Abstract
Tykktarmskreft er en dødelig sykdom som påvirker millioner av mennesker over hele verden. Nåværende behandlings utfordringer omfatter forvaltning av sykdomsbyrden samt forbedringer i deteksjon og målretting av tumorceller. For å identifisere sykdomsstats spesifikk overflate antigen underskrifter, kombinert vi fluorescerende celle barcoding med høy gjennomstrømming flowcytometrisk profilering av primære og metastatisk tykktarmskreft linjer (SW480, SW620, og HCT116). Vår multiplex teknikken gir forbedringer i forhold til konvensjonelle metoder ved å tillate den samtidige og rask screening av kreftceller med redusert innsats og kostnader. Metoden benytter et protein-nivå analyse med kommersielt tilgjengelige antistoffer på levende celler med intakt epitoper å oppdage potensielle kreftspesifikke mål som kan bli ytterligere etterforsket for sin kliniske nytte. Multipleksede antistoff arrays kan lett brukes til andre krefttyper eller patologier for oppdagelse baserte tilnærminger for å målrette identifikasjon
Citation. Sukhdeo K, Paramban RI, Vidal JG, Elia J, Martin J, Rivera M, et al . (2013) Multiplex flowcytometrisystemer Barcoding og antistoff Arrays Identifiser overflateantigen Profiler av primær eller metastatisk tykktarmskreft cellelinjer. PLoS ONE 8 (1): e53015. doi: 10,1371 /journal.pone.0053015
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 19 juni 2012; Godkjent: 22 november 2012; Publisert: 07.01.2013
Copyright: © 2013 Sukhdeo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Tumor Foundation i USA, hjernesvulst Society, Goldhirsh Foundation, og James D. McDonnell Foundation Pediatric Brain. Dette arbeidet ble også finansiert av National Institutes of Health gir CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), Pathway to Independence Award CA157948 (JDL), Case Western Reserve Medical Scientist Training Program T32 GM007250 (KS) og Nasjonal Research service Award, National Cancer Institute F30 CA165857 (KS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: RIP, JGV, JE, JM, CTC, og RB er betalt ansatte i BD Biosciences. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft er blant de vanligste kreftformene i form av både kreftforekomst og kreft relaterte dødsfall i vestlige land [1]. Tidlig stadium kreft i tykktarmen kan man klart ved kirurgisk reseksjon; imidlertid, er metastatisk sykdom ofte ildfast til behandling og ansvarlig for de fleste av sykelighet og dødelighet. Klinisk beslutningsprosesser styres av det amerikanske Joint Committee on Cancer TNM (tumor-node-metastase) staging som er ufullkommen for prognose og ikke forutsi respons på behandling. En kritisk er behov for å identifisere objektive markører for kreft som kan brukes for tidlig oppdagelse, prognostication, intervensjon, og /eller målretting av kreftceller. Som et eksempel, har tumor-assosierte antigener (TAA) blitt benyttet for påvisning av sirkulerende tumorceller (CTCs) i blodstrømmen, så vel som disseminerte tumorceller (DTC) i benmargen med muligheten til å overvåke tumorbyrden, forutsi risiko av progresjon, og måle kjemoterapi respons. Disse teknologiene omfatter klinisk-godkjente produkter som CellSearch ™ (Veridex) som utnytter immundeteksjon av CTCs på grunnlag av epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM) membran uttrykk [2]. Celleoverflate TAA spesielt er også verdifulle fordi de er tilgjengelige for systemisk-leverte målsøkende molekyler (for eksempel antistoffer, aptamerer, etc.) som kan brukes til å levere bioaktive egenvekt er blokksignalering, eller aktivere antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet.
Arbeidet med å identifisere TAA i tykktarmskreft og andre krefttyper har støttet seg på et mangfold av teknikker, hver med sitt eget sett med fordeler og begrensninger [3], [4]. Genekspresjon microarray profilering eller tumor-avledet cDNA uttrykk bibliotek med pasientsera (f.eks Serologisk Identifikasjon av rekombinant Uttrykt Clones, Serex) er basert på RNA-nivå uttrykk. Disse tilnærmingene kan være problematisk fordi post-transkripsjonell (f.eks mirnas) og posttranslasjonelle mekanismer for regulering betydelig innflytelse over den faktiske mengden av protein besatt av hver celle sammen med signaleringsfunksjonen i cellen [5], [6]. Det vil si at celler med lav-nivå-transkripter kan inneholde uforholdsmessig høye nivåer av settes protein (f.eks lange halveringstider) og vice versa. Massespektroskopi og protein microarrays arrays bruke hel-celle eller fraksjonlysatene fra tykktarm kreft celler til å oppdage forskjellig uttrykt TAA. Disse protein-baserte metoder for å påvise TAA kan påvirkes av den iboende forstyrrelse av det naturlige protein conformation under tillagingen, dominerende fremstilling av intracellulære proteiner, og begrensede molekyl ressurser (dvs. kommersielt tilgjengelige antistoffer) for raskt å vurdere potensialet i kandidat biomarkører.
for å identifisere TAA, utførte vi en high-throughput immunophenotypic screening av primære og metastatisk kreft i tykktarmen ved hjelp av et antistoff array som inneholder nær komplett dekning av klyngen av differensiering (CD) overflatemolekyl familien så vel som mange andre vanlige overflateantigener . Vi har også multiplekses antistoffet matrisen skjermen ved bruk av fluorescerende celle strekkoding. Vår strategi er identifisert omfattende overflateproteinprofiler inkludert TAA deles på tvers av tumorprøver samt de som var sykdomstilstand spesifikke. Den pan-tumor TAA, inte α6 (CD49f), ble validert for å ha et uttrykk som ligner profilen til EpCAM, demonstrere potensialet i denne teknologien for å identifisere kandidat kreft biomarkører som kan brukes for å begrense påvisning av ondartede celler, inkludert CTCs /DTC.
Resultater
Multiplex barcoding i kombinasjon med antistoff rekke screening
To primære adenokarsinom (SW480, HCT116) og en metastatisk (SW620) tykktarmskreft cellelinjer ble valgt for vår studie. Alle tre linjer har en epitelial opprinnelse og deres tumorbiologi har blitt godt studert i litteraturen. SW480 ble avledet fra en primær adenokarsinom i tykktarmen fra en pasient som senere residiv med utbredt mesenteriske lymfeknuter metastaser som ble brukt til å utlede den SW620-cellelinjen [7]. Bruken av en pasient-matchet sett av cellelinjer reduserer genetisk variasjon og tillater en mer kontrollert sammenligning av de molekylære endringer følgende metastatisk progresjon [8], [9].
Multipleksing av alle tre prøver for samtidig merking og analyse ble oppnådd gjennom fluorescerende celle barcoding. I denne teknikken blir cellene merket med en atskillende intracellulær fargestoff og deretter slått sammen før antistoffmerking. Identiteten av hver cellelinje blir ført i strømningscytometer på grunnlag av fluorescens fra enten fiolett (Horizon Proliferation Fargestoff, VPD450) eller blå (karboksyfluorescein succinimidylester; CFSE) eksitasjon lasere, mens den røde laseren er reservert for påvisning av Alexa647 på de sekundære antistoffer. Den SW480-cellelinjen ble strekkode ved merking med VPD450 mens SW620 celler ble umerket før pooling begge cellelinjer til en enkelt blandet populasjon (figur 1, se Materialer og Metoder). Den tredje cellelinje, HCT116, ble ved hjelp av strekkode CFSE og også blandes for å generere et enkelt basseng består av tre forskjellige cellelinjer. Deretter påføres kombinasjonen av celler på en antistoff-matrise bestående av 242-antistoffer og 9 isotype kontroller individuelt tildelte over tre 96-brønners plater (figur 1). Antistoffene som inngår i rekken gir dekning av nesten hver klynge av differensiering (CD) molekyl, og mange andre vanlige overflateantigener. Som sådan var vi i stand til å undersøke et bredt område av overflateproteiner og generere signaturer for hver tykktarmskreftcellelinje.
De tre cellelinjer ble merket med eller uten intracellulære fargestoff før sammenblanding av cellene i et enkelt basseng . Cellene ble deretter alikvotert i hver brønn for antistoff merking. Innholdet i hver brønn ble deretter behandlet på et strømningscytometer. Identiteten av hver cellelinje ble bestemt på grunnlag av fluorescens-intensitet. De riktige portene ble trukket slik at for simultan analyse for hvert antistoff. Histogrammer for muse-IgM isotype kontroll er vist.
De fleste antistoffer (158/242) var enten fullstendig ureaktive eller bundet til mindre enn 5% av cellene i forhold til den respektive isotype kontroll i alle tre cellelinjer og derfor ikke nærmere undersøkt i forbindelse med denne studien (fullt resultatene vist i figur S1 og tabell S1, S2 og S3). Vi fant 25 antistoffer som reagerte med et flertall ( 50%) av celler i SW480, SW620, og HCT116-cellelinjer (tabell 1 og fig S2). Mange av disse antistoffene nådd nesten fullstendig (mer enn 95%) merking av tumorceller. Som forventet, proteiner relatert til store histokompatibilitetskompleks klasse I (β2-mikroglobulin, HLA-A /A2 /B /C og MIC-A /B) som vanligvis uttrykt på kjerneinneholdende humane celler ble identifisert. Andre TAA ble kategorisert i henhold til kjent funksjon, som identifiserte flere proteiner involvert i ekstracellulær matriks interaksjoner og cellulær adhesjon, slik som flere integrin familiemedlemmer, i samsvar med deres epithelial biologi. Siden a og p inte danne multimæriske trans komplekser med hverandre, er det mulig at co-uttrykk for inte α2 (CD49b) og inte α6 (CD49f) sammen med inte β4 (CD104) kan indikere funksjonelle samspillet mellom disse familiemedlemmer eller delt regulering i tykktarmskreft. Vi har også identifisert flere proteiner med kjent funksjon i cellenes stoffskifte og signal samt andre medierende samspill med adaptive og medfødte immunsystemet. Disse vanlige identifikatorer kunne informere om tumorbiologi eller representere druggable veier til målet tumorceller. Videre, på grunn av sin brede uttrykk på overflaten av ondartede celler, kan de pan-tumorantigener identifisert i denne skjermen være nyttige markører for å lette identifiseringen av CTCs /DTC.
Bioinformatikk analyse
for å prioritere vår liste over TAA som kandidat biomarkører, utførte vi kryss sammenligninger til Oncomine samling av genekspresjon microarray datasett fra tykktarmskreft, samt tilsvarende normalt vev [10]. Som sådan, var vi i stand til å vurdere uttrykk av proteiner identifisert i vår skjerm i forhold til RNA-profiler på tvers av flere etterforskere, pasientpopulasjoner, og eksperimentelle plattformer. Vi fokusert vår undersøkelse av TAA-ekspresjon i normalt tarmvev, normal lever, samt tykktarm adenom og adenokarsinom [11] – [14]. Vi har valgt de gener som var minst to ganger oppregulert (p 0,05) enn normalt vev. Dette raffinert ytterligere vår TAA liste til overuttrykte genene CD44, inte α6 (CD49f), og inte β2 (CD49b) som de mest lovende kandidater (figur 2). Spesielt, uttrykket av disse genene var betydelig høyere i kreft enn i normal leveren, noe som tyder på en mulig terapeutisk vindu for målrettet terapi til overs normalt vev.
Oncomine heatmap analyse i 4 publiserte datasett for uttrykk av tumorantigener som er beskrevet i Tabell 1. Bare de genene som konsekvent ble oppregulert over datasett med p 0,05 vises. Tallene i parentes angir antall prøver analysert. Forkortelser: normal tykktarm, NC; stigende tykktarm, AC; synkende kolon, DC; sigmoid colon, SC; tverrgående kolon, TC (n = 1).
Tumor markør validering
For å validere resultatene fra vår antistoff skjermen for å oppdage kreftceller i pasientprøvene vi har utført immunhistokjemi (IHC) og immunfluorescens (IFC) flekker på arkiverte menneskelige prøver fra normal tarmslimhinnen og primær kreft i tykktarmen samt metastaser fra leveren og lymfeknuter (n = 6 for hver). Vi valgte inte α6 (CD49f) på grunnlag av sin sterke reaktivitet ( 99%) med alle tre kolon kreft cellelinjer i vår skjerm, kjent uttrykk i tarmen, og oppregulering i tumorigenesis [15]. Faktisk, ved IHC, kunne vi påvise integrin α6 farging i tykktarmskreft, så vel som i tilstøtende uninvolved normal slimhinne. Videre må alle lever- og lymfeknutemetastaser viste grin α6 farging, mens det omkringliggende stroma var negativ. Forskjellen i fargeintensitet mellom primær tumor og normal var subtil, men mer uttalt i metastatiske prøver (figur 3). Disse trendene ble også sett av IFC (figur S3) med en distinkt inte α6 antistoff som co-merking celler med epitelial markør EpCAM som en referanse [16] viste at inte α6 lokalisert til alle tykktarm epitelceller i hver prøve analysert (figur S3 ). Disse funnene forsterke anvendeligheten av vår screeningsmetoden for å identifisere TAA som kan brukes for å påvise tumorceller i pasientprøver og /eller terapeutisk målretting
A) H . E (øverst til venstre) og integrin α6 IHC (topp høyre) fra kliniske tykktarmskreft prøver ved lav forstørrelse. Områder med normal slimhinne (N) og tilstøtende primær kolonkreft (P) er vist. Lavere panelene gir høyere forstørrelse felt av inte α6 i normal (til venstre) og tumor (til høyre). B) Representative eksempler på lever og lymfeknutemetastaser. Regionene i tykktarm kreft metastaser (M) er synlig ved H E (til venstre) og tilsvarende flekker med inte α6 (til høyre). Et område på normal leveren (L) er indikert. Alle lymfeknute prøvene inneholdt en høy grad av fibrose rundt lesjon som fortrenges normal lymfoid vev fra synsfeltet. Skala:. 50 mikrometer
Primær versus metastatisk overflateantigen signaturer
Vi neste testet evnen til vår antistoff rekke screening metode for å sammenligne og kontrast overflate underskrifter fra grunnskolen og metastatisk sykdom ved hjelp av SW480 og SW620 cellelinjer, henholdsvis. Overflate profilering identifisert 11 membran-assosierte proteiner som var til stede på i det minste 5% av cellene, og med i det minste to ganger økt celle positivitet i SW620 sammenlignet med SW480 (tabell 2, figur S4, og Tabell S4). CD10 (også kjent som membran metallo-endopeptidase (MME)) hadde høyest fold-endring i uttrykket. Det har enzymatisk aktivitet for å degradere viktige signalmolekyler og er oppregulert i metastatisk melanom [17] (figur 4A). Den økte ekspresjon av CD10 identifisert av antistoffet ble bekreftet ved Western blot, som viser høy grad av protein i SW620-celler, men ikke i SW480 (figur 4B). Interessant, syv av de identifiserte proteinene har kjent roller i immunsystemets funksjon, som tyder på en rolle i immunmodulering i løpet av metastaser (tabell 2). Vi har også funnet 35 proteiner med celle positivitet redusert i det minste to ganger på SW620 celler sammenlignet med SW480 (tabell 3, figur S5, og tabell S4) inkludert flere representanter for proteiner involvert i cellemetabolisme /signalisering, immunsystemsignalering, og cellulær vedheft.
Histogram plott fra antistoff matrise for CD10 antigenet i SW480 (A) og SW620 (B). Rødt indikerer isotypekontrollantistoff mens den blå linjen er farging for CD10. Tallet i øverst til venstre er cellen positivitet. Det er en klar dreining fra en liten skulder befolkningen i SW480 å fullføre bindende i SW620 celler. C) Immunoblotting for CD10 bekrefter sterk endring i CD10 uttrykk.
Uttrykk for stamcellemarkører
For å fullføre vår overflateantigen profilering av disse tykktarmskreftcelle linjer, undersøkte vi ekspresjonen av membran-assosiert kreft stamcelle (CSC) markører. Spesielt, har nyere bevis antydet at metastaser er kolonisert av disse cscs som besitter de funksjonelle evnene til selvfornyelse og multi-avstamning differensiering [18] – [20]. Cscs kan også fungere innenfor tumorer å forplante og /eller vedlikeholde tumorer over tid, og som respons på behandling. Flere grupper har foreslått ulike intracellulære og ekstracellulære identifisere markører for cscs som ofte har immunophenotypic likheter til normale vev stamceller. Viktigere, kan påvisning av cscs være betinget av antistoff binding av post-translasjonell (f.eks glykosylert) epitoper. Tilsetningen av slike deler til peptider ofte kobler transkripsjonsnivåer fra den detekterte antistoffer mengde (for eksempel
Prominin-1 /CD133
transkripter og CD133 (AC133) epitop i koloncancer cscs [21]). Foreløpig studert CSC overflateproteiner i tykktarm kreft inkluderer EpCAM
høy, CD133, CD26, CD166, og CD44, uavhengig eller i kombinasjon [18], [20], [22] – [25]. CD26, et foreslått markør av metastatiske stamceller [20], og CD166 [24] ble inkludert i antistoffet matrisen, og resultatene er gitt i figur S1. Vi utførte standard flerfarget flowcytometri for EpCAM, CD133, og CD44 for å bestemme deres uttrykk individuelt samt dobbel og trippel flekker (tabell 4 og figur S6). Selv om vi ikke teste de funksjonelle stamcelleegenskaper av eventuelle tumorcellepopulasjoner, var vi i stand til å oppdage den varierte uttrykk for stamcelle immunfenotypen markører som spenner fra nær fraværende for å fullføre merking. Disse resultatene indikerer at stamcelle markør immunophenotypes kan avvike sterkt mellom tumor og er ikke alltid begrenset til sjeldne populasjoner. Ytterligere karakterisering av disse populasjonene, utenfor rammen av denne studien, kan bestemme relevansen av disse uttrykk mønstre til funksjonelle fenotyper.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Normal tykktarm og vevsprøver fra pasienter behandlet ved Cleveland Clinic ble oppnådd i henhold til protokoller godkjent av Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB 4134), inkludert skriftlig informert samtykke.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
Menneske tykktarm kreft cellelinjer SW480, SW620, og HCT116 ble alle kjøpt fra American Tissue Type Collection (ATCC) [7], [8], [26]. Celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 50 U /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin på standard vevskulturplater (BD Biosciences) i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. Før analyse ble cellene i log-fase vekst og mindre enn 70% sammenflytende. Løsgjøring av celler fra vevskulturplater ble utført ved anvendelse av TrypLE (Gibco) i henhold til produsentens protokoll (10 minutter ved 37 ° C). Den Papain dissosiasjon kit ble erholdt fra Worthington Biochemical. Levedyktighet av cellene ble kontrollert ved hjelp av trypanblått eksklusjon og funnet å være 98%. Alle celler ble dyrket og behandlet parallelt.
høy gjennomstrømning strømningscytometri-analyse
Internett gjennom strømningscytometri-analyse ble utført på de tre cellelinjene beskrevet ovenfor, ved bruk av et antistoff screening-metode som er utviklet av BD Biosciences [ ,,,0],27]. Antistoff screening ble utført ved anvendelse av BD Lyoplate humane celleoverflatemarkør screening panel (560747) inneholdende lyofiliserte antistoffer i en 96-brønners plateformat ved 0,5 ug /brønn. For strømningscytometri-analyse, ble cellesuspensjoner ble behandlet med DNAse (i 1 ml PBS med Ca
2+, Mg
2+, 100 enheter /ml, 10 pl DNAse arkiv) i 15 minutter ved romtemperatur. Forut for antistoffarging, ble cellelinjer strekkode med forskjellige levedyktighet fargestoffer for samtidig analyse [28]. SW480 celler ble merket med Horizon Violet spredning Dye 450 (BD Biosciences 562 158) i henhold til produsentens protokoll på en mikrometer. HCT116 var merket med CFSE (Invitrogen, C34554) som per produsentens protokoll på en mikrometer. SW620 var igjen umerket og oppdaget på grunnlag av å være VPD450 og CFSE negative. Effektivitet av merking var 99%. Etter passende vasking, ble alle tre cellelinjer blandes og resuspendert i BD Pharmingen Stain Buffer (BD Biosciences) med tilsetning av 5 mM EDTA for å forhindre reaggregering. Celler ble sådd ut i 96-brønners rundbunnede plater (BD Biosciences) på 30.000 celler (10.000 for hver cellelinje) pr brønn for farging. Celleoverflate-farging ble utført med antistoffer rekonstituert med 1 x PBS ved en konsentrasjon på 0,5 ug per test og cellene ble farget direkte på is i 20 minutter. Cellene ble vasket tre ganger med flekker buffer og deretter farget med artsspesifikke Alexa647 sekundære antistoffer (BD Biosciences) i 20 minutter på is. Cellene ble vasket tre ganger i farging buffer, deretter resuspendert i buffer farging med 7AAD (BD Biosciences) for levende celle-bestemmelse. Cellene ble analysert på en FACS Canto system (BD Biosciences) er utstyrt med en høy gjennomstrømming Sampler (med plate loader) og data ble samlet inn med med FlowJo programvare og en mal Microsoft Excel 2007 fra BD Biosciences (https://www.bdbiosciences.com /support/resources/stemcell/index.jsp#stemtools) for generering av varme kart.
Immunohistochemistry
servietter for IHC og IFC ble oppnådd gjennom en egen vev anskaffelsesteam innenfor Department of Anatomic patologi ved Cleveland Clinic. Prøver for IHC ble fiksert i 4% fosfat-bufret formalin og innstøpt i parafinvoks for seksjonering. IHC farging ble utført på en Ventana Benchmark XT automatisert immunostainer benytte en Ventana Optiview DAB IHC Detection Kit med CC2 antigen henting. Primær antistoff, polyklonale kanin anti-ITGA6, (Sigma-Aldrich, HPA012696) ble fortynnet 1:10.
immunfluorescens
nyhøstet tumor eller normalt vev var snap frosset og banked ved -80 ° C. En gastrointestinal patolog bekreftet histopatologi diagnose av hver prøve uavhengig. Normalt vev ble erholdt fra et sted fjernt fra den primære tykktarm tumor. Dypfryst vev ble delt på en 6 mikrometer tykkelse. Objektglass ble fiksert med 4% para-formaldehyd, lufttørket og lagret ved -20 ° C inntil bruk. Etter behandling med 10% normalt geiteserum og 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i 45 min, ble objektglass inkubert med monoklonalt affinitetsrenset mus anti-human EpCAM (ab20160, Abcam) ved en endelig fortynning på 1:200 og affinitetsrenset monoklonalt rotte anti-humant integrin α6 (MAB1378, Milipore) ved en endelig fortynning på 1:100 over natten ved 4 ° C, vasket tre ganger med PBS fulgt av inkubasjon i 1 time ved romtemperatur med geit anti-mus lgG1 AlexaFluor 568 (1:1000 fortynning) og geite-anti-rotte AlexaFluor 488 (1:1000 fortynning), begge fra Invitrogen. Objektglassene ble vasket tre ganger med PBS og motfarget med atom flekk Hoechst 33342 (1:10000) i 2 min. Etter vasking med PBS, ble platene montert med FluorSave (Calbiochem).
Western blotting
Cellene ble lysert i 50 mM Tris pH 8,0, 120 mN NaCl, 0,5% NP-40, protease hemmere (Sigma-Aldrich) og fosfatase-inhibitorer (Sigma-Aldrich). Like mengder av cellelysat ble lastet og løst på en 4-12% Bis-tris gradientgel (Life Technologies) og overført til en PVDF-membran (Millipore). Membranen ble probet samtidig over natten ved 4 ° C for anti-CD10 (mus, 1:500, Abcam), og anti-β-aktin (mus, 1:8000, Sigma). Geit-anti-muse-sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase ble påvist ved anvendelse av forsterket chemilluminescent substrat (1:3000, Santa Cruz).
Stamcelle markør analyse
Flere antistoffer for fler-farge flowcytometri CD44 -PE (Miltenyi; 1:1000), EpCAM-FITC (BD Biosciences klone EBA-1; 1:1000), og CD133-APC (Miltenyi AC133, 1:1000). Celler ble fremstilt som beskrevet ovenfor. FITC-konjugert isotype kontroller (Santa Cruz) ble anvendt separat for hvert antistoff til å bestemme basislinje-farging og kompensasjon ble utført i henhold til standardteknikker. Ved flerfargeanalyse, ble en enkelt cellelinje merket med alle tre antistoffene i et enkelt rør, vasket, og fylt på en FACS Aria II strømningscytometer (BD Biosciences). Gatings og tomter ble konstruert ved hjelp FlowJo programvarepakken.
Oncomine analyse
Bioinformatikk analyser ble utført ved hjelp av Oncomine database (www.oncomine.org). Gener av interesse ble evaluert basert på en p-verdi cutoff på 0,05 og ingen uttrykk nivå filter ble brukt.
Diskusjoner
Bedre resultater for kreftpasienter vil trolig stole på nye oppdagelse og behandlingsmetoder for primære og metastatisk sykdom. Her benyttet vi en ny high-throughput teknikk som bruker en strek antistoff array å definere overflaten antigen profiler av tykktarmskreft cellelinjer avledet fra primære og metastatisk svulstvev. Vi identifiserte en rekke vanlige og forskjellig uttrykt overflateantigener, inkludert de vunnet og tapt i overgangen til avansert sykdom (tabell 1, 2 og 3). Robustheten i systemet som er beskrevet heri armer søkere med evnen til å screene global proteinekspresjon tvers av sykdomstilstander og /eller responsen av celler til spesielle stimuli. Blant anvendelser av denne tilnærmingen, overflate TAA kan utnyttes for sykdom sporing og terapi. Enkelte TAA, slik som EpCAM, allerede har kommet inn i kliniske riket med muligheten til å overvåke sykdomsbyrde. Ytterligere TAA bør gjøre det mulig å legge til spesifisitet og pålitelighet i deteksjon av tumorceller enten in situ, i sirkulasjon, eller som disseminerte celler. Målretting av TAA med monoklonale antistoffer kan også gi muligheter for å oppnå tumorinhibering som allerede har blitt demonstrert i praksis med cetuximab (erbitux; mot EGFR), rituximab (Rituxan; rettet mot CD20), og tositumomab (rettet mot CD20). HER2-positiv kreft avansert dyret kan inhiberes av trastuzumab emtansine (anti-HER2-antistoff koblet med en mikrotubuli-inhibitor) [29]. Videre radioimmunterapi, slik ibritumomabtiuksetan (rettet mot CD20), benytter monoklonale antistoffer til å levere stråledoser direkte til svulstvev.
Sammenligning av våre kandidat markører identifisert på proteinnivå via flowcytometri mot RNA-baserte genuttrykk mikromatriser databaser av tykktarmskreft (Oncomine) hjulpet i vår prioritering. Men iboende biologiske kobler mellom RNA transkripsjoner og utrustet polypeptider advare mot å bruke dette filteret som en ultimate determinant for valg av TAA [5]. Snarere favorisere vi validering av informasjonsinnholdet av TAA på grunnlag av ytterligere protein-nivå-analyser over et større antall av prøver (f.eks immunohistokjemi på microarray). Vi validert inte α6 i pasient biopsier som kandidat svulst biomarkør hentet fra vårt panel av antistoffer. Videre arbeid vil være nødvendig å ta den kliniske verktøy for inte α6 og andre identifiserte overflateantigener i tumorceller deteksjon og behandling design.
Våre resultater profilerings menneskelige tykktarmskreftcellelinjer utvide på de av Zhou et al. det også benyttes en multiplekset antistoff-matrisen [30] – [32]. Deres studie benyttet en slide-basert trykt antistoff array (DotScan ™) med dekning av 122 celleoverflatemarkører. Vi fant konsistente signaler med de fleste, men ikke alle, av sine antistoffer som reagerer med SW480 og SW620 cellelinjer, noe som kan tilskrives prøveopparbeidelse eller analyseteknikk. I motsetning til den DotScan antistoff array, antistoff rekke brukes her sonder nesten dobbelt så mange antigener ved hjelp av standard flowcytometri teknikker tilgjengelig i de fleste forskningsanlegg uten behov for ekstra utstyr eller programvare (dvs. DotReader). Den strekkoding av cellelinjer kan bli ytterligere skaleres opp ved bruk av 10-gangers fortynninger av intracellulære fargestoffer og /eller dobbeltmerkede celler [28]. I likhet med den DotScan metoden er imidlertid vår antistoff matrise kan også bli multiplekset for å analysere primærtumorprøver inneholdende flere subpopulasjoner som kan gjenkjennes ved fluorescently konjugerte antistoffer (f.eks epiteliale kreftceller med CEA-FITC og hematopoietiske celler med CD45-APC), mens den antistoffer i tabellen er merket med Alexa647. Alternativt kan tumor subpopulasjoner skilles fra hverandre på basis av fysisk (f.eks side populasjonen) eller funksjonell (f.eks stamcelle assay) egenskaper ved å merke disse cellene på bekostning av minst en fluoriserende kanal på annen måte brukes for strekkoding. For eksempel er Aldefluor analysen mulig ved merking ALDH1-uttrykke stamceller i den grønne kanalen mens ofre CFSE barcoding.
Flere faktorer påvirker overflateprofil på kreftcellene. Blant disse omfatter vekstfasen av celler, kulturmedier, kulturskål substrat, og den type enzymatiske løsgjøring /dissosiasjon, noe som kan spalte epitoper. For eksempel behandling av HCT116 tykktarmskreftceller med papain (enzym som brukes for dissosiasjon av noen solide tumorer) redusert påvisning av CD44 fra 93,4% til 0,5% av cellene mens EpCAM og CD133 (AC133) ikke påvirkes nevneverdig (figur S7) . Derfor bør det utvises forsiktighet når designe eksperimenter og tolke data fra antistoffbaserte skjermer. I tillegg kan våre 5% celle positivitet cut-off utelate sjeldne, men biologisk relevant cellepopulasjoner og TAA biomarkører.
Den kombin barcoding og antistoff arrays ansatt i denne studien kan bli utvidet til raskt profil flere kreftceller fra tykktarm og andre typer vev. Evnen til å multiplekse reaksjoner reduserer eksperimentell variabilitet, antistoff forbruket ved 10- til 100-ganger, og tid til å fullføre en analyse. Videre kan denne tilnærmingen være tilpasset for samtidig profilering av pasient-avledet normal, primær og /eller metastatisk prøvestykkene i en enkelt analyse på en brøkdel av den tid og kostnader. Til slutt, binding av kjente epitoper som bruker kommersielt tilgjengelige antistoffer ekspederer translasjonsforskning studier som tar sikte på å utvikle forbedrede kliniske ressurser.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Komplett antistoff matrise resultater. Fullstendige resultater fra strek antistoff rekke screening av SW480, SW620, og HCT116 CRC cellelinjer. Posisjonen av hvert antistoff på platen er indikert fra rekkene A-H og kolonner 1-12. For å generere et heatmap av ekspresjonen av antigenene, ble individuelle celler farget på grunnlag av deres ekspresjon verdi fra 0 (hvit) til 100 (rød). Legg merke til at rotte CD326 /EpCAM i tillegg F10 er kun godkjent for mus reaktivitet av produsenten, og er et annet antistoff enn det som brukes i vår immunfluorescens og multi-color flowcytometri
doi:. 10,1371 /journal.pone.0053015. S001 product: (docx)
Figur S2.
Histogram plott fra antigenene i tabell 1. antigener uttrykt i 50% av alle celler i alle tre cellelinjer. Tomt i rødt er tilsvarende isotypekontrollantistoff.
