Abstract
Leverkreft er en av viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall. En dypere mekanistisk forståelse av leverkreft kan føre til utvikling av mer effektive terapeutiske strategier. I vårt tidligere arbeid, vist vi 646 mirnas og identifisert 11 som regulerer leverkreft celle migrasjon. Den aktuelle studien viser at MIR-525-3p er ofte oppregulert i lever kreft vev, og økt uttrykk av MIR-525-3p kan fremme leveren kreft celle migrasjon og invasjon. Sink finger-protein 395 (ZNF395) er den direkte funksjonell målgenet for MIR-525-3p, og det er ofte nedregulert i leverkreft vev. Høy uttrykk for ZNF395 kan hemme mens knockdown av ZNF395 uttrykk kan markant forbedre migrasjon og invasjon av leverkreftceller, noe som tyder på at ZNF395 undertrykker metastaser i leveren kreft. Nedregulering av ZNF395 kan megle MIR-525-3p indusert leverkreft celle migrasjon og invasjon. I konklusjonen, fremmer MIR-525-3p leverkreft celle migrasjon og invasjon av direkte rettet mot ZNF395, og det faktum at MIR-525-3p og ZNF395 begge spiller viktige roller i leveren kreft progresjon gjør dem potensielle terapeutiske mål.
Citation: Pang F, Zha R, Zhao Y, Wang Q, Chen D, Zhang Z, et al. (2014) MiR-525-3p Forbedrer Migrasjon og Invasion of Liver kreftceller ved Downregulating ZNF395. PLoS ONE 9 (3): e90867. doi: 10,1371 /journal.pone.0090867
Redaktør: Hong Wanjin, Institutt for molekylær og cellebiologi, Biopolis, USA
mottatt: 16 august 2013; Godkjent: 07.02.2014; Publisert: 05.03.2014
Copyright: © 2014 Pang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra The National 973 Key Basic Research Program (2013CB910504), Shanghai Helse Bureau (XYQ2011047, XBR2011039) og staten Key Project for leverkreft (2012ZX10002-009013). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er den viktigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1], [2]. Systematisk å studere de molekylære mekanismer på leverkreft metastaser er særlig viktig for utvikling av nye terapeutiske strategier. Tumormetastase er en flertrinns kompleks prosess hvor tumorceller bevege seg til omgivende eller fjerne vev etter å ha brutt bort fra den primære tumor. Denne prosessen innebærer tumorcelle transitt gjennom den ekstracellulære matriks (ECM) og basalmembranen av den lokale blodkaret [3], [4], [5], [6], [7], etterfulgt av bevegelse inn i vertsmikro [ ,,,0],8], [9], [10]. Nyere studier har funnet at i tillegg til proteinkodende gener, ikke-kodende RNA som mirnas også spille en viktig regulerende rolle i prosessen med metastase [11], [12], [13], [14], [15], [ ,,,0],16]. mirnas er single-strandet små ikke-kodende RNA, og deres sekvenser er høyt konservert i eukaryote [17]. mirnas regulere genekspresjon ved post-transkripsjonelle nivå ved å bindes til mål-mRNA [18], [19], [20], og således delta i forskjellige biologiske prosess [21], [22]. Meng et al [23] først rapportert at avvikende uttrykk for MIR-21 kan megle leveren kreft celle invasjon av direkte rettet mot PTEN. Nylig, MIR-151 og MIR-30d er funnet å være plassert på genomiske skjøre områder og er assosiert med kreft metastase [24], [25]. Hypoksi-induserbar uttrykk for MIR-210 regulerer VMP1-mediert hypoksi-indusert leverkreft celle metastase [26].
For å screene mirnas involvert i leveren kreft metastaser, i en tidligere studie, vist vi 646 mirnas hjelp sårtilheling analysen med levende celle bildebehandling system, og 11 mirnas ble funnet å effektivt regulere leverkreft cellemigrasjon [27]. I en tidligere rapport [28], identifiserte vi noen kopiantall variasjon regioner i genomisk DNA av 58 par av leveren kreft vev ved hjelp av en SNP Array 6.0. I denne studien fant vi at Mir-525-3p genet ligger i et eksemplar nummer forsterket regionen og det kunne lette leverkreft celle migrasjon i transwell analysen. I tillegg, er MIR-525-3p ofte oppregulert i leverkreft vev og regulerer leverkreft cellemigrering og invasjon ved å nedregulere ekspresjon av ZNF395. Disse funnene tyder på at Mir-525-3p og ZNF395 representerer potensielle mål for leverkreft behandling.
Materialer og metoder
humane levertumorprøver /Etikk erklæringen
Menneskelig leverkreft og tilstøtende nontumorous vev ble innhentet fra de kirurgiske prøven arkiver Qidong Liver Cancer Institute, Jiangsu-provinsen i Kina. Alle disse prøvene ble innhentet skriftlig informert samtykke, og protokollene ble godkjent av etisk Review Committee of WHO forskningssenter for menneskelig produksjon godkjent av Shanghai Municipal Government. De spesifikke eksempler brukt i denne studien er beskrevet i forrige publisering [29].
Cell Culture
HEK-293T, NCI-H1299, BxPC-3, PANC-en, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, SK-HEP-1, MCF7-, A549, NCI-H460, Tera-en og Tera-2 ble kjøpt fra ATCC; Huh-7 ble kjøpt fra japansk Innsamling av forsknings Bioressurser (JCRB), SMMC-7721 og BEL-7402 ble kjøpt fra Typisk kultur bevaring kommisjon cellen bank, Chinese Academy of Sciences (NCB); Mhcc-97L og LM3 var gaver fra Zhongshan Hospital, Fudan University (Shanghai, Kina); SMMC-7721, BEL-7402, har mhcc-97L og LM3 anvendt i denne studien er beskrevet i foregående publikasjon [24], [30], [31], [32].
HEK-293T, NCI -H1299, BxPC3, PANC1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, he-7, HepG2, SK-HEP-1, SMMC-7721, 97L, LM3, BEL-7402 og MCF7 cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). A549 og NCI-H460-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS. Tera1 og Tera2 celler ble dyrket i McCoys 5a-medium supplert med 15% FBS. Alle cellelinjer ble dyrket i nærvær av antibiotika ved 37 ° C med 5% CO
2.
RNA Utvinning og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen). cDNA ble syntetisert med stats-Script RT reagent Kit (Takara). Real-time PCR ble utført med SYBR Premiks Ex Taq (Takara). Eldre mirnas var revers-transkribert og kvantifisert ved hjelp av TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems). Probene og primerene anvendt for miRNA og mRNA deteksjon er oppført i tabell S1 og S2.
plasmidvektor konstruksjoner
primære MIR-525-sekvensen ble amplifisert fra genomisk DNA fra normale vev og ligert inn i en PGIPZ vektor (Open Biosystem). Den ZNF395 ORF sekvensen ble forsterket fra ZNF395 vektor (FulenGen) og ligert inn i pWPXL vektor (en gave fra professor Didier Trono). Den ZNF395 3’UTR ble amplifisert fra genomisk DNA fra HK-293T-celler subklonet og direkte nedstrøms for stoppkodonet av luciferasegenet i luciferase reporter-vektoren. Mutant 3’UTR ble innhentet fra klonet ZNF395 3’UTR bruke QuikChange lyn seterettet mutagenese kit (Agilent). Både villtype og mutante 3’UTR-sekvenser ble bekreftet ved sekvensering (Invitrogen). Primersekvensene er rapportert i tabell S3.
Lentivirus Produksjon og Cell Transduksjon
Emballasjen plasmid psPAX2 og konvolutten plasmid pMD2.G var gaver av professor Didier Trono. Enten pGIPZ-MIR-525 eller pWPXL-ZNF395 vektor ble transfektert med psPAX2 og pMD2.G inn HEK293T celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virus ble høstet 48 timer etter transfeksjon og virale titere ble bestemt. SK-HEP-1 og SMMC-7721-celler ble infisert med 1 x 10
6 rekombinante lentivirus overføringsenheter i nærvær av 6 ug /ml polybrene (Sigma, MO). SMMC-7721-525, SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-ZNF395 er bassenger av stabile celler, som er smittet ved hjelp lentivirus med GFP, stabile cellelinjer som brukes i analyser med . 95% grønn fluorescens
oligonukleotid Transfeksjon
Celler ble sådd i 6-brønners plater. Etter 24 timer, 100 pmol av miRNA etterligner (Genepharma), inhibitor (Ribobio) eller siRNA ble transfektert ved anvendelse av 5 ul lipofektamin RNAiMax reagens (Invitrogen). Cellene ble høstet 48 timer senere for Transwell analyser eller luciferase reporter-analyser. SiRNA sekvenser er gitt i tabell S4.
transfeksjonseffektiviteten Detection
Celler ble transfektert i seks-brønns plater med 100 pmol siRNA med FAM (Genepharma) og RNAiMax reagens (Invitrogen), etter 20-24 timer, transfeksjonseffektiviteten ble påvist ved anvendelse av strømningscytometri (FCM).
celleproliferasjon Assays
Celleformering formering~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved celletelling leder-8 analysesett (CCK-8 Dojindo Corp ). 1 x 10
3-celler ble sådd ut i hver brønn av 96-brønns plate og dyrket med 90 ul medium, 10 ul CCK-8 ble tilsatt i hver brønn. Etter å ha inkubert ved 37 ° C i 2 timer ble absorbansen påvist ved 450 nm, og den OD450 verdi er korrelert med antall levende celler.
migrering og invasjon Assays
Cellemigrering assay : 5 x 10
4 celler ble suspendert i 200 ul serumfritt DMEM-medium og sådd ut i det øvre kammer av hvert innskudd. Deretter ble 800 ul DMEM inneholdende 10% FBS tilsatt til en 24-brønns plate. Etter inkubering ved 37 ° C (SK-HEP-1:6-8 t; SMMC-7721:12-16 h), cellene som migrerte ble fiksert og farget i 30 minutter i en fargestoffoppløsning inneholdende 0,2% krystallfiolett og 20 % metanol. Celle invasjon assay: Chambers var jevnt dekket med 40-80 pl Matrigel (BD Biosciences) fortynnet med DMEM til en viss prosentandel, og inkubert ved 37 ° C i 2-4 timer. Deretter, 1 x 10
5-celler ble suspendert i 200 ul DMEM og sådd ut i de øvre kamrene, og 800 ul DMEM inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubasjon ved 37 ° C (SK-HEP-januar 14 til 16 t; SMMC-7721 16-18 h), ble cellene fiksert og farget
luciferaserapportørplasmid analysen
HEK293T celler. ble dyrket i en 96-brønns plate og transfektert med 50 ng pluc-3’UTR, 10 ng plasmid Renilla luciferase og 5 pmol MIR-525-3p etterligne eller negativ kontroll. Etter 48 timers inkubering, ble luciferase-aktivitet påvist ved anvendelse av dual-luciferase reporter analysesystem (Promega).
Western Blot Assay
Cellelysater ble separert ved 10% SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad), blokkert med fosfat-bufret saltvann inneholdende Tween-20 og 5% fettfri melk i 1 time, og inkubert med ZNF395 polyklonalt antistoff (Santa Cruz) (1:1000) eller β-aktin (Sigma) ( 1:10000). Antistoffkomplekset ble påvist ved anvendelse av forsterket kjemiluminescens (Pierce).
Statistical Analysis
Alle resultater er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved hjelp av Student t-test (to-tailed, p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant).
Resultater
Høy Expression of Mir-525-3p Forbedrer Migrasjon og invasjon av leverkreft Cells
for å undersøke hvilken rolle MIR-525-3p i leveren kreftutvikling, ble uttrykket nivået av MIR-525-3p oppdaget i 136 leverkreft og sammenkoblede tilstøtende noncancerous leveren vev (NT). MIR-525-3p var signifikant oppregulert i leverkreft vev (figur 1A), med oppregulering observert hos 60% av leverkreft vev (figur 1B). I tillegg undersøkte vi uttrykket av MIR-525-3p i ulike kreftcellelinjer. Resultatene viste at ekspresjonsnivået av mir-525-3p er forholdsvis høy i leverkreft cellelinjer (fig S1 i File S1). For å undersøke den biologiske funksjonen til MIR-525 i HCC, var stabile cellelinjer som uttrykker Mir-525 konstruert og heter SMMC-7721-525 og SK-HEP-1-525 (figur S2A i File S1). CCK-8 analyser antydet at MIR-525 ikke påvirker HCC cellevekst (Figur S3 i File S1), mens Transwell analyser indikerte at overuttrykk av MIR-525 forfremmet SK-HEP-1 og SMMC-7721 migrasjon og invasjon (figur 1C, D).
(A) MIR-525-3p ble bestemt av TaqMan real time PCR i leverkreft og tilstøtende prøver noncancerous levervev (NT) (n = 136). Mir-525-3p uttrykk nivået ble normalisert til U6b snRNA. Den relative uttrykk for MIR-525-3p er rapportert i et boksplott med en logg
10 y-aksen skala. Endene av boksene definerer 25
th og 75
th persentiler, og linjen viser medianen. Statistisk analyse ble utført av en paret t-test, og stjernene viser statistisk signifikante resultater på P 0,05 (*). (B) Kakediagrammet viser andelene av leveren kreft vev der MIR-525-3p uttrykk ble oppregulert (60%), nedregulert (5%) og uendret (35%). (C) Transwell migrasjon analyser av SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler uttrykker Mir-525 eller vektor kontroll. (D) Transwell invasjonsanalyser av SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler uttrykker Mir-525 eller vektor kontroll. Representative bilder vises til venstre, og 3 tilfeldig utvalgte felt er tallfestet på høyre side. Verdiene vist her representerer gjennomsnitt ± SEM, og stjernene viser statistisk signifikante resultater på P 0,01, ** eller P. 0,001, ***
MiR-525-3p Post-transcriptionally nedregulerer ZNF395 Expression ved direkte rettet mot sin 3’UTR
neste søkt bestemme målgener av MIR-525-3p. Potensielle målgener ble spådd hjelp av miRNA prediksjon algoritmer TargetScan, Miranda og DIANA. Felles spådommer om hver to programvare ble kombinert og 30 kandidat gener ble funnet (figur 2A). Uttrykket nivåer av disse genene ble oppdaget etter MIR-525-3p ligner ble introdusert i SK-HEP-1 og SMMC-7721. RANBP10, NACC1, IRF1, ZNF395 og MLST8 ble hemmet av mer enn 40% (figur S4 i File S1). For å forstå om disse fem genene er knyttet til leverkreft, ble uttrykket nivåer av disse genene påvist i 12 par leverkreft vevsprøver. RANBP10, IRF1 og ZNF395 ble funnet å være nedregulert i leveren kreft vev, mens uttrykket nivåer av NACC1 og MLST8 forble uendret (figur S5 i File S1).
(A) Schema av kandidatgener produsert ved forskjellige prediksjon algoritmer. Hver sirkel representerer en prediksjon algoritme og antall gener som det spådd, og numrene i regionene der sirklene overlapper representerer antall gener spådd av begge algoritmer. (B) Western blot analyser av ZNF395 protein nivåer i SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler infisert med miR525 eller vektor kontroll. (C) Potensielle bindende sekvenser for miR525-3p innenfor ZNF395 3’UTR av menneskelig (HSA), sjimpanse (PTR), rhesus (MML), hund (CFA) og kanin (Ocu). Seed sekvenser er understreket. (D) luciferaserapportørplasmid plasmider ble konstruert ved innsetting av ZNF395 3’UTR og tilsvarende fragmenter inn i området nedstrøms for luciferasegenet. De predikerte bindende sekvenser for Mir-525-3p vises, inkludert full lengde UTR villtype (WT) eller mutant (MT, understreket) bindingssteder. (E) Relativ luciferaseaktivitet ble målt etter HEK-293T-celler ble ko-transfektert med WT eller MT ZNF395 3’UTR rapportør plasmider og MIR-525-3p. Verdiene er angitt som gjennomsnitt ± SEM, og stjernene indikerer statistisk signifikans ved P . 0.01, **
For å forstå om RANBP10, IRF1 og ZNF395 er potensielle funksjonell målgener av MIR-525 -3p, disse genene ble knockdown ved hjelp av siRNA. Resultatene viste at interferens med IRF1 uttrykk kan hemme migrering av SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler, en fenotype som er i strid med fenotype av MIR-525-3p over-uttrykk. Knockdown av endogen RANBP10 og ZNF395 uttrykk var i stand til å fremme migrering av SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler. Denne fenotype er forenlig med fenotypen av MIR-525-3p over-ekspresjon. (Figur S6 i File S1). Deretter ble det RANBP10 og ZNF395 proteinnivåer analysert i SK-HEP-1-525 og SMMC-7721-525-celler for å bestemme hvorvidt MIR-525 over-ekspresjon kunne hemme ekspresjon av disse proteiner. Resultatene viste at ZNF395 proteinnivået ble signifikant redusert i SMMC-7721-525 og SK-HEP-1-525 celler (figur 2B). Mens RANBP10 proteinnivået ikke ble betydelig påvirket (figur S7 i File S1). Dermed ZNF395 ble valgt for videre studier.
ZNF395 3’UTR inneholder et bindingssete for MIR-525-3p (spådd av TargetScan), og bindingen sekvensen er svært konservert i ulike arter som menneske, sjimpanse, rhesus ape, hund og kanin (figur 2C). For å avgjøre om MIR-525-3p direkte regulerer ZNF395 ved å målrette sin 3’UTR ble en ZNF395 helaftens 3’UTR luciferase reporter vektor konstruert. Luciferase aktiviteten sunket betraktelig etter kotransfeksjon med Mir-525-3p ligne og luciferase 3’UTR konstruksjoner. I kontrast, gjorde den relative luciferase aktiviteten ikke endres vesentlig når muterte bindingssteder ble innført (figur 2D, E), noe som tyder på at MIR-525-3p kunne regulere ZNF395 uttrykk ved direkte binding til sin 3’UTR.
ZNF395 er ofte nedregulert i leverkreft og kan hemme leverkreft cellemigrasjon og Invasion
sink finger protein 395 er et medlem av sink finger protein familie Krüppel C2H2-type, og de fleste proteiner i denne familien funksjon som transkripsjonsaktivatorer eller inhibitorer. ZNF395 har ikke tidligere blitt rapportert å være involvert i leverkreft eller tumormetastase. Derfor bør effektene av ZNF395 for utvikling og progresjon av leverkreft og mekanismen bak de effekter undersøkes. ZNF395 ble signifikant nedregulert i leverkreft vev (figur 3A), med nedregulering observert hos 62% av leverkreft vev (Figur 3B). For å klargjøre effekten av ZNF395 i leveren kreft celle migrasjon og invasjon, stabil cellelinje SK-HEP-1-ZNF395 ble etablert (figur S2B i File S1) og sirnas mot ZNF395 ble bestilt, ble det knockdown effektiviteten av ZNF395-sirnas bestemmes av real -time PCR (figur S2C i File S1), og transfeksjonseffektiviteten av SK-HEP-1 og SMMC-7721 var 89,5% og 97,0% (Figur S2 D, E, F, G i File S1).
(A) Relative uttrykk nivåer av ZNF395 i HCC vev eller matchet noncancerous vev (NT) ble bestemt ved hjelp av kvantitative revers-transkripsjon PCR-analyser. (B) Kakediagrammet viser andelene av leverkreft prøver hvor ZNF395 ble nedregulert (62%), uendret (32%), og oppregulert (6%). ZNF395 uttrykk ble bestemt av TaqMan Real time PCR i leverkreft og tilstøtende noncancerous leveren vev (NT) (n = 136), og ZNF395 uttrykk nivåer ble normalisert til GAPDH. Den relative uttrykk for ZNF395 er presentert i et boksplott. Statistisk analyse ble utført med en paret t-test. (C, D) Lentivirus-mediert overekspresjon eller siRNA-indusert knockdown av ZNF395 ekspresjon ble påvist ved Western blot i SK-HEP-1. ((E) Relative uttrykk nivåer av modne MIR-525-3p i ZNF395 overuttrykk eller knockdown SK-HEP-1 celler. (F) Transwell migrasjon og invasjon analyser av SK-HEP-1cells stabilt uttrykker ZNF395 eller vektor kontroll. ( .. G) Transwell migrasjon og invasjon analyser av SK-HEP-1 celler etter knockdown av endogen ZNF395 Representative bilder er vist på venstre side, og 3 tilfeldig utvalgte felt er tallfestet på høyre Feilfelt felt~~POS=HEADCOMP representerer SEM; Stjernene viser statistisk signifikans på P 0,05, *; P 0,01, **, eller P .. 0.001, ***
ZNF395 uttrykk nivået ble oppdaget av western blot analysen (Figur 3C, D) og relative uttrykk nivåer moden MIR-525-3p ble ikke åpenbart endret i ZNF395 over-uttrykk eller knockdown SK-HEP-1 celler (Figur 3E), slik at kan utelukke muligheten for en cross-regulering av MIR-525 ved ZNF395 . Denne analysen viste at over-uttrykk for ZNF395 kunne hemme SK-HEP-1 migrasjon og invasjon (figur 3F), mens interferens med endogen ZNF395 uttrykk kunne gi en betydelig fremme migrasjon og invasjon av SK-HEP-1 celler (figur 3G) .
Restaurering av ZNF395 Hemmer MIR-525-indusert leverkreft cellemigrasjon og Invasion
i et forsøk på å teste om ZNF395 er den direkte funksjonell formidler av MIR-525 indusert migrasjon og invasjon, en ZNF395 lentiviral vektor inneholdende full-lengde ORF, men unntatt det 3’UTR ble innført i SK-Hep1-525 stabil cellelinje (figur 4A). Relative uttrykk nivåer moden MIR-525-3p ble ikke åpenbart endret i SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-525-ZNF395 celler (figur 4B). Resultatene viste at høy ZNF395 ekspresjon var i stand til å kompensere MIR-525-induserte endringer i SK-HEP-1-migrering og invasjon (figur 4C, D). Disse funnene indikerer at ZNF395 er en direkte funksjonell målet genet for MIR-525-3p.
(A) Western blot analyser for SK-HEP-1-vektor eller SK-HEP-1-525 celler med eller uten gjeninnføring av ZNF395. (B) Relative uttrykk nivåer av modne MIR-525-3p i ZNF395 over-uttrykk eller knockdown SK-HEP-1 celler. (C, D) Transwell migrasjon, invasjon analyser for SK-HEP-1-vektor eller SK-HEP-1-525 celler med eller uten gjeninnføring av ZNF395. Disse resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ble utført med t-test. Feilfelt representerer S.E.M, og stjerner indikerer statistisk signifikans på P 0,05, *; og P . 0.001, ***
Diskusjoner
MIR-525 ligger på kromosom 19q13.42 uten en vert gen. Uttrykket nivået av MIR-525-3p økt 6,8 til 8 ganger i to cisplatin-resistent bakterie celle tumor cellelinjer [33]. Wang et al [34] oppdaget miRNA uttrykk ved hjelp av miRNA microarray og funnet ut at Mir-525-3p ble oppregulert i tre par leveren kreft vev. Det er ingen rapporter om funksjon og mekanisme av MIR-525-3p i kreft. I denne studien, for første gang, fant vi at økt uttrykk av MIR-525-3p fremmer leverkreft celle migrasjon og invasjon. ZNF395 er identifisert som en direkte funksjonell målet genet for MIR-525-3p.
ZNF395 er medlem av Krüppel C2H2 typen sink finger protein familien. Det er allment uttrykt og ble opprinnelig identifisert som en transkripsjonsfaktor som regulerer human papilloma virus (HPV) ekspresjon; Således er det også kjent som HPV-bindende faktor (PBF) og kan binde seg til HPV-promotor-regionen [35]. ZNF395 er uttrykt i hypoksi-indusert glioblastom cellelinjer og i blodårene til voksne glioblastom vev [36]. Tsukahara et al [37] fant at ZNF395 er et tumor-assosiert antigen. ZNF395 ble også vist å regulere PI3K /Akt veien for å hemme cellevekst [38] ved aktivering av kaspase-3 for å fremme apoptose [39]. Det er ingen rapporter om ZNF395 å være involvert i tumormetastaser.
Vi rapporterer for første gang at ZNF395 er ofte nedregulert i leveren kreft vev og at Mir-525-3p kan spesifikt målrette ZNF395 3’UTR . Over-uttrykk for ZNF395 kan hemme leverkreft celle migrasjon og invasjon, mens restaurering av ZNF395 hemmer MIR-525-mediert leverkreft celle migrasjon og invasjon. Over-uttrykk for ZNF395 og MIR-525 ikke har noen effekt i NF-kB, MAPK vei, men kan regulere PI3-K /Akt sti gjennom endring av status for p-Akt (Figur 5, Figur S8 i File S1).
Western blot analyse av PI3-K /Akt sti i SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-ZNF395 celler.
Oppsummert viser denne studien at høy uttrykk for MIR-525-3p fremmer leverkreft celle migrasjon og invasjon. ZNF395 er en direkte funksjonell target gen av MIR-525-3p; MIR-525-3p fremmer leverkreft celle migrasjon og invasjon av nedregulere uttrykket av ZNF395. Dette funnet viser en ny mekanisme for leverkreft metastaser og nye mål for behandling av leverkreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Sekvensene av miRNA sonder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090867.s001 plakater (docx)
Tabell S2.
real-time PCR primere for predikerte potensielle mål genet kandidater
Doi. 10,1371 /journal.pone.0090867.s002 plakater (docx)
tabell S3.
Grunning for MIR-525, ZNF395, ZNF395 3’UTR og mutant 3’UTR kloning
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0090867.s003 plakater (docx)
Tabell S4.
siRNA sekvenser mot IRF1, RANBP10 og ZNF395
doi:. 10,1371 /journal.pone.0090867.s004 plakater (docx)
File S1.
Støtte informasjon om oppnådde resultater, som inneholder figur S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 og S8. Figur S1. Uttrykket nivåer av MIR-525-3p i ulike kreftcellelinjer. MIR-525-3p uttrykk ble bestemt av TaqMan Real time PCR i kreftcellelinjer. Uttrykket nivåer ble normalisert til U6 snRNA. Figur S2. Uttrykket nivåer av stabile cellelinjer som sterkt uttrykker Mir-525 og ZNF395. (A) Relative uttrykk nivåer av modne MIR-525 i SMMC-7721-525 og SK-HEP-1-525, ble ABI TaqMan miRNA analyser brukes og data ble normalisert ved U6b snRNA. (B) Den relative Ekspresjonsnivået av ZNF395 i SK-HEP-1 eller vektorkontroll, dataene ble normalisert ved GAPDH. (C) knockdown effektiviteten av ZNF395-siRNAs. Blandingen av ZNF393-siRNA-1, ZNF393-siRNA-2, og ZNF393-siRNA-3 ble kåret ZNF393-siRNA-1 + 2 + 3. (D, E, F, G) Transfeksjon effektiviteten av FAM-siRNA i SK-HEP-1 og SMMC-7721-celler. Stars er angitt for å vise betydningen, P 0,01, **; P 0,001, ***. Figur S3. MIR-525 har ingen signifikant effekt på HCC cellevekst. Celle proliferasjonsanalyser for SMMC-7721 (A) og SK-HEP-1 (B) celler infisert med lentivirus som uttrykker miR525 eller vektorkontroll. Celletelling kit-8 (CCK-8) assay ble brukt for å vurdere celleformering. Gjennomsnittet av verdier plottes som vist, og viser linjene S.E.M i tre eksemplarer. P = ns (ikke signifikant) av Student
t
-test. Figur S4. Uttrykket nivåer av predikerte potensielle target gen kandidater. Data ble normalisert ved GAPDH, og presentert som middelverdier ± S.E.M.. Figur S5. Uttrykket nivåer av kandidatgener i leveren kreft vev. Uttrykk av (A) RANBP10, (B) IRF1, (C) ZNF395, (D) NACC1 og (E) MLST8 ble bestemt av kvantitativ real-time PCR-analyser i leverkreft og tilstøtende noncancerous leveren vev (NT) (n = 12 ). Data ble normalisert ved GAPDH blir stjerner indisert for å vise betydningen, P 0,05, *; P 0,001, ***. Figur S6. Interferens IRF1 kan RANBP10 og ZNF395 uttrykk hemme eller fremme SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler migrasjon. (A) Interferens IRF1 uttrykk kan hemme SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler migrasjon. Interferens RANBP10 (B) og ZNF395 (C) uttrykk kan fremme SMMC-7721 og SK-HEP-1 celler migrasjon. Figur S7. RANBP10 uttrykk er ikke åpenbart endret i MIR-525 over-uttrykt celler. Western blot analyser av RANBP10 uttrykk i SK-HEP-1 og SMMC-7721 celler infisert med miR525 eller vektor kontroll. Figur S8. Over-uttrykk for MiR-525 og ZNF395 har ingen effekt i NF-kB, MAPK sti eller EMT markører. Western blot-analyse av NF-kB (A), (B) MAPK spredningsveier og EMT markører (C) i SK-HEP-1-525 og SK-HEP-1-celler ZNF395
doi:. 10,1371 /journal.pone .0090867.s005 product: (DOC)
takk
Vi takker professor Didier Trono (School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fe’de’rale de Lausanne, 1015 Lausanne, Sveits) for den sjenerøse gaver av de pWPXL, psPAX2 og pMD2.G plasmider.
