Abstract
Mål
metastaser er den vanligste dødsårsaken for pasienter med prostatakreft. Identifisering av bestemte metastase biomarkører og nye terapeutiske mål anses som helt nødvendig for bedre prognose og behandling av sykdommen. MicroRNAs (mirnas) danner en klasse av ikke-kodende små RNA-molekyler som anses å være viktige regulatorer av genuttrykk. Deres feilregulering har vist seg å spille en rolle i kreft utbruddet, progresjon og metastase, og mirnas utgjør en lovende ny klasse av kreft biomarkører. Målet med denne studien var å identifisere ned- og opp-regulerte mirnas i prostata kreft som kan gi potensielle biomarkører og /eller terapeutiske mål for prostatakreft metastaser.
Metoder
Neste generasjons sekvenseringsteknologi ble brukt for å identifisere differensielt uttrykte mirnas i en transplanterbar metastatisk mot en ikke-metastatisk prostatakreft xenograft linje, begge avledet fra en pasients primærcancer. De xenotransplantater ble utviklet via subrenal kapsel poding av kreft
vev
inn i NOD /SCID-mus, er en metode som har en tendens til å bevare egenskapene til de opprinnelige kreft (for eksempel tumor heterogenitet, genetisk profil).
resultater
uttrykt forskjellig kjent mirnas, isomiRs og 36 nye mirnas ble identifisert. En rekke av disse miRNAs (21/104) har tidligere blitt rapportert å vise tilsvarende ned- eller opp-regulering i prostatakreft i forhold til normal prostata vev, og noen av dem (f.eks MIR-16, MIR-34a, MIR-126 *, MIR-145, MIR-205) har vært knyttet til prostata kreft metastaser, som støtter gyldigheten av den analytiske tilnærmingen.
Konklusjoner
bruk av metastatisk og ikke-metastatisk prostatakreft subrenal kapsel xenografter stammer fra en pasients kreft gjør det sannsynlig at de forskjellig uttrykt mirnas identifisert i denne studien omfatter potensielle biomarkører og /eller terapeutiske mål for human prostatakreft metastase
Citation. Watahiki A, Wang Y, Morris J, Dennis K, O’Dwyer HM, Gleave M, et al. (2011) microRNAs Associated med metastatisk prostatakreft. PLoS ONE 6 (9): e24950. doi: 10,1371 /journal.pone.0024950
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 25 februar 2011; Godkjent: 24 august 2011; Publisert: 30.09.2011
Copyright: © 2011 Watahiki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (YZW /MG). YZW er en mottaker av en Overseas Chinese Scholar Award fra Natural Science Foundation National of China (No 30928027), og en mottaker av en innovativ Scholar Award fra International Cancer Alliance for kreftforskning og utdanning og Fibrolamellar Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne hevder at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn og den nest største årsaken til kreft dødsfall i USA [1]. Mens betydelige fremskritt har blitt gjort ved behandlingen av lokaliserte, organ-begrenset tumorer, er prostatakreft tiden uhelbredelig når den har kommet til metastase, og de fleste dødsfall fra denne sykdommen er på grunn av metastaser som er svært resistente mot konvensjonell terapi. Foreløpig prostataspesifikt antigen (PSA) er en stor serum biomarkør brukes for påvisning og overvåking av prostatakreft progresjon. Imidlertid er den prognostiske verdi av økte nivåer PSA begrenset, ettersom prostatakreft kan være forbundet med meget lave eller normale PSA-verdiene. Det er derfor et presserende behov for nye, mer spesifikke biomarkører som kan brukes til å forutsi kreft progresjon på egenhånd eller i samarbeid med en strøm biomarkør slik som PSA [2]. Videre er nye terapeutiske mål forbundet med prostata kreft metastase haster.
microRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA (17 til 27 nukleotider) som negativt regulerer uttrykket av målgener ved å binde seg til 3 «uoversatt regioner (UTR) av mRNA og hemme oversettelse eller fremme mRNA degradering [3]. Nyere studier har vist dysregulering av mirnas i humane tumorer som indikerer en rolle for slike molekyler i patogenesen kreft, inkludert kreft utbruddet, progresjon og metastase [4], [5]. Så langt har bare et lite antall studier undersøkt miRNA uttrykket i prostatakreft, og bare noen få har jobbet med metastasering av denne sykdommen. Forskjeller i uttrykket profiler av mirnas så langt identifisert kan ha prognostisk verdi for de ulike aspekter ved sykdom og en bedre forståelse av rollen til miRNAs i utvikling og progresjon av prostatakreft er nødvendig [6]. Videre forskning kan også føre til identifisering av nye mirnas som er spesielt knyttet til prostata kreft progresjon og metastasering. Slike metastaseassosierte mirnas kan tjene som metastatiske biomarkører og /eller nye mål for behandling av metastatisk sykdom.
Studier som tar sikte på å identifisere genetiske faktorer med sentrale roller i prostata kreft metastase har blitt hindret av mangel på optimale eksperimentelle modeller . Mens xenograft modeller basert på etablerte kreftcellelinjer som representerer ulike stadier av kreft progresjon kan være nyttig for å identifisere mekanismene bak metastaser, har de ikke i tilstrekkelig grad etterligner klinisk sykdom [7]. Arbeidet har derfor fokusert på bruk av pasientenes prostatakreft
vev
. Imidlertid er typisk heterogeniteten av slike vev, som består av både ikke-metastatiske og potensielt metastatiske subpopulasjoner, gjør det vanskelig å identifisere faktorer, slik som gener som ligger til grunn for utvikling av metastase [8]. Dessuten er det vanskelig å oppnå metastatisk prostata cancer vev fra pasienter for eksperimentelle formål, fordi de ikke er rutinemessig eller praktisk mulig vevsprøve eller resektert fra pasienter, og raske obduksjons programmer er ekstremt kostbare og vanskelige å håndtere. For å overvinne de ovennevnte hindrene, utviklet vi neste generasjons pasient avledet prostatakreft xenograft modeller, som ligne den kliniske situasjonen, ved hjelp subrenal kapsel poding av pasientenes kreftvev i immuno-mangelfull mus. Denne metodikken favoriserer retensjon av egenskapene til de opprinnelige kreft [9] – [11]. Videre har det vært mulig å fastslå transplanter, metastatiske og ikke-metastatisk prostatakreft underlinjer fra heterogene xenotransplantater [12], [13]. Bruk av metastatiske og ikke-metastatiske transplantater har allerede vært effektiv i identifisering av prostata kreft metastaseassosierte gener [13].
Illumina massivt parallell DNA-sekvensering av syntese teknologi er en allment vedtatt neste generasjons sekvense plattform . Den støtter parallell sekvensering ved hjelp av en proprietær reversibel terminator-basert metode som påviser enkelt baser som de er innlemmet i voksende DNA-trådene. En fluorescens-merket terminator avbildes som hver dNTP tilsettes og deretter spaltet for å tillate inkorporering av den neste basen. Ettersom alle fire vendbare terminator-bundet dNTPs er til stede i løpet av hver syklus-sekvensering, reduserer naturlig konkurranse inkorporering forspenning, noe som fører til sann basis-av-base-sekvensering [14].
I den foreliggende undersøkelse, Illumina neste generasjon sekvenseringsteknologi ble brukt til å sammenligne miRNA profiler av en transplantmetastatisk versus en ikke-metastatisk prostatakreft xenograft linje, både avledet via subrenal kapsel pode [10] – [12] fra en pasient primære kreft vev. Uttrykt forskjellig kjente og nye mirnas ble funnet som kan ha spesifikke roller i metastasering av prostata kreft.
Materialer og metoder
Pasient-avledet prostatakreft xenograft modeller
NOD /SCID-mus som brukes for xenografting ble avlet og vedlikeholdes på British Columbia Cancer Research Centre Animal Facility (Vancouver, Canada). Alle forsøksprotokoller ble godkjent av University of British Columbia Animal Care komité (A10-0100). En prostatakreft biopsi prøven ble innhentet ved BC Cancer Agency med pasientens skriftlig informert samtykke. Etisk godkjenning ble gitt av University of British Columbia -. British Columbia Cancer Agency forskningsetikk Board (UBC BCCA REB # H04-60131)
Etablering av transplant prostata kreft vev xenograft linjer via subrenal kapsel pode har blitt beskrevet tidligere [9]. I den foreliggende undersøkelse, er en nylig fremstilt metastatisk prostata kreft xenograft linje, LTL-313H [15], og en ikke-metastaserende motstykke, LTL-313B (upublisert), ble brukt som hadde blitt avledet fra forskjellige loci av en pasients prostatakreft biopsi prøven (www.livingtumorlab.com). Begge linjene var PSA- og AR-positive som vist via immunhistokjemi ([15], upubliserte data). De ble rutinemessig opprettholdt under nedsatt kapsler av hann NOD /SCID-mus supplert med testosteron, som tidligere beskrevet [9]. De LTL-313H xenografter viste invasjon av mus verten nyre og kreftceller ble oppdaget i lungene til vertene etter 3 måneder med poding. I kontrast til LTL-313B xenografter viste ingen åpenbar invasjon av mus nyre og viste ingen fjernmetastaser (data ikke vist).
Små RNA bibliotek konstruksjon og cDNA sekvense
LTL- 313H og LTL-313B xenograft vev ble samlet og RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Mississauga, ON, Canada) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble sendt til Genome Sciences Centre ved British Columbia Cancer Agency (www.bcgsc.bc.ca) for små-RNA cDNA bibliotek konstruksjon og sekvensering som tidligere beskrevet [16] med mindre modifikasjoner. Hvert bibliotek hadde en bestemt indeks sekvens i sin 5 «adapter, dvs. «ACATCGA» for LTL-313H-bibliotek og «CGTGATA» for LTL-313B bibliotek; begge bibliotekene ble blandet og sekvensering ble kjørt i en flyt celle i Illumina plattform.
Små RNA kartlegging og forskjells uttrykk deteksjon
5 «indeksert cDNA sekvenser ble brukt til å skille opprinnelsen de RNA. 3 «Adaptor sekvensene ble fjernet fra alle leser og de resterende kodene som var 16 til 27 nukleotider i lengde og uttrykt på en tag telling av to eller flere i hver biblioteket ble brukt for videre analyse. De trimmet sekvensene ble kartlagt til miRBase 15 menneske stilk-løkke sekvenser (https://www.mirbase.org/) ved hjelp av Novoalign (www.novocraft.com) program som tillater opp til 3 uoverensstemmelser. De som matchet en miRBase sekvens ble deretter gruppert som: 1) kjent moden miRNA og miRNA *, 2) antatte miRNA *, som ikke tidligere er rapportert i miRBase, 3) løkke sekvenser og 4) sekvenser som matchet loop-sekvensen, men gjorde ikke har kjent modne sekvenser. Sekvensene matchende kjente mirnas ble videre gruppert, basert på deres startposisjoner, og telles. De mest tallrike varianten /startposisjon kodene ble brukt for sammenligning mellom bibliotekene. Tag tellinger ble normalisert til de totale tellinger av disse sekvensene som matchet miRBase 15 stilk-løkke sekvenser og de to bibliotekene ble sammenlignet for differensial uttrykk av sekvensene ved hjelp av Fishers eksakte test med Bonferroni korreksjon. Sekvenser ble ansett som signifikant forskjellig uttrykt ved de to bibliotekene dersom p-verdien var. 0,001 og det var minst to ganger endring i sekvensene «normtall
Novel miRNA identifikasjon
De sekvenser som ikke samsvarte med kjente miRNA stilk-løkke sekvensene ble filtrert ut med kjente transkripsjoner sekvenser som er lastet ned fra UCSC [17]. Å identifisere nye miRNA kandidater blant de gjenværende enestående sekvenser ble miRanalyzer programmet [18] brukes (https://web.bioinformatics.cicbiogune.es/microRNA/miRanalyser.php). Utgangs kandidatene ble sjekket en etter en etter antatte til kjente ikke-kodende RNA, og ikke-homologe sekvenser ble tatt som nye miRNA kandidater.
miRNA mål prediksjon og sti analyse
Målgenene for hver forskjellig uttrykt miRNA ble beregnet med mikrokosmos versjon 5 [19], [20] med en terskel på
p
= 0,001. Som noen av de genene ble potensielt regulert av både oppregulert og nedregulert mirnas fokuserte vi for videre analyse på de genene som potensielt ble regulert bare av oppregulert eller nedregulert miRNAs. Identifisering av KEGG pathways forbundet med potensielle målgener ble utført ved hjelp av DAVID 6,7 (Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). I tillegg, sammenlignet vi målgenet listene med genuttrykk data ved microarray analyse ved bruk av de samme xenograft vev for å identifisere de antatte målene som kan bli regulert på mRNA-nivå.
Microarray genekspresjonsanalyser
RNA som ble brukt for miRNA sekvensering bibliotek ble også brukt for mRNA-baserte genekspresjonsanalyser hjelp av Agilent human GE 44K plattform på Vancouver prostata Centre Microarray Facility (www.mafpc.ca). Alle data er MIAME kompatibel og rådata er blitt deponert i GEO (tiltredelse antall GSE28029). Uttrykket signalet ble forvandlet til z-score og beregnet z-ratio og mRNA med mer enn 1,96 av z-ratio ble behandlet oppregulert og mindre enn -1,96 som nedregulert [21]. Dataene ble også filtrert ved Flag.
celledyrking
22Rv1 prostatacancer-cellelinjen ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2.
miRNA forløper transfeksjon
forløper sekvens av mir-486, som vises i miRBase, og en ikke-tie negativ kontroll ble subklonet inn den pcDNA6.2-GW /EmGFP Mir plasmid (Invitrogen). 22Rv1 celler ble sådd ut i 12 brønners plater i en tetthet på 1,0 x 10
5-celler per brønn, 24 timer i forveien for transfeksjon. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen), etter produsentens anvisninger. Transfeksjonseffektiviteten ble validert ved GFP signal overvåking ved hjelp av et invertert mikroskop fluorescens system (Zeiss). For å bekrefte økte nivåer moden mål miRNA, ble en porsjon av de transfekterte celler som brukes for validering av kvantitativ (qPCR). For dette formål, ble total RNA ekstrahert ved anvendelse av en mini miRNeasy kit (Qiagen) og mengden av RNA bestemt ved spektrofotometri Nanodrop (Thermo Scientific). Deler (25 ng) av hver av de totale RNA preparatene ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av et Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon) etter produsentens anvisninger. CDNA ble fortynnet og blandet med mikroRNA LNA PCR primere og SYBR Grønn mester mix (Exiqon). qPCR ble utført ved hjelp av en ABIPrism 7900HT (Applied Biosystems) etter produsentens anvisninger. Den ΔΔCT ble anvendt for å beregne den synlige delen endres i forhold til kontrollen og U6 ble anvendt som en endogen kontroll.
MTT-analysen
De transfekterte celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 1 × 10
4 celler /brønn. MTT-løsning (20 ul 5 mg /ml) ble tilsatt til kulturene (200 ul volum) til en 4 timers inkubering ved 37 ° C. Etter fjerning av kulturmedium, ble de gjenværende krystaller ble oppløst i DMSO og absorbansen ved 570 nm ble målt.
Migrasjon /invasjon assay
BioCoat Matrigel invasjons kamre (BD Biosciences) ble anvendt for å måle vev invasivitet av celler. I de øvre kamrene, 1 x 10
5-celler /brønn ble sådd ut i 0,50 ml av serumfritt medium. I de nedre kammer, 0,75 ml medium /10% FBS ble levert. Kamrene ble inkubert i 30 timer ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Cellene som forble i det øvre kammer ble fjernet og transmigrated cellene fiksert i metanol og farget med krystallfiolett og fargede celler ble talt ved mikroskopisk analyse. Tumorcelle-invasjon ble uttrykt som prosentandelen av celler som hadde passert gjennom den Matrigel-belagte membraner i forhold til det antall celler som hadde passert gjennom de ubelagte membraner (invasjon indeks). Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
Resultater
miRNA sekvensering og annotering
Små RNA ble isolert fra metastatisk LTL-313H og ikke-metastatisk LTL-313B vev xenografter prostatakreft og behandlet for å tillate dyp sekvensering ved hjelp av Illumina plattform. Den leser med adapter indeks sekvenser «ACATCGA» og «CGTGATA» ble gitt LTL-313H opprinnelse og LTL-313B opprinnelse, henholdsvis. Mer enn 10 millioner total lesninger ble oppnådd for hver av bibliotekene. Disse leser var sammenlignet med sekvensdata i miRBase 15 mikroRNA Sequence Database. For de metastatiske og ikke-metastatisk prostata kreft vev biblioteker, 3,445,642 og 2,272,677 koder, henholdsvis, ble fullt kartlagt til menneskelig miRNA stilk-løkke sekvenser til stede i miRBase databasen (tabell 1). Det helt matchet leser ble kommentert, i henhold til deres posisjon i stilk-løkke struktur. En omlegging av inntil 2 baser i start- og sluttposisjoner ble tillatt for sekvenser å bli kommentert som
isomerer
kjente modne miRNAs (isomiRs). De totale antallet kjente mirnas pluss miRNA * s i metastatisk og ikke-metastaserende bibliotekene var 447 og 509, henholdsvis (tabell 1). Den mest uttrykt miRNA (og isomiR) var MIR-148a med totaltellinger av 270 801 og 763 877 leser pr metastatiske og ikke-metastatisk biblioteker, henholdsvis. Når isomiRs ble gruppert med samme startposisjon, forble MIR-148a den mest tallrike miRNA i den ikke-metastatisk bibliotek med en total telling av 846 468, mens det i metastatisk biblioteket MIR-21 var mest rikelig med en total telling av 310102 .
miRNA og miRNA * uttrykk
i miRBase, mirnas avledet fra en forløper er utpekt miRNA, overveiende uttrykt arm, og miRNA * de mindre uttrykt, motsatt arm. Hvis begge armene er tilsvarende uttrykk, blir de omtalt som 5p og 3p armer. Ekspresjonen av kjente mirnas i prostatakreft xenografter var generelt høyere enn den til miRNA * s. I en rekke tilfeller, miRNA * s (som identifisert ved miRBase) var mer uttrykt enn de tilsvarende mirnas (tabell 2). Dermed MIR-144 * ble vesentlig mer til uttrykk enn MIR-144 i både metastatiske og ikke-metastaserende biblioteker; tilsvar MIR-126 * ble mer uttrykt enn MIR-126, men bare i den ikke-metastatisk bibliotek. Forskjeller ble også funnet i uttrykk mønstre av 3p og 5p arm mirnas (tabell 2). 3P armer MIR-28 og MIR-339 viste høyere uttrykk enn de tilsvarende 5p armene i metastatisk linje, mens de viste lavere uttrykk enn de tilsvarende 5p armene i den ikke-metastatisk linje. I den metastatiske linje, MIR-542 viste seg gulering av 3p arm men nedregulering av den 5p arm. Fragmenter som var kolleger av kjente modne mirnas, men det hadde ikke tidligere blitt rapportert til miRBase databasen, ble betegnet «antatte roman miRNA *» arter (tabell 3). ble det observert i alt 32 av et slikt antatt miRNA * s som viser i det minste to står i en av de to bibliotekene. Noen av disse miRNA * s viste også høyere uttrykk enn de tilsvarende mirnas, f.eks MIR-1277 * og MIR-1307 *.
Novel miRNA kandidater
En fordel å utnytte en sekvensering tilnærming for miRNA profilering er muligheten til å identifisere nye mirnas eller miRNA * s. For dette formål anvendt en miRanalyzer, en mikroRNA påvisning og analyseverktøyet [18], i kombinasjon med homologi søk for å identifisere kjente transkripter, inkludert ikke-kodende RNA (f.eks, rRNA, tRNA, etc.). Bruke miPred programvare for å skille reelle forhånds mirnas fra andre hårnål sekvenser med liknende stilk-buer [22], identifiserte vi 36 nye miRNA kandidater. Deres sekvenser, kromosom steder og antall står i metastatisk og ikke-metastatiske biblioteker er presentert i tabell 4 og tabell S1. Komparativ analyse av de to bibliotekene viste signifikant differensial uttrykk for noen av disse nye miRNAs, inkludert nedregulert MIR-5680-3p og MIR-5681a-3p.
Potential metastaseassosierte mirnas
komparativ analyse av metastatiske og ikke-metastatisk xenograft miRNA bibliotekene avdekket totalt 104 forskjellig uttrykt mirnas eller miRNA * s med 55 nedregulert og 49 oppregulert i metastatisk linjen (tabell 5,6,7). Av de nedregulert mirnas, 24 mirnas viste en 5-fold nedgang, inkludert fire mirnas, dvs. MIR-205, MIR-503, MIR-708 og MIR-2115 *, som var umulig å oppdage i metastatisk linjen. To mirnas, dvs. MIR-24-2 * og MIR-101 *, viste økt uttrykk i en ett-basen-shift form. En en-baseforskyvning form av MIR-203 viste økt ekspresjon i den metastatiske linje i forhold til referansen MIR-203, mens den viste en lavere ekspresjon i den ikke-metastatiske linje. Av de oppregulert mirnas, 23 mirnas viste en 5 ganger endring i normaliserte teller. En baseskiftformer MIR-9 *, MIR-148b * og MIR-1246 viste høyere uttrykk enn referanse former i både metastatiske og ikke-metastaserende linjer.
Noen av de differensielt uttrykte mirnas har tidligere vært forbundet med prostata cancer, prostata cancer metastase eller metastasering av andre typer kreft (Tabell 5,6,7). Av de nedregulert mirnas et antall har blitt rapportert å være nedregulert i prostatakreft i forhold til godartet prostata vev, dvs. MIR-16 [23] – [25], Mir-24 [26] – [28], speil 29a [26], MIR-145 [23], [24], [27], [29], [30], og MIR-205 [24], [31], [32]. Den nedregulering av MIR-16 [25], MIR-34a [33], MIR-126 * [34], MIR-145 [35] og MIR-205 [36] korrelert med utviklingen av prostatakreft metastaser. Av de oppregulert mirnas (i metastatisk biblioteket), har MIR-210 er rapportert å være oppregulert i prostata karsinom i forhold til BPH prøver [23] og MIR-301 har vært knyttet til prostata kreft metastase [37]. I noen tilfeller, for å mirnas som ble funnet å være oppregulert i den foreliggende undersøkelse har blitt rapportert å være enten oppregulert i prostata karsinomer i forhold til normal prostata vev [38] – [40], eller nedregulert [23], [24], [27] – [29]. Videre noen av forskjellig uttrykt mirnas har blitt rapportert å spille en rolle i metastasering av andre typer kreft, for eksempel, oppregulert mirnas, la-7i, MIR-9, MIR-30a, MIR-125b, MIR -142-5p, MIR-151-3p, MIR-450A og nedregulert mirnas, MIR-24, mir-145, MIR-146b-5p, MIR-185, MIR-186, MIR-203 og MIR-335 .
antatte målgener for forskjellig uttrykt mirnas
Som et første skritt i identifisering av miRNAs med potensial betydning i metastatisk prosess, vi identifisert mulige målgener for hver av forskjellig uttrykt mirnas hjelp mikrokosmos analyse, et mål prediksjon program med en bestemt algoritme og dekning av miRNA, inkludert varianter i stjerne armer; en terskel
p
verdi = 0,001 ble opprettholdt for å få mer pålitelig mål identifikasjon (mikrokosmos) [41]. Antatte mål gener ble identifisert for 49 av 55 nedregulert mirnas og for 47 av 49 oppregulert mirnas (Tabell S2); de ble kommentert ved hjelp av DAVID programmet. De antatte målgener av nedregulert mirnas var assosiert med en rekke KEGG veier inkludert «Fc gamma R-mediert fagocytose» og «ECM-reseptor-interaksjon (Tabell S3). For de antatte målgener av oppregulert mirnas, ble trasé som «Pathways i kreft», «Focal heft» og «purinmetabolismen» bemerket.
Sammenligning av antatte miRNA mål gener med gener forskjellig uttrykt i metastatisk og ikke-metastatisk xenograft linjer
Selv om mirnas er tenkt å endre protein nivåer, har de i noen tilfeller vist seg å også påvirke mRNA nivåer [3]. I lys av dette, ble de to xenograft linjene kontrollert for differensial mRNA-ekspresjon. Som vist i tabell S4, ble 622 mRNA nedregulert og 348 mRNA var oppregulert i den metastatiske linje. Noen av de genene som er identifisert ved differensial mRNA uttrykk ble potensielt målrettet av både opp- og ned-regulert miRNAs. I lys av dette ble ytterligere analyser begrenset til gener som potensielt ble målrettet enten ved opp-regulert eller nedregulert mirnas. Gruppen som viste oppregulert mRNA forbundet med bare nedregulert mirnas besto av 85 mRNA; gruppen som viste nedregulert mRNA forbundet med bare oppregulert mirnas besto av 58 mRNA. Blant de mRNAer oppregulert i den metastatisk linje, noen har blitt rapportert å ha en rolle i vev invasjon og /eller metastasering av en rekke forskjellige kreftceller, inkludert mRNA som uttrykkes av
FSCN1 product: [42],
VEGFA product: [43]
FGFR1 product: [44],
ADAMTS1 product: [45],
CCL2 product: [46] og
VIM product: [47 ] gener. Tilsvarende mRNA nedregulert i metastatisk linje, inkludert mRNA uttrykt av
CTGF product: [48] og
SERPINB5 product: [49] gener, har vist seg å bli nedregulert i ulike metastatisk kreft, attesterer til påliteligheten av våre analyser (tabell S5).
Økte nivåer av modne MIR-486 i transfekterte celler
Ved 24 timer etter transfeksjon av 22Rv1 celler med pcDNA6.2-GW /EmGFP-mir486 eller pcDNA6.2-GW /EmGFP-kontrollsekvens, mer enn 90% av cellene ble funnet å være positiv GFP. Den mir-486 forløper hadde vært riktig behandlet til den modne MIR-486 skjema som indikert av qPCR. I forhold til kontroll, uttrykket nivåer av både MIR-486-5p og -3p armene var 11,6 ganger høyere, noe som indikerer at majoriteten av cellene uttrykt forhøyet MIR-486 nivåer.
Invasivitet av MIR-486- transfekterte celler 22Rv1
formeringshastigheten av MIR-486-transfiserte og kontrollsekvens-transfekterte celler var tilsvarende som angitt ved MTT-analysen (fig. 1A). Men Mir-486-transfekterte celler viste en økning på ca 85% i vev invasivitet i forhold til (Fig. 1B) kontrollcellene. Selv om dette resultatet har border betydning (
p
= 0,08), betyr det at økt uttrykk av MIR-486 forbedrer vev invasivitet.
A) Som det fremgår av MTT-analyse, var det ingen signifikant forskjell mellom veksten av MIR-486-transfekterte celler og kontrollceller i løpet av en 72-timers periode. B) Tissue invasivitet, målt ved Matrigel invasjon, av MIR-486 transfekterte celler og kontrollceller. Data er uttrykt som prosent invasivitet ± S.D. og viser økt invasivitet av MIR-486-transfekterte celler (85%;
p
= 0,08)
Diskusjoner
microRNAs har vært innblandet i reguleringen av. genekspresjon ved post-transkripsjonelle nivå i nesten alle biologisk hendelse, og det er en økende mengde bevis som endrede uttrykk spesifikke mirnas er involvert i utvikling og progresjon av kreft [4], [5]. Ved hjelp av neste generasjons sekvensering for små RNA identifikasjon, ble denne studien sikte på å identifisere uttrykt forskjellig kjente og nye mirnas i metastatisk versus ikke-metastatisk prostatakreft xenografter som kan spille en rolle i utviklingen av prostatakreft til metastatisk form. De transplantercancerlinjer som ble brukt synes å være meget egnet for formålet ettersom de hadde blitt avledet fra en pasients kreft og således besitter en felles genetisk bakgrunn. Videre, de hadde blitt utviklet via subrenal kapsel poding av kreft
vev
inn i NOD /SCID-mus, er en metode som har en tendens til å bevare viktige egenskaper i de opprinnelige kreft (for eksempel tumor heterogenitet, genetisk profil) [9] – [11], [50]. I tillegg, opprettholdelse av tumorlinjer i den samme type pode område (under nyrekapselen) sikret at deres vekst ikke ble merkbart påvirket av mikro-miljø forskjeller som kan ha en viktig innvirkning på utviklingen av kreft [51]. På samme måte vil den samme type pode området minimalisere forskjeller i miRNA produksjon av vertsceller som er tilstede i xenotransplantater. Selv om det har vist seg at xenografting kan endre ekspresjonen av mirnas [52], vår studie primært fokusert på forskjeller i mirnas mellom matchede prøver og disse forskjellene er derfor sannsynlig å være reell. Til sammen skal de data innhentet i denne studien være nyttig for avgrensning av miRNAs med onkogene egenskaper som er involvert i utviklingen av prostatakreft metastaser.
Den høyeste leser i de to RNA bibliotekene ble observert for speil 148a. Ekspresjonen av dette miRNA er androgen-induserbar i LNCaP-celler [53]. Dette tyder på at forholdsvis høy ekspresjon av MIR-148a som finnes i de to bibliotekene er et resultat av testosteron tilskudd av dyrene.
Av de 104 mirnas som ble funnet å være ned- eller oppregulert i metastatisk prostata kreft xenotransplantater, i forhold til deres ikke-metastatiske motstykker, 39 hadde tidligere blitt rapportert å være involvert i sykdoms (tabell 5,6,7). Disse rapportene ble hovedsakelig basert på sammenligninger av miRNA uttrykk i prostata kreft vev versus normale prostata vev uten å definere metastatisk evne til ondartede prøvene. Det er av interesse at 21 av de 39 mirnas viste ned- eller opp-regler i de metastatiske transplantater som matchet de som er rapportert for prostata kreft vev (i forhold til godartet vev), noe som tyder på at disse prostata kreft vev kan ha hatt metastatisk evne. Av de mirnas funnet å være nedregulert i de metastatiske xenotransplantater, MIR-16, som viser en 17 gangers nedgang i ekspresjon, er blitt rapportert å bli nedregulert på prostatakreft [23], [24], og for å få en metastase-undertrykke funksjon. Videre metastatisk prostata tumorvekst
in vivo
kan hemmes ved systemisk levering av syntetisk miRNA-16 [25]. Den reduserte uttrykk for MIR-34a i metastatisk xenograft linjen er i samsvar med sin rapportert hemming av prostata kreft metastase [33]. Den nedre uttrykk for MIR-126 * er i overensstemmelse med rapporter som denne miRNA er nedregulert i prostata kreft metastase [34] og at ektopisk uttrykk for MIR-126 * hemmet migrasjon og invasivitet av prostatakreftceller [34]. Den sistnevnte er et eksempel på en miRNA * spiller en rolle som en tumor suppressor. Interessant, MIR-126, en miRNA rapportert som nedregulert i prostatakreft i forhold til normal prostata vev [54], var oppregulert i metastatisk xenograft linje.
