduksjon i BAX, tubulin eller aktin protein nivåer. (B) Semi-kvantitativ-PCR viser
MEK1
mRNA er upåvirket i omvendt rekkefølge og
INT6
-siRNA behandlede celler, kombinert med den forventede reduserte nivåer av
INT6
budskap i
INT6
-siRNA transfekterte celler. c, PCR kontroll uten DNA. (C) Phospho-ERK nivåene er redusert i
int6
morphants, mens ponceau flekken oppdager lik belastning av protein på gelen.
Int6 og Mek veier møtes under utvikling
Hvis Int6 styrer Mek aktivitet i utvikling av embryo, antar vi at spesifikke utviklings vev kan ha overlappende uttrykk domener av Int6 protein og fosfor-Erk aktivitet. Faktisk, immunhistokjemi med antistoffer rettet mot Int6 og fosfor-Erk avslørte overlappende domener av uttrykk i utviklings kraniofaciale regionen i tre og fire DPF embryoer (figur 3A-F). Sterk Int6 vev-spesifikk ekspresjon ble også påvist i den tredje tarmen og linse, områder som har hatt liten eller ingen fosfo-Erk uttrykket (fig S4). Gitt den observerte fosfo-Erk og Int6 ekspresjon i craniofacial regionen, hypotese vi at noen av Int6 fenotyper, slik som kjeven formasjonen defekt, kan bli phenocopied ved undertrykkelse av Erk signalering. Som tolkning av MO fenotyper har nylig blitt komplisert ved identifisering av MO-indusert p53-avhengig kraniofaciale defekter [22], brukte vi en alternativ tilnærming – den svært selektive, klinisk aktiv MEK inhibitor CI-1040 [23] – for å redusere Mek signale i sebrafisk. Vi tilsatte stoffet ved 4 HPF i en konsentrasjon på 0,25, 0,5 og 1,0 pM, og bekreftet tap av fosfo-Erk-ekspresjon ved Western blot-analyse (
data ikke vist
). Spesielt tilsetningen av CI-1040 forårsaket en doseavhengig tap av de bakre strukturer av embryoet, slik at 1.0 uM CI-1040 forårsaket en alvorlig anterior-posterior (AP) akse defekt (Figur 4A-C), i samsvar med en rolle for FGF signalisering i utviklingen av AP-aksen [24]. CI-1040 også forårsaket tap av ceratobranchial brusk elementer, mens de fremre elementer – Meckels, palatoquadrate og hyoid cartilages – var til stede, men bulkete (figur 3G-J), lik effektene sett i
int6
morphants og mutanter .
(A-F). Immuno-histokjemi av Int6 og fosfor-Erk i utviklings kraniofaciale vev, teller farget med hematoksylin og fosfor-histon H3 vise sykkel celler. (G, H) Ventralt hele montere utsikt over Alcian blå farget svelget brusk viser tap av ceratobrancial buer 1-5 og en reduksjon av Meckels (M), palatoquadrate (PQ) og ceratohyal (CH) brusk i fire dpf embryoer som ble behandlet med 0,5 um CI-1040. (I, J) Deler av 4 DPF embryoer hematoxylin og eosin farget etter 0,5 uM CI-1040 behandling avslører tap av CB buer 1-5 (parentes). E, Ethmoid plate; PC, Parachordal brusk.
For ytterligere å belyse biologiske relevansen av Int6 og Mek signalering, vi tok fordel av den enkle som signalveier kan endres farmakologisk i spesifikke genetiske sammenhenger i sebrafisk system. Vi tenkte at hvis Int6 bidrar til aktivering av Mek signalering, embryoer da med redusert Int6 bør være overfølsom for lave doser av MEK inhibitor CI-1040. I kontroll embryoer behandlet med 0,25 mikrometer CI-1040 ble ingen endringer i anterior-posterior aksen oppdaget (figur 4B). I tillegg
int6
morphants generert av lave doser av MO (0,25 ng) ikke har en endret AP aksen (Figur 4D). I motsetning til dette, i kombinasjon med lave doser av CI-1040, den lave dosen
int6
morphant viste en sterkt forbedret AP akse fenotype (figur 4E). Samlet utgjør disse dataene gir ytterligere bevis på at
int6
kan spille en rolle i moduler MEK signaliserer
in vivo
.
(A-C). Bare embryoer behandlet med 1,0 mikrometer CI-1040, og ikke 0,25 mikrometer, viser et underskudd på bakre strukturer, i motsetning til (D)
int6
morphants (
int6
MO 0,25 ng). (E, F) I kombinasjon med 0,25 mikrometer av CI-1040, 0,25 mikrogram av
int6
MO fører til en dramatisk endring av anterior-posterior aksen.
Diskusjoner
Aktivert i de fleste kreftformer, er det MAPK signalveien blant de mest attraktive mål for nye anti-kreft terapi [23]. Som MAPK signalveier, mesteparten av
Int
trasé – Wnt, FGF, og Notch – er bevart regulatorer av utviklingen som aktiveres ofte for å fremme onkogenese. Vi gir bevis for at, som andre
Int
genprodukter,
Int6
er nødvendig for virveldyr utvikling (figur 1), blant annet ved å tilby en ny lag av MAPK signaloverføring regulering (figur 2) . Med det brede utvalget av cellulære aktiviteter tilskrives INT6, forblir mekanistiske detalj av denne kontrollen for å bli forstått; våre tidlige undersøkelser indikerer reduksjon av MEK1 i
INT6
-siRNA behandlet pattedyrceller er ikke avhengig av proteasome (MG CJN,
upubliserte data
), noe som gjør direkte MEK1 regulering av INT6 avhengig oversettelse en mulighet.
Nylig, viktigheten av RAS, RAF og MEK i menneskelig sykdom har blitt utvidet utover kreft ved oppdagelsen at menneskespirer linjer mutasjoner i disse genene føre til at LEOPARD-Noonan familie av syndromer [25] . Detaljerte immunhistokjemiske studier på mus har identifisert sterkt regulert, spesifikke domener av diskret og dynamisk ERK-fosforylering gjennom utvikling, inkludert svelg buer og lem knopper [26]. I de første Int6 protein ekspresjonsstudier i en hel utvikle dyr, viser vi at Int6 har regionalt overlappende domener av proteinekspresjon med fosfo-Erk, primært i kraniofaciale regionen (figur 3, Figur S4). Utlån biologisk betydning for disse observasjonene viser vi at fenotypiske karakteristika deles av tap av Int6 og inhibering av Mek-aktivitet (figur 3). I tillegg er delvis tap av Int6 fører embryoer for å være svært følsom for et mildt kompromiss dose av Mek inhibering, og viser en
in vivo
interaksjonen mellom Int6 proteinekspresjon og utviklings Mek-Erk signalering (figur 4). Allerede over-uttrykk for Ras-Raf-Mek signale forårsaker morfologiske feil, vi er for tiden genererer transgene linjer som tillater tidsmessig kontroll av Mek signalering, som vil være et verdifullt verktøy for dypere genetisk disseksjon av Int6-Mek-Erk forhold
in vivo
. Det vil være avgjørende i fremtidige studier for å fastslå om Int6 er i stand til å kontrollere både MEK1 og MEK2; våre første MO studier indikerer at MEK2 kan ha en bestemt rolle i melanocyte migrasjon (CA EEP,
upubliserte data
), øke muligheten for at pigment celle migrasjon defekter i
int6
morphants også reflektere endret MEK signalering.
FGF signalering er avgjørende for utvikling av skjelettet, eksemplifisert ved mutasjoner som forstyrrer FGF signalering i menneskelige genetiske skjelett abnormitet syndromene [27]. I utviklings mus embryo, de fleste fosfor-ERK domener lapper med FGF signale domener [26]. FGF signalmolekyler er kandidater for oppstrøms aktivering av Int6-moderert Mek-Erk signale som former kraniofaciale skjelettet hos virveldyr [28], [29], og søker nedstrøms mål for Int6-Mek-Erk signale inkluderer chondrocyttransplantasjon differensiering transkripsjonsfaktor Sox9 , som krever Mek aktivitet for transkripsjonen aktivitet [30]. Vi merker oss også at
ERK2
, men ikke
ERK1
, er spesielt uttrykt i svelg buer i to dager gamle sebrafisk embryoer [31], muligens som tyder på at Int6-Mek modulasjon i utvikling kraniofaciale regionen kan spesifikt signal gjennom målene for Erk2.
relatere Int6 modulering av Mek-Erk aliserte til kreftutvikling er en ny vinkel for fremtidig etterforskning. En mulighet er at i MMTV induserte brysttumorer, kan den avkortede Int-6-protein virker som et onkogen ved å forandre MEK-ERK signalering. Vi foreslår at de ulike cellulære steder av Int6, kombinert med tidsmessig uttrykk og lokalisering av MEK1 /2 og ERK1 /2, kan det føre til finjustering av Mek-ERK signalveier i bestemte vev under utvikling, og kan ha viktige implikasjoner for rollen INT6 i tumorigenesis.
Metoder
sebrafisk oppdrett og morfolino studier
Zerbafish (
Danio rerio
) linjene AB, AB *, og AB * -TPL ble reist og iscenesatt som beskrevet [32], [33]. Mos (tabell 1) ble designet av og kjøpt fra Gene Tools, LLC (USA), og 1 ng injiseres i én celle trinns embryoer.
Phenotype analyse
Phenotype analyse var utført som beskrevet: cellesyklus studier [34]; Alcian blått-farging [35]; probe syntese og hel-mount in-situ hybridiseringer [36]. cDNA prober for neural crest markører var den type gave David Raible (University of Washington, USA). Polyadenylert
int6
mRNA ble generert ved hjelp av Ambion mMessage mMachine (# 1340).
Cellekultur og RT-PCR-analyse
MDA-MB-231 celler ble dyrket og transfektert som beskrevet [19] ved hjelp av Lipofectamine (Invitrogen) med Si-oligonukleotider (tabell 1; Eurogentec) ved en sluttkonsentrasjon på 100 nM i OptiMem (Gibco). Førti-åtte timer etter transfeksjon total RNA ble isolert (RNeasy Mini Kit, Qiagen). Og ett-trinns RT-PCR reaksjoner (Qiagen) oppnås ved hjelp av spesifikke primere (tabell 1)
Immunoblotting
hel-cellelysater og sebrafisk ekstrakter ble samlet [31], [19] og immunhistokjemi ble utført som beskrevet [36]. Antistoffer brukes som i tabell 2.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Cell syklus analyse av int6 morphants. Hele montering immunhistokjemi med sen G2 /M fase markør, fosfo-histon H3 viser bare litt redusert antall celler i slutten av G2 /M fase i int6 morphant sammenlignet med kontrollen. Tilsvarende DNA-innhold som målt ved flow-cytometri viser bare en svak reduksjon av celler i G2 /M-fase i int6 morphant. Således, finner vi at tap av Int6 i normale virveldyrceller (så vel som i flere humane kreftcellelinjer, MG E: Ethmoid plate; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial. Sagittal delen, anterior til venstre
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s004 plakater (17.60 MB TIF)
Takk
Vi er takknemlige for N. Hopkins , A. Amsterdam og S. Farrington for
int6
hi2470
linje; R. Marais og C. Marshall for CI-1040; D. Raible for DNA-konstruksjoner; K. Gull for anti-tubulin antistoffer; E. Prichard for flere CI-1040 observasjoner; D. Faratian for hjelp med immunhistokjemi; B. Morgan for å få hjelp med manuskriptet forberedelse; L. Poulton for kritisk lesing av manuskriptet; og N. Hastie og D. Harrison for nyttige diskusjoner.
