Abstract
Blærekreft er den vanligste ondartet urologisk sykdom i Kina. Hydroksycamptothecin (HCPT) er et DNA topoisomerase inhibitor, som har vært brukt i kjemoterapi for blærekreft i nesten 40 år. Tidligere forskning har vist at isoflavone, genistein, kan bevisstgjøre flere kreftcellelinjer til HCPT behandling, som for eksempel prostata og livmorhalskreft. I denne studien undersøkte vi om genistein kan bevisstblærekreftcellelinjer og blære epiteliale celle BDEC celler til HCPT behandling, og undersøkt mulige underliggende molekylære mekanismene. Genistein kunne gi en betydelig og doseavhengig sensitiv flere blærekreftcellelinjer og BDEC celler til å HCPT-indusert apoptose både in vitro og in vivo. Genistein og HCPT synergi hemmet blære cellevekst og spredning, og induserte G2 /M fase cellesyklus og apoptose i TCCSUP blærekreft celle og BDEC celle. Forbehandling med genistein sensitivisert BDEC og blærekreftcellelinjer til HCPT-indusert DNA skade ved den synergis aktivering av ataksi telangiectasia mutert (ATM) kinase. Genistein dempes i betydelig grad muligheten for HCPT å indusere aktivering av anti-apoptotiske NF-kB veien både in vitro og in vivo i en blærekreft xenograft modell, og således motvirker den anti-apoptotiske virkning av NF-kB pathway. Denne studien viser at genistein kan fungere som en lovende giftfri agent for å forbedre effekten av HCPT blærekreft kjemoterapi
Citation. Wang Y, Wang H, Zhang W, Shao C, Xu P, Shi CH, et al. (2013) Genistein sensitizes Blære kreft celler til å HCPT Treatment in vitro og in vivo via ATM /NF-kB /IKK Pathway apoptose. PLoS ONE 8 (1): e50175. doi: 10,1371 /journal.pone.0050175
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 18 juni 2012; Godkjent: 22 oktober 2012; Publisert: 24 januar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 30901498, nr 30100185, nr 81250036, nr 30973000, nr 30872583, nr 81072116) og Stiftelsen Shaan’xi provinsen i Kina Natural Science ( 2009JQ4003). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er en av de vanligste kreftformer som påvirker urinveiene. Totalt 44,690 menn (29,8 per 100 000) og 16,730 kvinner (11,2 per 100 000) ble diagnostisert i 2006, rangering blærekreft som den fjerde vanligste mannlige og niende vanligste kvinnelige ondartet sykdom i USA [1]. I motsetning til dette er forekomsten av blærekreft i Asia mye lavere. I 2009, Zhang et al. rapporterte at selv om prisene steg mellom 1988 og 2002 (8,22 per 100 000 i 1988 til 1992, 9,45 per 100 000 i 1993 til 1997 og 9,68 per 100 000 i 1998 til 2002), forblir lavere enn USA [forekomsten av blærekreft i Kina ,,,0],2]. Tilsvarende, i Øst-Asia, lav forekomst av blærekreft har blitt rapportert i Korea (14,39 per 100.000), Japan og India (ca. 14 per 100 000) [3] – [5]. I tillegg er 5-års sykdomsspesifikke overlevelse av pasienter med blærekreft i Asia er høyere enn i vestlige land [6].
kjemoterapeutisk middel, hydroksycamptothecin (HCPT), er først og fremst brukes til behandling av blærekreft. HCPT induserer apoptose i blærecancerceller ved å danne et ternært kompleks med DNA og DNA-enzymet topoisomerase I via hydrogenbindinger, for derved å stabilisere komplekset. Den stabilt kompleks hindrer DNA re-ligering og fører til konvertering av enkelttråds DNA pauser i dobbelttrådbrudd i S-fasen. På dette punktet, kolliderer replikering gaffel med DNA-spaltningsseter komplekser, som induserer apoptose og cellesyklus-stans [7].
Genistein, et velkjent isoflavon og naturlig botanisk østrogen, har vist seg å hemme kreftcellevekst, overlevelse, metastase og angiogenese ved å øke apoptotisk celledød via induksjon av flere DNA-ødeleggende stimuli [8] – [10]. Genistein har vist seg å ha en hemmende virkning på vekst av prostata kreft [11], livmorhalskreft [12], brystkreft [13], tykktarmskreft [14] og nyrecellekarsinom [15] celler. Genistein kan også chemosensitize mange ondartede svulster til effekten av DNA giftige stoffer. Tidligere rapporter har vist at forbehandling med 10-30 pmol /l genistein kan chemosensitize cervical, ovarier og normal fibroblast celler til behandling med HCPT ved å indusere en større grad av veksthemning og celle apoptose [16]. Men om genistein kan forsterke den kjemoterapeutiske effekten av HCPT i blære-celler, og dens molekylmekanismen i denne vevstype, forblir uklar. Derfor utforsket vi om genistein kan chemosensitize blæren kreftceller til HCPT, og undersøkt de potensielle underliggende mekanismene for denne effekten.
Materialer og metoder
1. Cellelinjer
J82, scaber, og TCCSUP blærekreftcellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), BFTC905, HT1197, T24, TSGH-8301 blærekreft cellelinjer var fra Kina Senter for Type Culture Collection (CCTCC). Den primære blære epitelcellelinje, BDEC, var fra BioWhittaker (San Diego, CA, USA) og ble opprettholdt som eksponentielt voksende kulturer i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Genistein (Sigma, Shanghai, Kina) og HCPT (vennlig levert av Sanofi, Shanghai, Kina) ble oppløst i DMSO å forberede 10 mM stamløsninger. For eksperimentene ble cellene inkubert i 3 dager, og deretter behandlet med eller uten 10 mM genistein og 1 pM HCPT i 24 timer.
2. Cellevekst-hemming av genistein og HCPT
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
3 celler /brønn og fikk feste seg over natten. Dyrkningsmediet ble erstattet med friskt medium som inneholdt genistein ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer, og cellene ble deretter utsatt for HCPT i ytterligere 72 timer. For hvert enkelt middel behandling ble cellene behandlet med genistein i 96 timer og HCPT i 72 timer. Cellevekst ble undersøkt ved hjelp av MTT-analysen.
3. Flowcytometri for apoptose
Adherente celler ble trypsinert, resuspendert og behandlet som tidligere beskrevet [17]. Flowcytometri ble utført ved hjelp av blått lys argon-in laser (eksitasjon bølgelengde, 488 nm; laser makt, 200 mW) og rød fluorescens fra PI som etiketter DNA ble registrert. Alle tester for apoptose ble utført i duplikat, og resultatene som er vist er representative for minst tre forsøk.
4. Immunofluorescerende farging for γ-H2AX og ATM
For γ-H2AX farging ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av HCPT og genistein, mediet ble fjernet ved forskjellige tidspunkter, og cellene ble fiksert i 1% paraformaldehyd i 10 min, fulgt av 70% etanol i 10 min. Cellene ble deretter inkubert i 0,1% Triton X i fosfatbufret saltvann (PBS) i 10 minutter, permeabilisert i 0,5% Triton i PBS i 10 min, vasket tre ganger i PBS og blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 60 min. Cellene ble inkubert med anti-γ-H2AX (1:2,000, Cell Signaling, Shanghai, Kina) eller anti-ATM (1:300, Cell Signaling, Shanghai, Kina) i 5% BSA i PBS ved 4 ° C over natten, vasket fire ganger i PBS, inkubert i mørket med et FITC-merket sekundært antistoff (1:2,000 for anti-γ-H2AX og 1:300 for anti-ATM) i 5% BSA i 1 time, ble vasket 4 ganger i PBS, inkubert i mørket med 1 pg /ml 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i PBS i 5 min, og montert og coverslipped i Fluoromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL , USA). Skinnene ble undersøkt på en Leica fluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland), bildene ble tatt med en Nikon fluorescens mikroskop (Nikon Eclipse E800) og importert til Nikon ACT-1 (versjon 1.12) programvare. Bilder ble slått sammen til en publisering format ved hjelp av Adobe Photoshop CS2. For hver behandling tilstand, ble antallet γ-H2AX eller ATM foci bestemt i minst 50 celler. Alle observasjoner ble validert av minst tre uavhengige eksperimenter.
5. Western blotting
blærekreft cellene ble lysert i 400 ul 1% SDS lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 4 mM Nappis, 2 mM Na
3VO
4) i 5 minutter på is for å oppnå totale cellelysater. For å samle kjerneprotein, ble monolagene vasket tre ganger med iskald hypotonisk lyseringsbuffer (HLB, pH 7,5, 10 mM Tris, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl
2), og cellene ble oppsamlet og overført til en homogenisator (Wheaton Ltd, Millville, NJ, USA) i 500 ul HLB. Cellene ble svellet i HLB i 15 minutter, homogenisert og cellekjernene ble oppsamlet ved sentrifugering og lysert i RIPA buffer. Den pull-down-analysen ble utført ved immunoutfelling av 500 ug nukleær eller cytosolisk ekstrakt (forbehandlet med protein A /G-perler) med primært antistoff, og deretter 50-100 ug total eller det nukleære lysatet ble løst i en 07/05 til 12/05% natrium-dodecyl sulfat-polyakrylamid (SDS-PAGE) gel, elektro-overført til en Hybond ECL membran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), blokkert i PBS som inneholdt 5% fettfri tørrmelk og 0,05% Tween-20, ble inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C, og deretter inkubert med sekundære antistoffer i 1 time. Proteinbåndene ble visualisert ved hjelp av Phototope-HRP Western Detection System (Cell Signaling, Beverly, MA, USA) og Kodar film (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) og skannet og kvantifisert ved hjelp ImageJ (http: //rsbweb.nih gov /ij /). Den anti-ATM, anti-fosfo H2AX, anti-fosfo ATM (Ser 1981), anti-IKK, anti-fosfo IKK1 /2, anti-β-aktin, anti-GAPDH, anti-fosfo-NEMO (NF-kappa- β viktig modulator), anti-NBS1 (Nijimegen brudd syndrom 1) antistoff, anti-caspase 3 og 9, anti-fosfor PARP og anti-Oct1 antistoffer ble hentet fra Cell Signaling.
6. siRNA transfeksjon
Transfeksjon av TCCSUP og BDEC celler med ATM siRNA (50 nmol /l; Invitrogen) ble utført ved hjelp Oligofectamine reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll
7.. In vivo tumor terapistudier
Forsøket ble godkjent av etikkomiteen i den fjerde Military Medical University. Blære kreft celler var ferdigblandet 01:01 med Matrigel (Becton Dickinson, Beijing, Kina) og subkutant inokulert (5 × 10
6 celler per område) i flankene av 10 uker gamle kvinnelige SCID hårløse mus (Department forsøksdyr, den fjerde Military Medical University, Xi’an, Shaan’xi, Kina). Medikamentell behandling startet 22 dager etter tumorcelle injeksjon. Mus ble tilfeldig fordelt (5 mus /gruppe) i fem grupper. Kontrollgruppen ble kompromittert svulster som ble behandlet med 0,01% DMSO. Mus ble behandlet oralt med mat som inneholdt genistein (1 g /kg) og /eller den transperitoneale injeksjon av 3 pg /ml HCPT. Den prosentvise endringen i tumorstørrelse ble beregnet ved å sammenligne med grunnverdi på 22 dager.
8. Elektroforetiske mobilitet skift analyse (EMSA)
Nuclear celleekstrakter ble oppnådd som tidligere beskrevet, og 10 ug kjerneekstrakt ble inkubert med renset
32P-merket NF-kB konsensusdobbeltkjedet oligonukleotid og 0,25 mg /mL poly (di-dC) i 5 x bindingsbuffer [18]. Prøvene ble separert på 8% polyakrylamidgeler ble gelene tørket og eksponert for røntgenfilm over natten ved -80 ° C og utviklet ved hjelp av en All-Pro Plus 100 automatisert røntgenfilm prosessor (All-Pro Imaging Corporation, Hicksville, NY, USA).
9. Kvantifisering og statistiske metoder
Grupper ble sammenlignet med Student
t
-test;
P
values≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
1. Effekter av HCPT og genistein på levedyktigheten av blærecancerceller
Blære-celler ble behandlet med genistein i 3 dager, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Behandling av en rekke blærekreftcellelinjer og BDEC blære celler med genistein resulterte i dose- og tidsavhengig inhibering av celleproliferasjon, som viste at genistein reproduserbart hemmer veksten av blærecancerceller. Imidlertid ble det observert en synergistisk effekt når J82, T24, TSGH8301 og TCCSUP blærekreftceller og BDEC blære-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av genistein og HCPT (Fig. 1A). MTT-analyser indikerte at den synergistiske virkning av genistein og HCPT var konsentrasjonsavhengig (fig. 1B).
A. MTT analyse av blærekreftcellelinjer og BDEC celler behandlet med 10 mikrometer genistein og /eller 1fiM HCPT; Resultatene er uttrykt som prosent av kontrollceller. B. MTT-analysen av TCCSUP og BDEC celler behandlet med ulike konsentrasjoner av HCPT og /eller genistein i 48 timer. C. Celle syklus fordeling av TCCSUP eller BDEC behandlet med 1 uM HCPT og /eller 10 uM genistein i 24 timer. D. Apoptose målt ved FACS i TCCSUP, og BDEC behandlet med 10 uM genistein og /eller 1 uM HCPT. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; *
P
0,05 og **
P
0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. #
P
0,05 og ##
P
0,01 sammenlignet med HCPT; @
P
0,05 og @@ P. 0,01 sammenlignet med genistein
2. Synergistic cellesyklus arrest etter HCPT og genistein
Både HCPT (1 mikrometer) og genistein (10 mm) for en 24-timers periode viste en statistisk signifikant evne til å arrestere cellesyklusen (Fig. 1C). Sammenlignet med kjøretøyet, HCPT forårsaket en cellesyklus-stans i både den S-fasen (kontroll: 57,6%, HCPT: 46,5%, genistein: 57,9%, HCPT + genistein: 31,1% for TCCSUP celler, kontroll: 57,2%, HCPT: 43.1 %, genistein: 53,6%, HCPT + genistein: 29,1% for BDEC celler) og G2-M fasen (kontroll: 21,5%, HCPT: 30,6%, genistein: 22,1%, HCPT + genistein: 41,6% for TCCSUP celler, kontroll : 21,7%, HCPT: 30,3%, genistein: 26,7%, HCPT + genistein: 36,3% for BDEC celler). Selv genistein (10 mikrometer) alene ikke påvirker cellesyklus betydelig sammenlignet med kontrollene, tillegg av genistein til HCPT-behandlet (1 mikrometer) celler betydelig sensitivisert cellene til HCPT via induserende G2 /M cellesyklus arrest.
3. Synergistic induksjon av apoptose ved HCPT og genistein
Ved hjelp FACS å kvantifisere apoptose, observerte vi at 10 mm genistein og en mikrometer HCPT synergi og doseavhengig indusert apoptose i blæren kreftceller (Fig. 1D). Induksjon av apoptose var doseavhengig og direkte korrelert med en hemming av cellevekst (Fig. 1 B, D).
4. NBS1 avhengige ATM aktivering er indusert av DNA-skader
Resultatene er beskrevet i kapittel 3.3 viste at genistein kan virke synergistisk med HCPT å indusere apoptose. Som nevnt ovenfor, kan HCPT indusere celle apoptose via induserende dobbelttrådbrudd (DSB) i DNA. Derfor, undersøkte vi hvorvidt denne synergisme av apoptose er relatert til DSB. TCCSUP celler ble behandlet med 1 uM HCPT og /eller 10 uM genistein i 1 time, og det totale protein fra hver gruppe ble ekstrahert og gjennomgikk Western blotting for kromosomal histon protein, γ-H2AX [19]. Western blot viste at HCPT og genistein kan synergi indusere H2AX fosforylering på en time etter behandling, noe som indikerte at disse stoffene kan indusere DSB. Videre sterk H2AX fosforylering kan fremdeles sees i ko-behandlede gruppe 24 timer etter behandling, sammenlignet med cellene administrert med kun enkle midler, som viste en forsinket DNA-skadereparasjonsprosessen (fig. 2A). I tillegg, 1 uM HCPT og 10 uM genistein aktivert synergistisk fosforyleringen av ATM i Ser 794 på en doseavhengig måte (fig. 2B). Den romlige fordeling av ATM og γ-H2AX etter medikamentbehandling ble bestemt ved anvendelse av en multiplekset immunofluorescens-analyse (Fig. 2C). Signifikant flere ATM og γ-H2AX atom foci ble observert i TCCSUP celler behandlet med både HCPT og genistein i 30 minutter sammenlignet med kontrollen, HCPT- og genistein-behandlede celler. I tillegg er behandling med begge disse medikamentene økte signifikant ko-lokalisering av ATM og γ-H2AX i cellekjernen. ATM-hemmer, Ku55933, betydelig redusert ATM foci formasjon, og dermed hemmet γ-H2AX /ATM samlokalisering i HCPT- og genistein-behandlede celler (Fig. 2C). En immunoprecipitation analysen ble utført for å undersøke hvordan ATM fosforyleres etter HCPT og genistein behandling. Behandling med både HCPT og genistein aktivert ATM og induserte en interaksjon mellom ATM /H2AX og NBS1 /H2AX i TCCSUP og BDEC celler. Den NBS1 inhibitor, mirin, betydelig svekket HCPT- og /eller genistein-indusert minibank eller NBS1 og H2AX bindende i HCPT- og genistein-behandlede celler (Fig. 2D).
A. Western blot og kvantifisering av H2AX DNA skade reparasjon etter forbehandling av 10 uM genistein og /eller 10 uM HCPT. HP-1α ble anvendt som en kontroll lasting; Resultatene er uttrykt i forhold til kontrollgruppen ved 0 timer. B. Western blot og kvantifisering av ATM Ser 1981 fosforylering etter forbehandling av TCCSUP celler med 10 pM genistein, og /eller 10 uM HCPT i 1 time. C. Representative bilder og kvantifisering av ATM fosforylering og H2AX foci formasjon 30 min etter behandling av TCCSUP celler med en mikrometer HCPT og /eller 10 mikrometer genistein; diskrete foci av ATM autofosforylerings vises antatte områder av dobbelttrådbrudd. D. Identifikasjon av NBS1 avhengige ATM /H2AX interaksjon. TCCSUP celler og BDEC celler ble behandlet med 1 uM HCPT og /eller 10 uM genistein i 1 time med eller uten NBS1 inhibitor, mirin, immunopresipitert med anti-ATM eller anti-NBS1 antistoffer og immunokomplekser ble påvist ved Western blotting. ATM foci økte lineært med dosen etter en time genistein og HCPT behandling. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter; IP: immunoprecipitation, W: Western-blot. *
P
0,05 og **
P
0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. #
P
0,05 og ##
P
0,01 sammenlignet med HCPT; @
P
0,05 og @@ P. 0,01 sammenlignet med genistein
5. ATM hemming nedregulerer NF-kB og induserer apoptose i HCPT- og genistein-behandlede celler
Nivåene av aktivert, fosforylert ATM ble undersøkt i TCCSUP celler. TCCSUP celler behandlet med 1 pM HCPT i 1 time viste en sterk konstitutiv ATM fosforylering, som kunne bli inhibert av ATM siRNA eller de små molekylære spesifikk ATM-inhibitor, KU55933 (fig. 3A). Immunoutfellingsstudier analyser indikerte at ATM siRNA redusert ATM /NEMO bindende i TCCSUP celler; imidlertid, HCPT og genistein kan synergistisk forsterke ATM /NEMO binding (fig. 3B), som indikerte at NEMO spiller en viktig rolle i undertrykkelse av HCPT indusert NF-kB-aktivering. I tillegg ble den synergis styrking av ATM /NEMO bindende i HCPT- og genistein-behandlede celler ledsaget av økt IκBα uttrykk (Fig 3C.) Og redusert IKK1 /2 fosforylering (Fig 3D.); i sin tur, disse forårsaket den økte spaltingen av kaspase 3, caspase 9 og PARP (fig. 3E).
A. Western blot av ATM-fosforylering i TCCSUP celler behandlet med 1 pM HCPT i 1 time transfektert med ikke-tie kontroll (NSC) siRNA, ATM siRNA eller behandlet med ATM-inhibitor, Ku55933 (10 uM, 2 timer). B. Immunpresipitasjon og Western blot av ATM og NEMO i TCCSUP celler transfektert med NSC siRNA eller ATM siRNA, eller behandlet med 10 mm Ku55933, 10 mm genistein og /eller en mikrometer HCPT. IP: immunoprecipitation, W: Western-blot. C. EMSA blot av NF-kB-ekspresjon i TCCSUP-celler ble behandlet med 10 uM genistein, og /eller 1 uM HCPT i nærvær av NSC siRNA og ATM siRNA. D. Western blot av NF-kB, IKK2, IκBα ekspresjon og IKK1 /2 fosforylering i TCCSUP celler behandlet med 10 uM genistein, og /eller 1 uM HCPT i nærvær av NSC siRNA og ATM siRNA, noe som indikerer at genistein og HCPT induserer fosforylering av IKK1 /2 og øke IκBα uttrykk via minibank. E. Western blot av PARP, caspase 3 og caspase 9 spalting i hele cellelysater fremstilt fra TCCSUP celler behandlet med 10 um genistein, og /eller 1 uM HCPT i nærvær av ATM siRNA eller Ku55933. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger, og lignende resultater ble oppnådd i hvert replikat.
6. Genistein dempes HCPT-indusert NF-kB-aktivering og dermed synergi indusert apoptose in vivo
Hvis du vil kontrollere den synergistiske hemmende effekt på vekst av genistein og HCPT i blæren kreftceller, bestemt vi deres effekter i en xenograft modell av SCID mus behandlet med den TCCSUP blærecancercellelinje. Genistein og HCPT oppviste en synergistisk inhiberende effekt på tumorvekst i xenograft (Fig. 4A). Videre tumorer som ble behandlet med HCPT viste NF-kB-aktivering, mens genistein dempes denne aktiverings (Fig. 4B). Redusert aktivering av molekylære IKK1 /2, økt fosforylering av IκBα og økt spalting av caspase 3, caspase 9 og PARP ble observert i tumorer behandlet med genistein og HCPT (fig. 4C).
TCCSU blærekreft celle tumorene fikk etablere i 22 dager, deretter ble dyrene injisert intratumorally med 10 uM genistein og /eller 10 uM HCPT på dag 0 og 7 av behandlingen. A. Vekstkurve av TCCSUP blærekreft xenotransplantater ble behandlet med genistein og /eller HCPT; tumorvolumet er uttrykt i forhold til tumorstørrelsen ved starten av behandlingen. B. EMSA analyse av NF-kB-ekspresjon i xenograft tumorvev fra hver gruppe. C. Western blot analyse av fosforylert IKK1 /2, IKK2, IκBα uttrykk i xenograft tumor vev fra hver gruppe.
Diskusjoner
Genistein regnes for å være et potensielt ideell kjemoterapi agent for blærekreft, som det er naturlig, trygg, med minimale bivirkninger og forholdsvis lave kostnader [20]. Tidligere undersøkelser har vist at soya isoflavon, som er til stede i store mengder soyabønner produkter, kan spille en viktig rolle ved inhibering av tumorigenesis [21]. Det har også blitt vist å indusere celle apoptose via reduksjon av ekspresjon av 32 kDa caspase 3-forløperen og å øke nivåene av det spaltede aktive form av denne caspase [22]. Zhou et al. rapporterte at soyabønner og soya isoflavoner fenoliske konsentrater kan hemme veksten av murine og humane blære cellelinjer in vitro og in vivo på en doseavhengig måte [23]. Tidligere undersøkelser viser at den synergistiske hemmende effekt av genistein og camptothecin i livmorhalskreft, ovarialcancer og mus fibroblast celler resulterte fra deres hemming av NF-kB trans og induksjon av G2 /M cellesyklus og apoptose [16].
Enten genistein kan bevisst blære celler til camptothecin behandling er ikke undersøkt tidligere. I denne studien ble genistein og HCPT funnet å hemme veksten av flere blærecancercellelinjer og primære BDEC blæren epitelisk cellelinje (Fig. 1A). Genistein og HCPT synergistisk og doseavhengig inhibert celleoverlevelse (Fig. 1B), induserte G2 /M cellesyklus-stans (fig. 1C) og apoptose (Fig. 1D) i TCCSUP blærecancercellelinje og BDEC blære epitelceller. Med hensyn til den underliggende mekanisme, induksjon av dose-avhengig synergistiske DNA-skade av genistein og HCPT og deres inhiberende virkning på DNA-skadereparasjonsprosessen ble observert i opptil 24 timer, sammenlignet med genistein eller HCPT behandling alene (Fig. 2A) . Som tidligere rapportert, kan begge HCPT [24] og genistein [25] direkte å inhibere DNA topoisomerase I. Vi hypotese at induksjon av DNA-skade ved HCPT og genistein er på grunn av deres hemming på DNA topoisomerase og dermed deres effekt på dannelsen av replikasjonsgaffelen, som krever videre undersøkelser.
Deretter undersøkte vi nedstrøms signaleffekter av genistein- og HCPT-indusert DNA skade å bestemme hvordan synergis induksjon av ATM fosforylering er relatert til deres pro-apoptotisk effekt. ATM-kinase er en viktig regulator som er aktivert ved DNA-skade [26]. Det har blitt rapportert å være sterkt korrelert med celle apoptose i flere kreftceller. Zuco et al. rapporterte at camptothecin-derivatet, ST1968, kan indusere apoptose via aktivering av ATM [27]. Kawakami et al. rapporterte at doxorubicin kan indusere apoptose i A549 lunge adenokarsinomceller av ATM-aktivering [28]. I denne studien ble det funnet at en kombinert behandling med genistein og HCPT synergistisk indusert ATM Ser 1981 fosforylering (fig. 2B) på steder av DNA-skade. I celler behandlet med genistein og HCPT, inhibering av ATM ved dets spesifikke inhibitor, Ku55933, hemmet fosforylering av ATM og H2AX, og dermed hemmet deres ko-lokalisering (Fig. 2C).
NBS1 har vist seg å være det bærende element av MRE11 /RAD50 /NBS1 komplekset, som danner umiddelbart etter en DNA DSB skjemaer for å rekruttere relaterte proteiner for å reparere skadede DNA-områder [29]. ATM og NBS1 både bind til H2AX, et stillas protein i områder av DNA-skader. Som tidligere beskrevet [30], fant vi at evnen til genistein og HCPT til synergi indusere DNA skader i blæren kreftceller via minibank aktivisering var avhengig NBS1, som NBS1 inhibitor mirin spesifikt opphevet HCPT- og genistein-indusert ATM /H2AX binding og NBS1 /H2AX binding (fig. 2D). Disse funn indikerte at den synergistiske DNA-ødeleggende effekten av disse to stoffene ble på grunn av deres inhibering av ATM, som er NBS1 avhengig. Fosforyleringen av ATM kan aktivere NF-kB vei via NEMO [31], noe som fører til aktivering og ekspresjon av en rekke pro-proliferative og anti-apoptotiske-genene, og dermed beskytte cancerceller fra apoptose. NEMO er antatt å være en polyubiquitin bindende subenhet, noe som rekrutterer IKK til lineære eller K63-koblede polyubiquitin stillasene som dannes som en konsekvens av reseptor-initierte signaleringshendelser [32]. Derfor, etter behandling med DNA-toksiske stoffer, for eksempel HCPT, DSB indusert ATM-aktivering, og den nedstrøms NF-kB-veien aktiveres via NEMO (Fig. 3B). Imidlertid har NF-kB vei har vist seg å beskytte celler fra celle apoptose, noe som kan delvis demper de toksiske effektene av HCPT. I vår forskning, kunne genistein behandling inaktivere NF-kB veien i blærekreft og epitelceller. I sammendraget, etter HCPT behandling, kan DNA-skader indusere ATM fosforylering, som aktiverer NF-kB vei til å beskytte cellene mot apoptose. Imidlertid multiplum protease evne til genistein bidrar til å oppheve HCPT-indusert NF-kB-aktivering [33]. Knockdown av ATM blokkeres fullstendig evnen til HCPT og genistein for å indusere aktivering av NEMO /IKK (fig. 3D) og inhiberte spalting av kaspase 3, caspase 9 og PARP (fig. 3E). Dette indikerte at ATM spiller en sentral rolle i HCPT- og genistein-indusert apoptose.
For å bekrefte synergieffekter av HCPT og genistein, vi utført in vivo xenograft eksperimenter. I xenografter av TCCSUP celler dyrket i SCID-mus, kombinert behandling med HCTP og genistein synergi hemmet tumorvekst (Fig. 4A). Dette intracellulære molekylære hendelsen er i samsvar med tidligere oppdagede funn i blæren celler. HCPT ble vist å aktivere NF-kB, som motvirkes av genistein i SCID-mus (Fig. 4B). Samtidig behandling med disse to legemidlene synergistisk aktivert ATM og inhiberte IκBα (fig. 4C).
Denne undersøkelsen viser at isoflavon, genistein, i betydelig grad kan forsterke effektene av blærecancerkjemoterapi middel, HCPT, både vivo og in vivo. Synergi pro-apoptotiske effektene av disse to stoffene indusere flere DSB sin og forsinke DNA skader reparasjonsprosessen ved å aktivere ATM /NBS1 /NEMO /IKK veien. Men noen aspekter av denne mekanisme gjenstår å bli belyst. For det første gjenstår det ukjent hvorvidt den synergistiske DSB induserende effekt av HCPT og genistein skjer via inngrep med den replikasjonsgaffelen og toposoimerase I. For det andre, det er fortsatt uklart hvordan DSB reparasjon prosessen er forsinket, hvorvidt dette er gjennom hemming av homologe rekombinasjon, eller inhibering av ikke-homologe ende sammenføyning. For det tredje, er rollen til den synergistiske inhibering av NBS-en aktivering med HCPT og genistein i misdannelse av MRN komplekset krever videre undersøkelse. Til slutt, er genistein et velkjent botanisk østrogen og østrogen er blitt vist å bli uttrykt i blære overgangs celle kreft, og det var negativt korrelert med tumor klasse [34]. Enten østrogen effekt av genistein er korrelert med synergistisk veksthemmende virkning gjenstår å bli utforsket i fremtiden.
I konklusjonen, denne studien viser at genistein kan bevisst blærekreft cellelinjer til HCTP, som fører til en synergistisk dose -avhengig hemming av spredning og en induksjon av cellesyklus og apoptose. Genistein og HCTP indusere dobbelttrådete DNA pauser, som fører til den synergistiske aktivering av ATM, demper NEMO /NF-kB /IKK /caspase signaltransduksjon, og dermed induserer apoptose både in vitro og in vivo. Genistein kan også motvirke HCPT-indusert NF-kB-aktivering vei, og således dempe anti-apoptotiske virkning av NF-kB vei, som oppsummert i fig. 5. Disse funnene tyder på at selv om de underliggende mekanismene krever videre utforskning, kan samtidig administrering av HCTP og genistein være en lovende metode for behandling av human blærekreft.
ATM fosforyleres på steder med dobbel tråd DNA pauser etter NBS1 i nærvær av H2AX fosforylering. Aktivert ATM transporteres til cytoplasma, og aktiverer NEMO, som fosforylerer IKK1 /2. IKK1 /2 aktiveres og ubiquitinizes IκBα, som fører til IκBα degradering. Dette stimulerer frigjøring og transport av NF-kB til kjernen, hvor det binder seg til DNA, aktiverer caspase cleavage og initierer apoptose.
Takk
Vi takker Dr. Claudia Buehnemann ( university of Oxford, UK) for henne utmerket teknisk assistanse.
