Abstract
Bakgrunn
Lungekreft er den ledende dødsårsaken blant maligniteter over hele verden. Forstå sin biologi er derfor av avgjørende betydning for å bedre pasientens prognose. I motsetning til ikke-neoplastiske vev, kreftceller utnytte glukose hovedsakelig for produksjon av basis cellulære moduler «(dvs. nukleotider, aminosyrer, fettsyrer). I kreft, Malic enzym (ME) og ATP-citrate lyase (ACLY) er viktige enzymer som knytter aerob glykolyse og syntesen av fettsyrer og kan derfor være av biologisk og prognostisk betydning i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
Materiale og metode
ME og ACLY uttrykk ble analysert i 258 NSCLC i sammenheng med klinisk-patologisk parametere inkludert pasientens overlevelse.
Resultater
Selv om samlet uttrykk for både enzymer korrelerte positivt, ble ACLY assosiert med lokal tumorstadiet, mens ME korrelert med forekomst av mediastinale lymfeknutemetastaser. Unge pasienter overekspresjon ACLY og /eller ME hadde signifikant lengre total overlevelse. Dette viste seg å være en uavhengig prognostisk faktor. Dette står i kontrast eldre NSCLC pasienter, i hvem overekspresjon av ACLY og /eller ME ser ut til å forutsi det motsatte.
Konklusjon
I NSCLC, ME og ACLY vise forskjellige enzymuttrykk knyttet til lokal og mediastinale spredning . Viktigst, vi har oppdaget en invers prognostisk effekt av ACLY og /eller ME overekspresjon hos yngre og eldre pasienter. Det kan derfor forventes at behandling av NSCLC spesielt hvis rettet mot metabolske veier, krever ulike strategier i ulike aldersgrupper
Citation. Csanadi A, Kayser C, Donauer M, Gumpp V, Aumann K, Rawluk J , et al. (2015) prognostisk verdi av Malic enzym og ATP-Citrate lyase i ikke-småcellet lungekreft av Unge og eldre. PLoS ONE 10 (5): e0126357. doi: 10,1371 /journal.pone.0126357
Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
mottatt: 26 desember 2014; Godkjent: 01.04.2015; Publisert: 11. mai 2015
Copyright: © 2015 Csanadi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er tilgjengelig i papir og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. forfatterne erkjenner støtte fra denne studien av Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB850. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Til tross for store fremskritt i medisinsk behandling, prognose av lungekreftpasienter er fortsatt dårlig med en 5-års overlevelse varierer mellom 7,9% og 16,5% [1, 2].
Ved å vise at pasienter har nytte av ulike kjemoterapiregimer avhengig på histologisk subtype, Scagliottti avskaffet dogme til behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) som en oncologically homogen gruppe [3]. Dermed trenger de store NSCLC undergrupper, adenokarsinom (LAC), plateepitelkarsinom (SCC) og store cellekreft (LCC) ikke bare vise ulike histologiske mønstre, men presentere konkrete biologiske og molekylære funksjoner, også. En bedre innsikt i disse forskjellige egenskaper vil bidra til å lede personlig terapi. I denne sammenheng, metabolske forandringer assosiert med malign cellulær transformasjon er av sentral viktighet.
I flere tiår, er det kjent at ondartede svulster til overdreven laktat selv i nærvær av tilstrekkelig oksygen (Warburg virkning) [4]. Men mekanismene bak dette fenomenet er ikke fullt ut forstått. Ondartede celler virker med metabolsk autonomi, og glukose, dets metabolitter, så vel som glutamin er ikke bare energikilder. De tjener også som grunnleggende bygge enheter via generasjon av nøkkelmolekyler som trengs for mobilnettet og dermed ondartet svulst vekst [5, 6].
Som enzymer av glukosemetabolismen representerer en felles nedstrøms endepunkt for ulike tumor driver mutasjoner, de kunne være lovende mål for nye kjemoterapeutika, for [7]. Blant disse enzymene, ATP-citrate lyase (ACLY) og eple enzym (ME) er to nøkkelspillere: ME fungerer som kilde til reduktive ekvivalenter i svært cataplerotic ondartede celler. ACLY bygger en fysiologisk shunt mellom glukose metabolisme og fettsyrer [6].
Vi har derfor analysert uttrykk mønstre av disse to enzymer for å belyse deres tilknytning til klinisk-patologiske funksjoner og deres biologiske innvirkning på pasientens overlevelse i NSCLC . Våre resultater viser tydelig at funksjonelle metabolske endringer i NSCLC er komplekse, varierer i histologiske subtyper og forutsi ulike utfall avhengig av pasientens alder.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studien er godkjent av University Medical Center Freiburg (etiske komité University Medical Center Freiburg, EK 10/12). Pasient relatert data er pseudonymized og resultater oppnådd med denne studien ikke påvirke pasientens behandling. Arkivert materiale hadde blitt brukt i minst tre år etter første diagnosen. Ved å signere behandling kontrakten med University Medical Center Freiburg, samtykker hver pasient som hans /hennes pseudonymized vev (e) kan være mistanke til retrospektive forskning forsøk ikke å forstyrre eller påvirke nåværende behandlingsalternativer. Den etiske komiteen av University Medical Center Freiburg dermed godkjent at ingen selvstudium særskilt samtykke fra hver enkelt pasient måtte hentes.
Cohort
258 pasienter som lider av NSCLC ble inkludert i denne studien. Pasientene gjennomgikk kirurgisk behandling mellom 1990 og 2007 (Department of Thoracic Surgery, University Medical Center Freiburg, S1 datasett) og hadde ikke fått neoadjuvant terapi. Fiksering, innbringende og parafin embedding ble utført i henhold til rutinemessige protokoller. Alle krefttilfeller ble reklassifisert i henhold til gjeldende klassifiseringssystem [8], iscenesettelse ble revurdert i samsvar med den nyeste UICC klassifisering [9]. Tissue multi arrays (TMA) ble konstruert med en kjernediameter på 2 mm. Fra alle prøvene tre TMA-kjerner ble tatt fra forskjellige steder for å unngå skjevhet fra intratumoral heterogenitet. En TMA av 36 tilsvarende ikke-neoplastiske lungevev fungerte som kontrollgruppe. (S1 Tabell: oppsummering av klinikk-patologiske data)
Immunohistochemistry og scoring
Heat-indusert antigen henting ble utført ved pH 9,0 for ACLY og ved pH 6,0 for ME.. Primær antistoff inkubasjonstid var 30 minutter (ACLY: 1: 400, cellesignalisering Technologies 4331S, ME: 1: 2000 fortynning, Clone 3H5, Abnova Biozol). Visualisering ble utført ved alkalisk fosfatase med Fast Red-type kromogen (DAKO REAL K5005) og pepperrotperoksidase med diaminobenzidin basert kromogen (DAKO FLEX EnVision) for ME og ACLY hhv. Nuclear kontra ble gjennomført med hematoksylin (Mayers surt haemalaun, Waldeck, katalog nr. 1A-552). Den DAKO Autostainer plattformen ble brukt til farging prosedyrer.
For begge immunhistokjemiske flekker, ACLY og ME, protokoller ble validert for spesifikk farging av utelatelse av de primære antistoffer. Disse valideringsprosedyrer ikke vise uspesifikke kromogen reaksjoner.
Enzyme uttrykk ble ansett positiv, hvis spesifikk cytoplasma farging ble oppdaget. For ACLY ble bestemt atom positivitet også vurderes. Immunhistokjemisk scorings fulgt tidligere beskrevet protokoller [10, 11] og ble vurdert i analogi til internasjonalt aksepterte scoring av prediktive markører [12, 13]. Fargeintensitet ble evaluert semi-kvantitativt ved hjelp av en 4-lei scoring system (figur 1). Prosentandelen av positive tumorceller, ble bestemt ved å betrakte alle positive tumorceller i forhold til deres absolutte tall. Prosenttallene ble avrundet til neste desimal. Kjerne- og cytoplasmatiske uttrykk for ACLY ble evaluert separat
(A) -. (D) Spesifikk ACLY utfoldelse kunne påvises i kjernen, eller i cytoplasma. (EN); svulstvev uten særskilt ACLY farging intensitet poengsum = 0; (B) svak spesifikk cytoplasma ACLY farging intensitet poengsum = 1; (C) moderat stillingen nukleær farging ACLY intensitet = 2 og moderat cytoplasmisk farging ACLY-intensitet = 2; (D) sterk cytoplasmatisk farging ACLY-intensitet = 3, er i tillegg moderat nukleær farging til stede; (E) – (H) Spesifikk cytoplasmisk ekspresjon av ME, (E) tumorvev uten spesifikk cytoplasmatisk farging ME-intensitet = 0 (F); svak spesifikk cytoplasma ME farging intensitet poengsum = 1 (G); moderat cytoplasmatisk stillingen ME farging intensitet = 2 (H) og med sterk spesifikk cytoplasmatisk farging ME-intensitet = 3 (E). (Forstørrelse, 20x)
statistikker
For alle statistiske analyser gjennomsnittsverdier for de tre TMA-kjerner av hvert tilfelle ble brukt. Forskjeller i enzymet uttrykk ble evaluert av ikke-parametriske tester.
Survival analyse inkludert Kaplan-Meier-kurver og log-rank tester. For multivariate analysene ble Cox-regresjonsmodeller benyttes. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 21.0 programvarepakke. Signifikansnivå ble satt til 5% (dvs.
p
0,05). Det generelle nivået av betydning har blitt justert for multippel testing med Benjamini-Hochberg metoden [14] (S2 tabell).
Resultater
ACLY og ME er oppregulert i NSCLC
ACLY ekspresjon i tumorvevet ble detektert i begge, cytoplasma og cellekjernen (figur 1), mens ME påvises bare i cytoplasma (fig 1). Immunhistokjemisk enzymet uttrykk var betydelig høyere i tumorceller (ACLY Nucl .: 19,92 +/- 21,57; ACLY cytopl .: 22,23 +/- 21,57, ME: 52,49 +/- 37,86) enn i tilsvarende ikke-neoplastiske lungevev (ACLY Nucl. : 16,57 +/- 16,75; ACLY cytpl .: 11,43 +/- 20,97, ME: 9,53 +/- 10.50;
p
0,001)
ME, men ikke ACLY er forskjellig uttrykt i histologiske NSCLC subtyper
Som differensiering mellom LAC og SCC av lungen er av terapeutisk betydning, analyserte vi uttrykk mønstre i forhold til disse to histologiske NSCLC subtyper. ME uttrykk var høyere i SCC forhold til LAC (
p
0,001). ACLY viste ingen signifikant sammenheng med histologisk subtype. Videre ble en signifikant høyere uttrykk bare for ME funnet hos røykere sammenlignet med ikke-røykere (
p
= 0,012).
ACLY men ikke ME uttrykk er knyttet til lokal tumorstadium
Analysere immunohistologiske mønstre ACLY og ME i sammenheng med lokale tumor etapper, dvs. PT, observerte vi at ACLY uttrykk var betydelig lavere i avanserte PT-etapper. Selv om en signifikant positiv samvariasjon av ME og ACLY ble funnet (nuclear ACLY-ME: korrelasjonskoeffisient = 0,179,
p
0,001; cytoplasma ACLY-ME: korrelasjonskoeffisient = 0,155,
p
= 0,001), fikk ME uttrykk ikke viser en sammenheng med lokale tumor etapper. Analoge resultater ble observert for ACLY uttrykk i sammenheng med metriske tumorstørrelse (ACLY cytoplasma: korrelasjonskoeffisient -0,135,
p
= 0,003; ACLY atom: korrelasjonskoeffisient: -0,144,
p
= 0,001 ; ME: korrelasjonskoeffisient = 0,006,
p
= 0,887). Mens infiltrasjon av visceral pleura bidrar også til lokal tumorstadium, ble ingen statistisk signifikant korrelasjon observert om pleural invasjon (ACLY cytoplasma:
p
= 0,186; ACLY atom:
p
= 0,532; ME :
p
= 0,971)
ME, men ikke ACLY uttrykk er assosiert med mediastinale metastatisk hendelser
for å undersøke forholdet mellom ME og ACLY uttrykk med systemisk svulstvekst, vi. separat analysert NSCLC av nodal positive pasienter i sammenheng med plasseringen av lymfeknutemetastaser. Tilstedeværelsen av mediastinale lymfeknutemetastaser var signifikant korrelert med høyere uttrykk av ME i primær svulstvev (
p
= 0,041), men ikke fra ACLY (cytoplasma:
p
= 0,511; atom:
p
= 0,446). Denne foreningen var spesielt sterk i LAC (ME:
p
= 0,030)
Overuttrykte enten ME, ACLY eller begge er en uavhengig prognostisk faktor
For å unngå statistisk skjevhet. , middelverdier av ME og ACLY uttrykk ble brukt for dikotomisering. I den samlede analysen ingen signifikant korrelasjon mellom ME og ACLY overekspresjon med pasientens overlevelse ble funnet. Lignende resultater ble oppnådd i subgruppeanalyser henhold til røykevaner, kjønn, histologisk gradering, PT-eller pn-etapper. Alder stratifisering ble utført ved hjelp av median alder (65 år) ved NSCLC diagnose. Ingen signifikant sammenheng mellom alder og pt, pn eller generelle UICC scenen ble oppdaget. Hos unge pasienter, kjernekraft ACLY overekspresjon viste seg å være forbundet med en gunstig total overlevelse (
p
= 0,029), mens dette ikke var tilfelle hos pasienter over 65 år (
p
= 0,626 ). ME overekspresjon i disse to alders undergrupper viste bare en statistisk trend hos eldre pasienter (
p
= 0,093). Unge pasienter med overekspresjon av ME eller kjernefysisk ACLY eller begge i sine svulster, hadde en signifikant lengre total overlevelse sammenlignet med de uten overekspresjon av disse enzymene (
p
= 0,007; figur 2). Multivariat analyse, som inkluderte UICC scenen, det eneste ekstra prognosticator i denne pasientgruppen, dette viste seg å være en uavhengig prognostisk faktor (
p
= 0,002, Tabell 1). På den annen side, overekspresjon av den ene eller begge av de to enzymene resulterte i kortere total overlevelse hos eldre pasienter (fig 2,
p
= 0,058).
A) Overekspresjon av ACLY er forbundet med et bedre utfall hos unge pasienter, men ikke hos eldre pasienter. B) ME overekspresjon viser en statistisk trend mot en dårligere total overlevelse hos eldre pasienter. C) Unge pasienter med tumorer avslørt enten ACLY og /eller ME overekspresjon hadde en signifikant lengre total overlevelse sammenlignet med de uten overekspresjon av enten enzym. Men i eldre pasienter overekspresjon av enten ACLY og /eller ME kan være forbundet med dårligere total overlevelse.
Diskusjoner
På grunn av sin høye forekomst og dødelighet, lungekreft fortsatt er fortsatt en av de store helse byrder, over hele verden. Det er derfor av avgjørende betydning for å bedre forstå sin biologi for å utvikle nye egnede behandlingstilbud.
Den metabolske bryteren av kreftceller til aerob glykolyse er et velkjent arrangement. På den ene siden, tjener det til å lette opptak og innlemmelse av næringsstoffer i grunnleggende celle byggeklosser. På den annen side, resulterer i produksjonen av laktat, noe som letter metastasedannelse og terapiresistens [15, 16].
I flere ondartede tumorer det har vist seg at ACLY er ikke bare elementær for de-novo fettsyresyntese [17], men også dens hastighetsbegrensende trinnet [18-21]. Som en av de viktigste enzymer fra de-novo-syntesen av fettsyrer, ACLY genererer cytosoliske acetyl-koenzym A (acetyl-CoA) [22, 23] og oksaloacetat. Den sistnevnte blir redusert til malat ved malatdehydrogenase. Cytosoliske isoformen av eplesyre enzym omdanner malat til pyruvat [24]. Pyruvat som ikke er i skytteltrafikk inn mitokondrie for å generere oksaloacetat, er videre omdannes til laktat [6]. ACLY og ME uttrykk kan derfor endres i maligne tumorceller sammenlignet med ikke-neoplastiske vev. Sammenligning av ikke-neoplastisk lunge og NSCLC vev, fant vi en statistisk signifikant økning av begge, ACLY og ME uttrykk innenfor neoplastiske celler. Dette er i overensstemmelse med andre funn vedrørende endret karbohydratmetabolismen hos kreft [10, 11, 25-27]. I vår kohort, ME og ACLY uttrykk, kjernekraft samt cytoplasma, viste en positiv korrelasjon. Det faktum at korrelasjonskoeffisientene er ganske små kan reflektere komplekse sammenhengene mellom flere metabolske enzymer samt høy histomorphological heterogenitet av NSCLC. Sammenligning av immunhistokjemiske uttrykk mønstre av ME og ACLY støtter videre denne uttalelsen som eneste ME-uttrykk signifikant forskjellig mellom LAC og SCC. Denne typen differensial ekspresjonsmønstre i NSCLC-undertyper har også vist seg for andre enzymer i forbindelse med endret cellulær metabolisme kreft [10, 11, 28].
Siden SCC er ofte funnet i storrøykere og LAC er såkalte typisk ikke-røyker karsinomer, er betydelig høyere uttrykk av ME i svulster hos pasienter med røyking historie ikke overraskende. Dette kan være på grunn av forskjellige hypoksiske tilstander av svulster og /eller pasienter som fører til forskjellige metabolske tilstander i NSCLC og mest sannsynlig i SCC forhold til LAC også. Flertallet av røyking forbundet NSCLC besitte p53-mutasjoner, og således er frekvensen av p53-mutasjoner i SCC høyere sammenlignet med LAC [29]. Nylig, Jiang kunne bekrefte at ME uttrykk er regulert av p53. Ifølge deres funn, er p53 ansvarlig for å nedregulere ekspresjon ME [30]. Disse funnene er i god samsvar med vår, at ME ikke er bare overuttrykt i NSCLC forhold til tumor gratis lungevev, men også at ME uttrykket er høyere i SCC forhold til LAC og hos røykere sammenlignet med ikke-røykere.
Slående til oss var at ACLY og ME avdekket ulike uttrykk mønstre avhengig av lokal eller mediastinale tumor spredning. Mens ACLY var negativt korrelert med lokal tumor forlengelse målt ved hjelp av PT-fasen, i tillegg til beregning tumorstørrelse, ME bare viste en signifikant korrelasjon med mediastinum metastatiske arrangementer i forhold til hilar lymfeknutemetastaser (PN1 vs pN2 /pN3). Endringer i tumor stoffskiftet, og derfor ser ut til å være komplekse og kan variere ikke bare i histologiske undertyper, men også i henhold til lokal eller systemisk tumorspredning.
Videre er det i nyere forskningsresultater, flere funksjoner i ACLY ved siden engasjement i glukosemetabolismen har blitt oppdaget: ACLY er også en nøkkelspiller i histone acetylering. Disse funnene tyder på en sammenheng mellom vekstfaktor endringer i kreft metabolisme og genekspresjon som er realisert ved ACLY [31]. Analogt med Wellen, Londono Gentile bare nylig publisert som ACLY i det minste delvis regulerer DNA-metyltransferase-1 (DNMT1) [32]. Ulike lokalisering av ACLY kan derfor gjenspeile ulike aktiviteter innenfor cellen, er f.eks cytoplasma ACLY hovedsakelig involvert i kreftcelle metabolisme, mens kjernekraft ACLY hovedsakelig involvert i regulering av genekspresjon [31, 33]. Av denne grunn, vurderes vi forskjellige lokaliseringer av ACLY, dvs. atom og cytoplasmisk, hver for seg. I samsvar med våre resultater, migita viste at ACLY var signifikant høyere uttrykt i LAC sammenlignet med ikke-neoplastisk lungevev [22]. I sin publikasjon, ACLY var også en prognostisk faktor, mens de viste at høye nivåer av ACLY var assosiert med et dårligere resultat [22]. Vi kunne ikke reprodusere dette funnet av migita. Men i motsetning til sine resultater, kjerne ACLY overekspresjon var av betydelig fordel hos unge pasienter med vår kohort. Sammenlignet med migita, inkludert vi ikke bare LAC, men også SCC samt LCC og immunhistokjemisk analyse av ACLY ekspresjon ble undersøkt ikke bare for farging intensitet, men også i henhold til den fraksjon av positive celler og med hensyn til subcellulære lokalisering av ACLY. I tillegg til disse analytiske forskjeller, migita undersøkt ekspresjonen av fosforylert ACLY, mens vårt antistoffet er rettet mot ACLY uansett dets fosforylering status.
Videre er det i vårt detaljert undergruppe analyser, kunne vise at pasientens alder kan også påvirke NSCLC biologi. Mens høye nivåer av enten ACLY og /eller ME var en god prognostisk faktor hos pasienter yngre enn 65 år, ble en statistisk trend til det motsatte påvist hos eldre pasienter. Dette kan tyde på ulike endringer i tumor stoffskiftet og enzymfunksjon. Flere metabolske forandringer er innblandet med høy alder, for eksempel øke hypoksi og høyere forekomst av diabetes mellitus type 2. I en stor kohortstudie ble type 2 diabetes mellitus forbundet med en høyere risiko for å utvikle flere typer kreft, inkludert lungekreft [34 ]. I denne sammenheng både, ACLY og ME har vist seg å være viktig for glukose relatert insulin sekresjon [24]. Ved det faktum, at forekomsten av type 2 diabetes, så vel som generalisert hypoksi på grunn av lungefunksjon er høyere hos eldre pasienter, våre funn av å endre virkningen av ACLY og ME enzymatisk montering i NSCLC kan være funksjonelt støttes. Mangfold av NSCLC i ulike alders populasjoner er kjent for genetiske avvik og insidensen av driver mutasjoner [35, 36]. Dermed våre funn, at endringer av metabolske enzymer kan være av forskjellig innflytelse på kreft biologi ved NSCLC ytterligere støtte at lungekreft oppstår hos unge pasienter kan være biologisk og genetisk forskjellig fra eldre pasienter.
In vitro og in vivo studier indikerer at nye farmakologiske midler som inhiberer ACLY kan føre til betydelig reduksjon i cellulære og tumorvekst [22, 33, 37, 38]. Siden våre resultater viser at overekspresjon av ACLY og /eller ME hos pasienter over 65 år har en tendens til å ha en dårligere prognose, de antar at eldre pasienter kan profittere mest fra disse ACLY hemmere.
Avslutt, uttrykk mønstre av de metabolske enzymer ACLY og ME er av forskjellig biologisk effekt på overlevelse hos NSCLC pasienter. Mens hos unge pasienter overekspresjon av enten ACLY eller ME er et tegn på en gunstig total overlevelse, pleier det å ha motsatt effekt hos eldre pasienter. Med utviklingen av nye hemmende legemidler rettet mot ACLY våre resultater støtte nye behandlingstilbud med spesielt fokus på alderen NSCLC pasienter.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Oppsummering av klinisk-patologiske data
doi:. 10,1371 /journal.pone.0126357.s001 plakater (docx)
S2 Table. Oppsummering av de presenterte relevante statistiske testresultater justert for multippel testing
doi:. 10,1371 /journal.pone.0126357.s002 plakater (docx)
S1 datasett. Komplett datasett
doi:. 10,1371 /journal.pone.0126357.s003 plakater (XLS)
Takk
Vi takker Nicola Bitter for henne teknisk støtte og gi råd. Vi erkjenner støtte fra denne studien ved Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB850 og av svulsten bredden av Comprehensive Cancer Center Freiburg (CCCF).
