Abstract
Kjemoterapi utgjør standard modalitet for behandling for lokaliserte hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC). Men mange pasienter ikke klarer å svare og tilbakefall etter denne behandlinger på grunn av oppkjøpet av cellegift-motstand. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye legemidler som kan reversere den resistent fenotype. Curcumin, den bestanddel av krydderet gurkemeie har vist seg å ha anti-inflammatorisk, anti-oksidanter og anti-proliferative egenskaper i flere tumortyper. Men bruk av curcumin har vært begrenset på grunn av dens dårlige bioabsorpsjon. Nylig har en ny klasse av curcumin analoger, basert på diarylidenylpiperidones (DAP), har blitt utviklet ved å inkorporere et piperidon kobling til beta-diketonet struktur og fluor-substitusjoner på fenylgruppene. I denne studien har vi evaluert effekten av H-4073, en parafluorinated variant av DAP, bruker begge
in vitro Kjøpe og
in vivo
hode og nakke kreft modeller. Våre resultater viser at H-4073 er en potent antitumormiddel og det betydelig hemmet celleproliferasjon i alle HNSCC-cellelinjene som ble testet på en dose-avhengig måte. I tillegg forbehandling av cisplatin-resistente HNSCC cellelinjer med H-4073 betydelig reversert chemo-motstand som observert av celleviabilitet analysen (MTT), apoptose assay (Annexin V binding) og kløyvde caspase-3 (Western blot). H-4073 formidlet sin anti-tumor effekt ved å hemme JAK /STAT3, FAK, Akt og VEGF signalveier som spiller viktige roller i cellevekst, migrasjon, overlevelse og angiogenese. I SCID-mus xenograft modell, H-4073 forbedret signifikant anti-tumor og anti-angiogenese virkninger av cisplatin, uten tilsatt systemisk toksisitet. Interessant, H-4073 hemmet tumor angiogenese ved å blokkere VEGF-produksjon av tumorceller, så vel som direkte inhibering av endotelial cellefunksjon. Til sammen tyder våre resultater at H-4073 er en potent antitumormiddel, og det kan brukes til å overvinne motstanden i kjemoterapi HNSCC
Citation:. Kumar B, Yadav A, Hideg K, Kuppusamy P, Teknos TN, Kumar P (2014) A Novel Curcumin Analog (H-4073) øker den terapeutiske effekten av cisplatin Behandling i hode- og halskreft. PLoS ONE 9 (3): e93208. doi: 10,1371 /journal.pone.0093208
Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 27 november 2013; Godkjent: 28 februar 2014; Publisert: 27 mars 2014
Copyright: © 2014 Kumar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health (NIH /NCI-CA133250, P. Kumar), Joans Fund Research Grant (BK P. Kumar), Experimental therapeutics frø tilskudd fra Ohio State University Comprehensive Cancer Center (P. Kumar) Arthur G. James Cancer Hospital og Richard J. Solove Research Institute (TT, P. Kumar). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er en av de vanligste kreftsykdommen i verden med mer enn 600.000 tilfeller diagnostisert hvert år [1]. Tobakk bruk og alkoholforbruk har vært kjent for å være de sterkeste risikofaktorer for utvikling av denne sykdommen [2]. Men det er nå anerkjent at humant papillomavirus (HPV) kan også spille en rolle i utviklingen av en undergruppe av hode og nakke kreft [3]. Mesteparten av HNSCC er diagnostisert i avansert stadium og utfallet av disse pasientene er ofte dårlig [4]. Cisplatin er en av de vanligste kjemoterapi for behandling av hode og nakke kreft [5]. Cisplatin er et uorganisk platina middel, som kan binde seg til DNA, indusere intrakjede og interstrand DNA-kryssbindinger, så vel som DNA-proteinkryssbindinger. Disse tverrbindinger resulterer i apoptose og celleveksthemming [6]. Men mange pasienter utvikler resistens mot cisplatin behandling som fører til behandlingssvikt [7]. Derfor er det behov for å utvikle nye terapeutiske strategier som er mer effektive og har færre bivirkninger enn i dag brukes behandlingsregimer.
Signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon (statistikk) er en familie av signalanlegg proteiner som er aktivert av cytokiner og vekstfaktorer [8]. Til dags dato har 7 medlemmer av STAT-familien blitt identifisert i pattedyr. I normale celler, blir STAT proteiner som forbigående aktiveres ved fosforylering og spille en rolle i cytokin-og vekstfaktor-medierte responser som cellevekst, overlevelse og inflammasjon [9], [10], [11]. Imidlertid har det blitt observert i en rekke undersøkelser at STAT3 er konstitutivt aktiv i en rekke humane faste tumorer, inkludert lungekreft [12], prostatakreft [13], brystkreft [14] og i mer enn 95% av hode og nakke kreft [10]. Dysregulering og konstitutiv aktivering av STAT3 stimulerer kreft celle vekst og bidrar til svulst utvikling og progresjon av oppregulering av Stat3 målgener inkludert BCL-2, c-myc, cyclin D1 og VEGF, noe som kan forbedre celle overlevelse, spredning og fremme angiogenese [15] , [16], [17]. Økt STAT3 ekspresjon har vært knyttet til dårlig prognose i pasienter med gastrisk, kolorektal kreft, livmor karsinomer og gliomer [18], [19], [20]. I tillegg har STAT3 overekspresjon og signalering er funnet å være forbundet med cisplatin motstand i HNSCC [21], [22]. Derfor har intense anstrengelser rettet mot å målrette STAT3 signalering ved hjelp av nye terapeutiske tilnærminger som kan indusere apoptose og sensibilisere tumorer overfor kjemoterapi [23].
Nylig har en ny klasse av diarylidenylpiperidone (DAP) forbindelser er blitt syntetisert ved å inkorporere en piperidon ring i beta-diketonet ryggradstruktur av curcumin [24]. Disse forbindelser viste betydelig høyere anti-kreft-aktivitet enn curcumin i en ovarial cancer-modell [25]. Det ble også funnet at disse forbindelser inhiberte aktiveringen av STAT3. Målet med denne studien var å evaluere effekten av en av diarylidenylpiperidone (DAP) sammensatte, H-4073, enten som monoterapi eller i kombinasjon med cisplatin, begge
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi viser at H-4073, som et enkelt middel, var effektiv til å inhibere tumorcelleformering og indusering av apoptose. Videre, H-4073 mediert inhibering av STAT3, fokal adhesjonskinase (FAK), Akt og vaskulær endotelial cellevekstfaktor (VEGF) signalveier og er i stand til å sensibilisere tumorceller for virkningene av cisplatin, noe som resulterer i inhibering av migrasjon og apoptose
in vitro
samt reduksjon i tumorvolum
in vivo
. Våre data støtter terapeutisk bruk av H-4073 i kombinasjon med cisplatin i behandling av hode og nakke kreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeidet ble godkjent av Ohio State University IACUC Animal etikk komité og utført i henhold til deres retningslinjer (Animal Welfare Assurance Antall A3261-01).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
UM-SCC-74A, UM- SCC-1, ble UM-SCC-74B, UM-SCC-38 og UM-SCC-47 fås fra laboratoriet til Dr. Thomas E. Carey ved University of Michigan [26]. CAL27 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA). Cisplatin resistent cellelinje (CAL27-CisR) ble generert fra dets paren CAL27 cellelinje (ATCC) som tidligere beskrevet [27]. Identiteten til alle cellelinjene ble godkjent av STR genotyping (AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit, Applied Biosystems, Carlsbad, California). Alle hode- og nakkekreftcellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, California), 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin og 1% ikke-essensielle aminosyrer (Invitrogen). H-4073 ble syntetisert som tidligere beskrevet [24]. Aksjen forbindelse ble nylig løst i DMSO for
in vitro
arbeid. For
in vivo
arbeid, H-4073 ble blandet med fôr (50 ppm dose av Harlan Tekland). Antistoffer mot pSTAT3 (Tyr705), Pakt (Ser473), pp38 (Thr180 /Tyr182), pErk1 /2 (Thr202 /Tyr204) og GAPDH ble hentet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og pFAK (Tyr397) antistoff var fra Abcam ( Cambridge, MA). CD31 antistoff var fra Dianova (Hamburg, Tyskland) og p21 antistoff ble oppnådd fra Calbiochem (EMD Millipore, Billerica, MA).
Cellular Opptak
For å bestemme opptaket av H-4073 av HNSCC celler
in vitro
, ble UM-SCC-74A celler dyrket i 10-cm retter og behandlet with10 mikrometer av H-4073 eller 100 mikrometer curcumin. Etter 1 times inkubering, ble cellene trypsinert, telles, og vasket med PBS. Cellepelleten ble tillatt å tørke, resuspendert i metanol og sonikert i 15 min. Den sonikere ble sentrifugert ved 10000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble fortynnet med et likt volum metanol og målt med et UV /Vis spektrofotometer (λ = 328 nm, ε = 25000 M
-1 cm
-1).
Cell Proliferation Assay
følsomheten av celler til cisplatin og H-4073 ble målt ved anvendelse av MTT-baserte kolo celleproliferasjon sett (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) [27]. I korthet, 5000 celler /brønn ble sådd ut i en 96-brønners plate. Den neste dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av H-4073, cisplatin, eller en kombinasjon av begge. Etter 72 timer, 10 pl /brønn av MTT-løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert ytterligere i 4 timer ved 37 ° C. De formazankrystaller som dannes i brønnene ble solubilisert ved tilsetning av Oppløsningsløsningen og inkubering av platene ved 37 ° C over natten. Platene ble avlest ved 590 nm på en Spectramax 190 plateleser (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA). Den prosentvise hemming av cellevekst for hver behandlingsgruppe ble beregnet ved å justere den ubehandlede kontrollgruppen til 100%. Data ble analysert ved anvendelse av GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), og doseresponskurver ble anvendt for å beregne konsentrasjonen av H-4073 eller cisplatin som resulterer i 50% inhibering av celleproliferasjon (IC50) under anvendelse av en fire parametrisk logistisk modell. Alle eksperimenter ble gjentatt minst 3 ganger
For medikamentkombinasjonsstudier, ble den synergistiske virkning vurderes ved kombinasjonen indeksen (CI), i henhold til metoden ifølge Chou og Talalay, karakterisert ved at synergisme er definert som CI . 1, mens antagonisme er CI 1, og en additiv effekt er betraktet som CI = 1 [28]. CI-verdiene ble beregnet ved bruk CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ).
Colony formasjon analysen
Kreftceller ble sådd ut i 6 cm retter og behandlet med cisplatin, H-4073 eller en kombinasjon av begge. Etter 48 timers behandling, 4 x 10
3 levedyktige celler fra hver gruppe ble sådd ut i 6 cm skåler og dyrket i ytterligere 10 dager. Koloniene ble fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Photomicrographs ble tatt og antall kolonier ble talt av Alpha Innotech bildebehandlingsprogrammer (San Leandro, CA).
apoptose analysen
Celler ble sådd ut i 6-cm retter og behandlet i 24 timer. Cellekultursupernatant og cellene ble samlet 48 timer etter behandling. Cellene ble farget med Annexin V 488 (Life Technologies, Grand Island, New York) og propidiumjodid (Sigma, St. Louis, MO) og analysert ved flowcytometri [27].
Immunoblotting
cellelysater ble kjørt på Novex Bis-Tris gel (Invitrogen) under reduserende betingelser, blottet på PVDF-membraner (GE Healthcare Life Sciences /Amersham, Piscataway, NJ), probet med primære antistoffer, så renset og inkubert med sau anti-mus eller esel anti-kanin konjugert med pepperrot peroksidase (GE Healthcare). Membranene ble visualisert ved hjelp av ECL Plus Kit (GE Healthcare).
Migrasjon analysen
effekt på cellemigrasjon ved behandling ble målt ved hjelp av xCELLigence RTCA DP Instrument (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) [29]. I korthet ble cellene dyrket i serumfritt medium i 24 timer. Den nederste kammeret i CIM-platen 16 ble fylt med 160 ul av fullstendig medium. Den nederste og øverste kammer ble knipset sammen. Serum-fritt medium ble plassert i den øverste kammeret og inkubert i 1 time i CO
2 inkubator ved 37 ° C. Cellene ble trypsinert, pelletert og resuspendert slik at 80000 celler ble tilsatt til hver brønn av den øvre kammeret i serumfritt medium inneholdende cisplatin, H-4073 eller en kombinasjon av begge. CIM-Plate 16 ble plassert i RTCA DP stasjon og migrasjon ble overvåket i 24 timer.
In vivo
Studier
For anti-tumor effektstudier, nakne athymiske mus tumorxenotransplantater ble brukt . Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene fra The Ohio State University Committee for bruk og stell av dyr. Tumorceller (1 x 10
6) ble blandet med 100 ul av Matrigel og injisert subkutant i flanken til mus [30]. Etter 8 dager ble musene delt i forskjellige grupper (n = 5), slik at den gjennomsnittlige tumorvolumet i hver gruppe var sammenlignbare. Dyrene ble behandlet med H-4073 ved å blande det med mate (50 ppm dose, Harlan Teklad) ved å starte på dag 8. Dyr ble behandlet med cisplatin (5 mg /kg) på dag 8, 11, 14, 17, 21, 24, og 28 via intraperitoneale injeksjoner. Tumor volummålinger [volum (mm
3) = L x W
2/2 (lengde L, mm, bredde W, mm)] begynte på dag 6, og videre to ganger i uken til slutten av studien. Etter 30 dager ble primære svulster forsiktig fjernet, fotografert og analysert for pSTAT3, tunel-positive celler og tumor angiogenese.
Immunohistochemistry
xenograft tumor vev ble fiksert i 4% paraformaldehyde natten og parafin innebygd. Vevssnitt ble deparffinized, forbehandlet med antigen gjenfinning buffer (EDTA, pH 8,0; pSTAT3) (sitrat, pH 6,0; CD31) [27]. Endogen peroksidase og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert, og delene ble inkubert med pSTAT3 (Tyr 705) eller CD31. Det primære antistoff-binding ble påvist ved anvendelse av biotinylert geit-anti-kanin-IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) eller biotinylert geite-anti-rotte-IgG (BD Biosciences, San Jose, CA). Platene ble deretter inkubert med avidin-biotin kompleks (Vector Laboratories). Reaksjons områder ble visualisert ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin (DAB, Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Seksjonene ble kontra med hematoxylin, dehydrert og montert med Permount.
ApopTag Peroxidase In Situ apoptose Detection Kit (EMD Millipore, Billerica, MA) ble brukt til å påvise apoptotiske celler ved terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick ende merking ( TUNEL) flekker i xenograft tumor seksjoner etter produsentens protokoll. I korthet snitt ble deparaffinized, rehydrert og inkubert med proteinase K i 15 minutter ved romtemperatur og deretter vasket. Den endogen peroksidase-aktivitet ble stoppet, og etter vasking av snittene ble inkubert med arbeids konsentrasjon av terminal deoksynukleotidyl transferase (TdT) ved 37 ° C i 1 time. Seksjonene ble så vasket og inkubert med anti-digoksigenin-konjugat (peroksydase) ved romtemperatur. Signalet ble visualisert med DAB som kromogen.
Statistical Analysis
Data fra alle forsøkene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minimum 3 uavhengige eksperimenter. Den statistiske signifikans av resultatene ble evaluert ved to-veis analyse av varians eller Students t test (der dette er aktuelt), og en p-verdi av 0,05 ble betraktet som signifikant. IC
50 verdier for H-4073 og cisplatin for hemming tumor celleproliferasjon ble beregnet ved hjelp GraphPad Prism programvare (GraphPad Software, Inc., San Diego, California) og kombinasjon indeks (CI) ble beregnet ved hjelp CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc ., Paramus, NJ).
Resultater
H-4073 er en potent hemmer av HNSCC spredning
De veksthemmende effekten av cisplatin i et panel av HNSCC cellelinjer var evaluert ved hjelp av MTT-analyse. Som vist på fig. 1A, cisplatinbehandling hemmet veksten av HNSCC-cellelinjer på en doseavhengig måte. Vi valgte to cellelinjer (CAL27-CisR og UM-SCC-74A) som var mest motstandsdyktig mot cisplatin for videre eksperimenter. UM-SCC-74A er plateepitelkarsinom cellelinje avledet fra en base av tungen svulst. Denne cellelinje ble valgt for å etterligne naturlige eller iboende cisplatin motstand. CAL27-CisR ble valgt ved å dyrke den paren tungen squamous cell carcinoma cellelinje (CAL27) i økende konsentrasjoner av cisplatin over en lengre tidsperiode [27]. Denne cellelinje ble generert for å etterligne ervervet cisplatin resistente fenotype. Curcumin har vært omfattende studert for sin STAT3-hemmende egenskaper og antitumoraktivitet [31]. Men på grunn av dets dårlige biotilgjengelighet og rask metabolisme, curcumin har ikke overført til klinikken. Derfor har vi utviklet en syntetisk analog av curcumin, H-4073 (Fig. 1B). I vår studie, H-4073 (10 mm) demonstrerte 5 ganger høyere cellulært opptak i hode- og halskreft cellelinje (UM-SCC-74A) sammenlignet med curcumin (100 mikrometer, Fig 1 C.). H-4073 var meget effektive i å hemme celleproliferasjon av alle HNSCC cellelinjer som ble testet, uavhengig av p53 status eller humant papillomavirus status (HPV, figur 1D). I vår mekanistisk studie, ble det observert en markert hemming av STAT3, FAK og Akt-fosforylering av H-4073 behandling på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 1E). I tillegg, H-4073 behandling også indusert aktivering av p38 MAPK, en stress-aktivert kinase som er kjent for å formidle celledød
A:.
HNSCC-cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin (CDDP) og celle-proliferasjon ble bedømt ved MTT-analyse.
B:
Kjemiske strukturer av curcumin og H-4073.
C:
UM-SCC-74A-celler ble dyrket i 10 cm kulturskåler og behandlet med curcumin eller H-4073 i 1 time. Cellulært opptak av curcumin og H-4073 ble målt med et UV /Vis spektrofotometer.
D:
HNSCC cellelinjer ble behandlet med ulike konsentrasjoner av H-4073 og celleproliferasjon ble vurdert av MTT-analyse.
E:
UM-SCC-74A-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av H-4073 i 2 timer. STAT3, FAK, Akt og p38 fosforylering ble undersøkt ved Western blotting og lasting lik protein ble bekreftet ved stripping av blottene og reprobing med GAPDH-antistoff.
H-4073 synergistisk forbedret anti-tumor effekt av cisplatin i HNSCC celler
Vi neste undersøkt om H-4073 behandling kan reversere cisplatin motstand i hode og nakke kreft celler og forbedre sin anti-tumor effekt i en synergistisk måte. Vi valgte to cisplatin-resistente cellelinjer, UM-SCC-74A (naturligvis cisplatin resistent) og CAL27-Cis-R (generert i vårt laboratorium) for alle våre studier. Den anti-proliferative effekt av H-4073 og cisplatin (CDDP) kombinasjonsbehandling ble målt ved å beregne kombinasjonsindeksen (CI) i henhold til Chou-Talalay metoden [28] med et fast forhold dose. Begge er H-4073 og CDDP ble tilsatt til tumorcellekulturer ved 0,25 x, 0,5 x, 1 x, 1,5 x og 2 x deres respektive IC
50 doser. Celleproliferasjon i begge cellelinjene ble merkbart redusert etter kombinasjonsbehandlingen på de flere sammenkoblede konsentrasjoner i forhold til behandling med enten av enkle midler alene (fig. 2). Kombinasjonsindeks (CI) for forskjellige effektive doser (ED) ble beregnet ved bruk av CompuSyn programvare. CI verdier for UM-SCC-74A celler ved ED50, ED75 og ED90 var henholdsvis 0.550, 0,537 og 0,244. CI verdier for CAL27-CisR celler var 0,628, 0,606 og 0,507 ved ED50, ED75 og ED90, henholdsvis. Disse resultater antyder at H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling var meget effektiv til å inhibere tumorcellevekst i en synergistisk måte i både den cisplatin-resistente cellelinjer
A og C:.
UM-SCC -74A
(
En
)
eller CAL27-CisR
(
C
)
cellene behandlet med H-4073 eller cisplatin (CDDP) alene eller i kombinasjon ved 0,25, 0,5, 1, 1,5 og 2 ganger deres respektive IC
50 doser og celle-proliferasjon ble bedømt ved MTT-analyse. Resultatene ble analysert i henhold til Chou-Talalay metode og kombinasjonen indeks (CI) verdier beregnet av CompuSyn programvare.
B og D: Search Bar diagrammer som viser resultatene celleproliferasjonsprosesser for UM-SCC-74A
(
B
) Hotell og CAL27-CisR
(
D
)
IC
50 doser av H-4073 og cisplatin (CDDP). *, Representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, representerer en signifikant forskjell (p 0,05). Sammenlignet med enkeltbehandlingsgrupper
neste undersøkt virkningen av H-4073 alene eller i kombinasjon med cisplatin på tumorcellekolonidannelse. Som observert med celleproliferasjonsanalyse, en kombinasjonsbehandling med H-4073 og cisplatin ved deres respektive IC
50 doser hemmet tumorcellekolonidannelse på en synergistisk måte (93% i UM-SCC-74A og 92% i CAL27-CisR celler) (fig. 3A-C).
CAL27-CisR
(
A-B
)
eller UM-SCC-74a
(
C
)
celler ble behandlet med H-4073 eller cisplatin (CDDP) alene eller i kombinasjon i 48 timer. Fire tusen levedyktige celler fra hver gruppe ble dyrket i ytterligere 10 dager i 6 cm plater. Hver analyse ble fotografert og antallet kolonier analysert. *, Representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, representerer en signifikant forskjell (p 0,05). Sammenlignet med enkeltbehandlingsgrupper
H-4073 hemmet cellemigrering og forbedret tumorcelle-apoptose
neste undersøkt effekten av H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling på tumorcelle motilitet ved bunnen av analysen. H-4073 og cisplatin behandling alene viste 48% og 44% inhibering av UM-SCC-74A celle motilitet og 46% og 42% inhibering av CAL27-CisR celle motilitet, henholdsvis (fig. 4A-B). H-4073 i kombinasjon med cisplatin viste signifikant høyere inhibering av UM-SCC-74A og CAL27-CisR celle motilitet (85% og 82%), henholdsvis. I neste sett av eksperimenter, undersøkte vi om H-4073-mediert anti-tumor virkninger blir mediert av apoptose. Faktisk, H-4073 i kombinasjon behandling med cisplatin viste signifikant høyere tumorcelle-apoptose (Annexin V-farging, fig. 4C) sammenlignet med ubehandlede celler eller H-4073 og cisplatin-behandlede celler alene. I tillegg kombinasjonsbehandling betydelig hemmet STAT3 aktivering og markant økte nivåer av aktivert caspase 3 og p21 (fig 4D.)
A-B.
Tumor cellemotilitet ble undersøkt av scratch-analyse . Hver analyse ble fotografert, og avstandene mellom de vandrende celle kantene ble kvantifisert og prosent cellemigrering ble beregnet. *, Representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med enkeltbehandlingsgruppene.
C-D:
UM-SCC-74A-celler ble behandlet med H-4073 eller cisplatin (CDDP) alene eller i kombinasjon. Etter 24 timer ble cellene enten farget med Annexin V og analysert ved flowcytometri eller Western blottet for pSTAT3, p21 eller kløyvet caspase 3. Lik protein lasting ble verifisert ved stripping av blotter og reprobing med GAPDH antistoff.
H-4073 betydelig forbedret den terapeutiske effekten av cisplatin i cisplatin motstandsdyktig hode og nakke kreft
in vitro
data antydet at H-4073 vesentlig tilbake cisplatin motstand i hode- og nakkekreftceller . Vi ytterligere validert vår
in vitro
resultater ved å bruke en atymiske nakne mus xenograft modell. I det første sett av eksperimenter brukte vi en naturlig resistente hode- og nakkekreft cellelinje (UM-SCC-74A). H-4073 (50 ppm) og cisplatin (5 mg /kg) behandling alene viste 33% og 39% tumorvekst-inhibering på dag 30, henholdsvis (fig. 5A-B). H-4073 i kombinasjon med cisplatin viste signifikant høyere tumorvekst inhibering sammenlignet med ubehandlede gruppen (84%), eller enkelt middel alene (Fig. 5A-B). I tillegg gir kombinasjonen behandlingen ble godt tolerert, og det gjorde ikke forårsake noen dyr toksisitet eller indusere betydelig reduksjon i kroppsvekt.
Dyr peiling UM-SCC-74A, CAL27 og CAL27-CisR ble behandlet med H -4073 (50 ppm), eller cisplatin (CDDP, 5 mg /kg) alene eller i kombinasjon.
A:
Representative photomicrographs av UM-SCC-74A svulster fra ubehandlet, cisplatin (CDDP), H-4073, eller CDDP og H-4073-behandlede grupper.
B:
Tumor vekstkurver for UM-SCC-74A svulster behandlet med cisplatin (CDDP), H-4073, eller CDDP og H-4073.
C:
Tumor vekstkurver for CAL27 og CAL27-CisR svulster behandlet med cisplatin (CDDP), H-4073, eller CDDP og H-4073. *, Representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, representerer en signifikant forskjell (p 0,05). Sammenlignet med enkeltbehandlingsgrupper
I det annet sett eksperimenter brukte vi cisplatin-resistente cellelinje (CAL27-CisR, IC
50 28 umol /l) og dets paren cisplatin-sensitive cellelinje (CAL27, IC
50 3 umol /L). Som vi tidligere har vist [27], cisplatin behandling (5 mg /kg) av dyr som bærer CAL27-CisR svulster påvirket ikke tumorvekst (9%) på dag 30, mens cisplatin behandling av sine foreldre celler (CAL27) markert redusert tumorvekst (45%). H-4073-behandling i CAL27-CisR celler var signifikant mer effektive i å redusere tumorbyrden (32%). H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling var mest effektive i å hemme tumorvekst av CAL27-CisR svulster (77%, Fig. 5C).
H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling betydelig hemmet STAT3 fosforylering
in vivo Hotell og forbedret svulstceller apoptose
i vår
in vitro
studien, har vi sett at H-4073 er en potent hemmer av STAT3 fosforylering. Vi neste undersøkt om H-4073 behandling hemmet SAT3 fosforylering
in vivo
. UM-SCC-74A svulster fra mus xenograft modell ble farget med pSTAT3 antistoff. H-4073 og cisplatin behandling inhiberte signifikant STAT3 fosforylering (43% og 30%, respektivt). H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling var mest effektive til å inhibere fosforylering STAT3 (94%) (fig. 6A-B). Tilsvarende, H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling var mest effektive i å indusere apoptose i tumorceller
A-D (Fig 6C-D.).
Parafin-embedded UM-SCC-74A tumorprøver ble farget for pSTAT3 (Y705) og apoptotiske celler (APOP Tag kit).
A:
Representative photomicrographs av tumorprøver farget for pSTAT3 fra ubehandlet, cisplatin (CDDP) eller H-4073 alene eller kombinasjons grupper.
B:
pSTAT3 positive celler ble kvantifisert i 5 høy effekt felt (400 ×) av hver tumorprøver og andelen positive celler beregnet.
C:
Representative photomicrographs av tumorprøver farget for apoptotiske celler fra ubehandlet, cisplatin (CDDP) eller H-4073 alene eller kombinasjons grupper.
D:
TUNEL-positive celler ble kvantifisert i 5 høy effekt felt (400 ×) av hver tumorprøver og andelen positive celler beregnet. *, Representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, representerer en signifikant forskjell (p 0,05). Sammenlignet med enkeltbehandlingsgrupper
H-4073 hemmet tumor angiogenese ved downregulating VEGF-sekresjon fra tumorceller
en rekke studier har vist at STAT3 er en viktig regulator av angiogenese [16], [32]. Vi neste undersøkt om H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling påvirket tumor angiogenese. H-4073 og cisplatin behandling alene viste 24% og 31% hemning av tumor angiogenese i UM-SCC-74A (fig. 7A-B), mens H-4073 og cisplatin kombinasjonsbehandling viste 62% hemning av tumor angiogenese. Vi neste undersøkt om H-4073 hemmet tumor angiogenese ved å blokkere VEGF produksjon av kreftceller. UM-SCC-74A-celler ble behandlet med H-4073 og VEGF-nivåene i kultursupernatantene ble målt ved ELISA. Ubehandlede UM-SCC-74A-celler produserte høye nivåer av VEGF (1121 pg /ml /10
6-celler, fig. 7C). H-4073 og cisplatin behandling alene viste 36% og 55% inhibering av VEGF-nivåer. H-4073 og cisplatin i kombinasjon behandling signifikant inhiberte VEGF-produksjon (83%). I det neste sett av eksperimenter, undersøkte vi om H-4073 kan direkte påvirke angiogene funksjon av endoteliale celler ved å hemme VEGF-signalisering. Våre resultater fra denne studien viser at H-4073 markert hemmer VEGF-mediert ERK1 /2 og Akt fosforylering (Fig. 7D). I tillegg til å hemme den pro-overlevelse signalmolekyler (ERK1 /2 og Akt) H-4073 også aktivert p38 MAPK (et pro-apoptotiske molekyl) på en doseavhengig måte (fig. 7D).
A:
Representative photomicrographs av tumor blodkar flekker for ubehandlet, cisplatin (CDDP) eller H-4073 alene eller kombinasjonsgrupper for UM-SCC-74A svulster.
B:
microvessel tetthet i tumorprøver ble beregnet ved å telle 5 tilfeldige felt (200 ×) og uttrykt som fartøyets tetthet ± SE.
C:
UM-SCC-74A-celler ble behandlet med cisplatin eller H-4073 alene eller i kombinasjon. Etter 72 timer ble kultursupernatanter samlet opp og analysert med hensyn på VEGF-nivåer. *, Representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med ingen behandling gruppe og **, representerer en signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med enkeltbehandlingsgruppene.
D:
Endotelceller ble behandlet med VEGF i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av H-4073 i 30 minutter. ERK1 /2, ble Akt og p38 fosforylering undersøkt av Western blotting og likeverdig protein lasting ble verifisert ved stripping av blotter og reprobing med GAPDH antistoff.
Diskusjoner
Pasienter med hode og hals kreft omfatter en heterogen gruppe, og selv med avansement i behandlingstilbud, har den generelle overlevelse for pasienter med avansert sykdom ikke endret seg vesentlig de siste tiårene [33]. Kirurgi etterfulgt av adjuvant strålebehandling har lenge vært brukt i behandling av pasienter med HNSCC [34]. Flere nylig, er platina-baserte regimer blir integrert i behandlingstilbud [35]. Men mange av pasientene utvikler resistens mot cisplatin, en av de mest brukte platina middel, som fører til behandlingssvikt [21], [36]. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye terapeutiske midler som er spesielt rettet mot pro-overlevelse veier. Nyere studier har vist at STAT3 er konstitutivt aktivert i tumorceller, og er overuttrykt i cisplatin-resistente cellelinjer [21], [37].
