Abstract
Murine Double Minute 2 (MDM2) protein er en viktig regulator av celledeling og apoptose som virker hovedsakelig ved å hemme p53 tumor suppressor. På samme måte, PI3-kinase (PI3K) /AKT-reaksjonsveien er kritisk for vekstfaktor-mediert celleoverlevelse. I tillegg har det blitt rapportert at AKT kan direkte fosforylere og aktivere MDM2. I denne studien viser vi at IGF-1 og opp-regulerer MDM2 proteinnivåer i et PI3K /AKT-avhengig måte. Inhibering av mTOR av rapamycin eller ekspresjon av en dominant negativ eukaryot initiering faktor 4E binding protein 1 (4EBP1) mutante proteinet, så vel som ablasjon av eukaryote initiering faktor 4E (eIF4E), opphever effektivt IGF-1-mediert oppregulering av MDM2. I tillegg, viser vi at rapamycin effektivt inhiberer ekspresjon MDM2 og sensitizes kreftceller til kjemoterapi. Tatt sammen, denne undersøkelsen avslører en ny mekanisme ved hvilken IGF-1 aktiverer MDM2 via mTOR vei, og det farmakologisk inhibering av mTOR i kombinasjon med kjemoterapi kan være mer effektiv i behandling av en undergruppe av kreftformer som bærer øket MDM2 aktivering.
Citation: Du W, Yi Y, Zhang H, Bergholz J, Wu J, Ying H, et al. (2013) Rapamycin Hemmer IGF-1-mediert oppregulering av MDM2 og sensitizes kreftceller til å kjemoterapi. PLoS ONE 8 (4): e63179. doi: 10,1371 /journal.pone.0063179
Redaktør: Zhi-Min Yuan, University of Texas Health Science Center i San Antonio /Greehey CCRI, USA
mottatt: November 16, 2012; Godkjent: 29 mars 2013; Publisert: 30 april 2013
Copyright: © 2013 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd (CA79804) og ved National Key Basic Research Program (973 Program) Kina (2012CB910700) til ZX, og United States Department of Defense congressionally Regissert Medical Research Program stipend (W81XWH-10 -1-0161) til JB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Unormal aktivering av Murine Double Minute 2 (MDM2) er etablert som en viktig utløsende faktor i menneskelig utvikling kreft. MDM2 fungerer som en ubikvitin-E3-ligase for å lette nedbrytning av p53, en nøkkelregulator for celle proliferasjon, apoptose og begynnende alderdom i respons til cellulære påkjenninger, slik som DNA-skade og belastning onkogen [1]. Forsterkning av
MDM2
genet har blitt observert i en rekke menneskelige svulster og kreft, inkludert bløtvev svulster, osteosarkom, og spiserørskreft [2]. Spesielt, MDM2 har vist seg å ha p53-uavhengig onkogene funksjoner [3], [4]. Arbeid fra oss og andre har vist at MDM2 kan målrette og hemme retinoblastom protein (Rb) via proteasom-mediert degradering [5], [6], [7], [8], [9]. MDM2 har også vist seg å kompleks med og regulere proteinstabilitet og /eller aktivitet av en undergruppe av proteiner involvert i celleproliferasjon og celledød, inkludert p73 [10], [11], E2F1 [12], cyklin-avhengig kinase inhibitor p21 [13], beta-arrestin, og G-protein-koblet reseptor kinase 2 (GRK2) [14], [15].
det har vist seg at MDM2-protein subcellulære lokalisering og funksjoner er modulert av PI3 -Kinase (PI3K) /AKT veien. AKT kan direkte å fosforylere MDM2 ved Ser166 og Ser188 og letter således nukleær translokasjon [16] og p53-degradering, samt p300 interaksjon [17], [18]. I tillegg har overekspresjon av AKT vist seg å stabilisere MDM2-protein [19]. Nylig har AKT dukket opp som en kritisk regulator av mammalian target of rapamycin kompleks 1 (mTORC1). AKT hemmer TSC2 /TSC1 kompleks, som fører til aktivering av mTORC1 [20]. Viktigere, tyder nye bevis for at mTORC1 aktivitet er avgjørende for AKT onkogen funksjon. Faktisk er akselerert tumorvekst på konstitutiv aktivering av AKT reverseres ved inhibering av mTOR [21]. Tilsvarende mus som uttrykker human akt1 i prostata utvikle en neoplastisk fenotype, som er fullstendig opphevet ved inhibering av mTOR [22]. Videre inaktivering av AKT fører til hemming av celleproliferasjon, som er avhengig av mTORC1 [23]. Disse studiene tyder på at AKT-mTOR veien er avgjørende for tumorcellevekst.
I denne studien, viser vi at insulin-like growth factor 1 (IGF-1) opp-regulerer MDM2 uttrykk gjennom AKT-mTOR sti. Inhibering av mTOR av rapamycin, ekspresjon av en dominant negativ eukaryot initiering faktor 4E binding protein 1 (4EBP1) mutant eller stanse av eukaryot initiering faktor 4E (eIF4E) effektivt opphever IGF-1-mediert oppregulering av MDM2. I tillegg viser vi at rapamycin hemmer effektivt MDM2 uttrykk og sensitizes kreftceller til kjemoterapeutisk legemiddelindusert apoptose.
Resultater
IGF-1 induserer MDM2 Uttrykk i et PI3K avhengig måte og gjør ikke alter MDM2 Protein Stabilitet eller Steady state mRNA nivåer
Vi har tidligere vist at IGF-1 modulerer cyclin-avhengig kinase inhibitor p21 å påvirke celle overlevelse på gentoksisk spenning [24]. Siden IGF-1 er kjent for å aktivere PI3K /AKT vei, var vi interessert i å tyde rollen PI3K /AKT i IGF-1-mediert celle overlevelse. Som vist i figur 1A, IGF-1 behandling av serum-sultet humane osteosarkomceller U2-OS-celler (p53 villtype) ført til klart AKT-aktivering, slik som vist ved en økning i AKT-fosforylering. Spesielt, IGF-1 indusert ekspresjon MDM2-protein, slik som vist ved en økning av både MDM2 proteinbånd som detekteres av en MDM2-spesifikt antistoff, SMP14, i samsvar med tidligere rapporter [6], [9], [25]. Denne virkning av IGF-1 på MDM2 ble effektivt blokkert ved behandling med LY294002, en selektiv inhibitor PI3K [26], men ikke med PD98059, en inhibitor for MAP-kinase kinase (MEK), eller ved SB203580, en spesifikk inhibitor av p38 stress- aktivert protein kinase [27]. Disse data tyder på at IGF-1 up-regulerer MDM2 protein uttrykk gjennom PI3K-AKT signalkaskade.
(A) U2-OS celler ble serum-sultet i 24 timer og deretter pre-behandlet med enten PI3- -kinase (PI3K) inhibitor LY294002 (20 uM), MAP-kinase kinase (MEK) inhibitor PD98059 (25 uM), eller p38 spenning-aktivert protein kinase inhibitor SB202190 (10 uM) i fire timer, etterfulgt av behandling med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Celler ble lysert og utsatt for Western blot-analyse. (B) H1299-celler ble serum-sultet ved inkubering i fravær av FBS i 24 timer og behandlet med IGF-1 i seks timer som indikert. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse. S: kort eksponering; L:. Lang eksponering
Siden vi tidligere har vist at IGF-1 kan aktivere p53, og MDM2 er en direkte nedstrøms p53 target [24], spurte vi om effekten av IGF-1 på ekspresjon av MDM2 er avhengig av p53. Vi behandlet p53-null human ikke-småcellet lungekreft H1299 celler med IGF-1. IGF-1 var fortsatt i stand til å indusere MDM2-protein ekspresjon i H1299-celler på en doseavhengig måte (figur 1B), noe som viser at IGF-1-mediert oppregulering av MDM2 er uavhengig av p53.
Deretter vi undersøkt om IGF-1 up-regulerer MDM2 protein nivåer ved å øke sin protein stabilitet. Som forventet, IGF-1 øket MDM2-protein ekspresjon (figur 2A). Imidlertid, IGF-1 behandlingen forandret ikke vesentlig MDM2-protein halveringstid, som bestemt ved behandling med proteinsyntese-inhibitor cykloheksimid (figur 2A og 2B), og ved puls-chase eksperimenter (figur 2C og 2D). Vi undersøkte om IGF-1 induserer MDM2 ved å øke sine mRNA nivåer. Imidlertid, kvantitativ PCR (Q-PCR) -analyse viste at MDM2 mRNA-nivåer ble ikke signifikant påvirket av IGF-1 behandling (figur 2E), noe som indikerer at IGF-1 ikke påvirker steady-state mRNA-nivåer.
( A) U2-OS-celler ble serum-sultet i 24 timer før behandling med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Cellene ble deretter behandlet med 50 pg /ml cykloheksimid (CHX) i nærvær eller fravær av IGF-1 og oppsamles ved de angitte tider. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse for MDM2 og aktin. (B) Kvantitativ analyse av MDM2 proteinnivåer fra celler behandlet med CHX ble utført ved densitometri skanning for hver enkelt MDM2 proteinbånd, og den tilsvarende aktin proteinbåndet. Forholdet mellom MDM2 løpet av aktin ved nulltidspunktet ble vilkårlig satt som 100 prosent. Tre uavhengige eksperimenter ble utført med tilsvarende resultater. (C) U2-OS-cellene behandlet med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer og metabolsk merket med
35S-metionin i førti minutter, og deretter renset med kald metionin. Cellelysater med like mengder radioaktivitet ble immunoutfelt med SMP14 antistoff mot MDM2. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og visualisert ved autoradiografi. (D) Kvantitativ analyse ble utført ved densitometri skanning ved hjelp av Imagequant programvare. (E) serum-sultet U2-OS-cellene behandlet med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. MDM2 genekspresjon nivåer ble bestemt ved kvantitativ PCR-(Q-PCR) og normalisert til GAPDH uttrykk. Data presentert som middel og SE av to uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
Hemming av mTOR av rapamycin Blocks IGF-1 og heregulin-mediert oppregulering av MDM2
AKT har blitt vist å være en viktig regulator av mTORC1 aktivitet. Således har vi undersøkt hvorvidt den mTOR reaksjonsveien spiller en rolle i IGF-1-mediert oppregulering av MDM2. For dette formål vi serum-sultet og deretter forbehandlet U2-OS celler med rapamycin, en selektiv inhibitor for mTOR [28], før IGF-1-behandling. Som forventet, blokkerte rapamycin fosforylering av ribosomalt protein S6 (figur 3A). Spesielt, rapamycin også blokkert IGF-1-indusert MDM2 oppregulering (figur 3A). Lignende resultater ble observert i H1299 celler, hvori rapamycin avskaffet IGF-1-indusert MDM2 oppregulering og fosforylering av 4EBP1 (figur 3B). Videre uttrykk for konstitutivt aktiv AKT (myristinsyre-AKT) førte til en økning på MDM2 protein nivåer, som ble fullstendig blokkert i nærvær av rapamycin (figur 3C). Samlet utgjør disse dataene sterkt støtte ideen om at en rapamycin sensitiv veien er kritisk for oppregulering av MDM2 via IGF-1 /PI3K /AKT signalering.
U2-OS (A) eller H1299 (B) celler ble serum-sultet og forbehandlet med rapamycin (50 nM) i fire timer, og deretter behandlet med IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Celler ble lysert og utsatt for Western blot-analyse. Kvantitative analyser av MDM2 proteinnivåer ble utført ved densitometri skanning for hver enkelt MDM2 proteinbånd, og den tilsvarende aktin proteinbåndet. Forholdet mellom MDM2 løpet av aktin i kontrollprøven ble vilkårlig satt som 1,0. (C) U2-OS-cellene ble infisert med rekombinant adenovirus som koder GFP eller myristinsyre-AKT i 24 timer før behandling med rapamycin (100 nM) i fire timer. Cellelysater ble utsatt for western blot analyse.
Siden heregulin kan aktivere AKT, vi spurte om dette ligand kan opp-regulere MDM2 i en mTOR-avhengig måte. MCF-7-celler eller H1299-celler ble serum-sultet før behandling med rapamycin, og så behandlet med heregulin-beta (HRG). Som vist på figur 4A, aktivering av AKT signalering av HRG effektivt indusert MDM2-protein ekspresjon, som ble fullstendig blokkert av rapamycin i begge MCF-7 og H1299-celler (figur 4A og 4B). I tillegg PI3K-inhibitor LY294002 effektivt hemmet virkningen av HRG på oppregulering av MDM2 (figur 4B), som indikerer at heregulin-mediert oppregulering av MDM2 er avhengig av PI3K. Sammen indikerer disse data at en rapamycin følsom bane er nødvendig for oppregulering av MDM2 av IGF-1 eller heregulin signalveier.
(A) MCF-7-celler ble serum-sultet og forbehandlet med rapamycin (50 nM) i fire timer, og deretter behandlet med heregulin-beta (HRG; 25 ng /ml) i 24 timer. Celler ble lysert og utsatt for Western blot-analyse. (B) i serum-sultet H1299-celler ble forbehandlet med rapamycin (50 nM) eller LY294002 (20 uM) i fire timer, og deretter behandlet med heregulin-p (25 ng /ml) i 24 timer. Cellelysater ble utsatt for western blot analyse.
Uttrykk for en Mutant 4EBP1 Defekt i mTOR Fosforylering Demper IGF-1-mediert oppregulering av MDM2
Vi neste fastslått om eIF4E, en større nedstrøms mål for mTOR, er involvert i IGF-1-mediert oppregulering av MDM2. Siden mTOR fosforylerer 4EBP1, noe som resulterer i sin dissosiasjon fra eIF4E og fører til dannelsen av translasjons-initierings-komplekset [29], anvendte vi mutant 4EBP1-5A, som mangler de fem Ser /Thr fosforyleringsseter målrettet av mTOR og således virker som en dominant negativ inhibitor av binding elF4E for å hindre oversettelse initiering [30]. For dette formål ble H1299-celler transient transfektert med enten villtype eller 4EBP1 4EBP1-5A, etterfulgt av serum sult og IGF-1-behandling. Som vist i figur 5A, IGF-1 behandling førte til en kraftig økning i fosforylering av AKT, S6 og 4EBP1, korrelert med en markert økning i MDM2 uttrykk. Spesielt uttrykk for villtype 4EBP1 ikke vesentlig endre effekten av IGF-1 på MDM2 uttrykk, trolig på grunn av effektiv fosforylering av 4EBP1 i H1299 celler. Imidlertid, IGF-1-mediert MDM2 oppregulering ble betydelig inhibert av ektopisk ekspresjon av 4EBP1-5A. Neste, for å undersøke hvilken rolle eIF4E direkte, ablated vi endogen eIF4E ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) i U2-OS celler. Mens stanse eIF4E påvirket ikke basal MDM2 uttrykk (figur 5B), knockdown av eIF4E avskaffet helt effekten av IGF-1 på å øke MDM2 nivåer, til tross for tydelig 4EBP1 fosforylering (figur 5C).
(A) H1299 cellene ble transient transfektert med vill-type 4EBP1, 4EBP1-5A, eller vektor-plasmidet. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene delt og opprettholdt i ytterligere 24 timer før serum sult i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med eller uten IGF-1 (50 ng /ml) i seks timer. Celler ble lysert og underkastet Western blotting. Kvantitative analyser av MDM2 proteinnivåer ble utført ved densitometri skanning for hver enkelt MDM2 proteinbånd, og den tilsvarende aktin proteinbåndet. Forholdet mellom MDM2 løpet av aktin i kontrollprøven (kolonne 1) ble vilkårlig satt som 1,0. (B) U2-OS celler ble transient transfektert med siRNA bestemt mot eIF4E (si4E) eller en kryptert kontroll (siScr). Cellelysater ble utsatt for Western-blotting, som vist. (C) U2-OS-celler transfektert med si4E eller siScr var serum-sultet i 24 timer før behandling med eller uten 5 ng /ml IGF-1 i seks timer. Cellelysater ble utsatt for Western-blotting, som vist. (D) U2-OS celler ble transient transfektert med siRNA bestemt mot S6K (siS6K) eller en kryptert siRNA (siScr). Cellelysater ble utsatt for Western-blotting, som vist. (E) U2-OS-celler transfektert med siS6K eller siScr var serum-sultet i 24 timer før behandling med eller uten 5 ng /ml IGF-1 i seks timer. Cellelysater ble utsatt for Western-blotting, slik som vist.
I tillegg til å fosforylere og inhibering 4EBP1, fosforylerer og aktiverer mTOR ribosomalt protein S6-kinase (S6K), som i sin tur fosforylerer og aktiverer ribosomalt protein S6 i for å øke protein oversettelse. Dermed ablated vi S6K av siRNA i U2-OS celler. Som vist på figur 5D og 5E, observerte vi liknende effekter som eIF4E knockdown, som indikerer IGF-1-mediert MDM2 oppregulering krever mTOR-signalering, som omfatter både de eIF4E og S6K trasé.
Rapamycin behandling reduserer MDM2 Expression og sensitizes kreftceller til å Doxorubicin- apoptose
Siden MDM2 er en viktig negativ regulator av p53, som er essensiell for DNA-skade-indusert apoptose, undersøkte vi effekten av rapamycin på doxorubicin-indusert apoptose i p53-positiv kreftceller. Vi valgte MCF-7 brystkreft celler fordi de havn en somatisk mutasjon i PIK3CA genet som overfører en konstitutivt aktiv AKT-mTOR vei [31]. MCF-7-celler ble forbehandlet med rapamycin, etterfulgt av behandling med en lav dose av doxorubicin. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon assay og western blot-analyse for spaltning av poly ADP-ribose polymerase (PARP), en biokjemisk markør for apoptose. Under disse betingelser hverken rapamycin eller doxorubicin alene betydelig apoptose. Imidlertid, i nærvær av rapamycin, doksorubicin effektivt indusert celledød (figur 6A). Spesielt, rapamycin fullstendig blokkert oppregulering av MDM2, men ikke av p53 (figur 6B). Lignende fenomener ble observert i menneskelige osteosarkom SJSA-1 celler, som rommer MDM2 forsterkning [25] (figur 6C og 6D). Sammen tyder disse data på at rapamycin undertrykker MDM2-protein ekspresjon, noe som resulterer i sensitivisering av kreftceller til Doxorubicin-indusert celledød.
(A-B) MCF-7-celler ble opprettholdt i normal vekstmedier, forbehandlet med rapamycin (100 nM) i 48 timer, og deretter behandlet med doxorubicin (0,6 ug /ml) i 24 timer. Både flytende og adherente celler ble samlet opp og underkastet trypanblått-utelukkelse assay (A) og western blot analyse (B). Cellelevedyktighet er presentert som en prosentandel av levende celler i løpet av de totale celler tellet. Data presentert som middel og SE av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo. (C) SJSA-1-celler ble opprettholdt i normal vekstmedier, forbehandlet med rapamycin (100 nM) i 48 timer og deretter behandlet med doksorubicin (1 pg /ml) i 36 timer. Både flytende og adherente celler ble samlet opp og underkastet Western blot-analyse. (D) Morfologi av SJSA-1 celler ble registrert av fasekontrastmikroskop (100 ×).
Vi neste undersøkt om nedregulering av MDM2 spiller en utløsende rolle i sensibilisering av celler til doxorubicin av rapamycin behandling. Vi behandlet U2-OS celler med rapamycin og doksorubicin enten i nærvær eller fravær av ektopisk ekspresjon av MDM2. Som vist i figur 7A, MDM2 uttrykk dramatisk tilbakestilt spaltes PARP-nivåer sammenlignet med celler som uttrykker en vektorkontroll. Spesielt, MDM2 uttrykk redusert p53-proteinnivåer, samt Ser15 fosforylering av p53. Videre MDM2 uttrykk effektivt reddet celledød indusert av rapamycin pluss doxorubicin kombinasjonsbehandling (figur 7B og 7C). Disse data indikerer at inhibering av MDM2 opp-regulering av rapamycin er i stor grad ansvarlig for sensibiliserende celler overfor kjemoterapeutiske behandling.
(A-B) U2-OS-cellene ble transient transfektert med MDM2 eller et vektorkontroll. Tjuefire timer etter transfeksjonene ble cellene forbehandlet med rapamycin (100 nM) i 48 timer og deretter behandlet med doksorubicin (1 pg /ml) i 36 timer. Både flytende og adherente celler ble samlet opp og underkastet Western-blotting (A) eller strømningscytometri-analyse (B). (C) Morfologi av U2-OS celler ble registrert av fasekontrastmikroskop (100 ×).
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at IGF-1 up-regulerer MDM2 protein nivåer via mTOR veien, og dermed legge et lag av fin regulering til MDM2-p53 sti ved IGF-1 /AKT signalkaskade. AKT er tidligere vist for fysisk å interagere med og fosforylerer MDM2, noe som letter MDM2 nukleær translokasjon [16]. Fosforylering av MDM2 forbedrer MDM2 interaksjon med p300, og dermed øke ubiquitin E3 ligase aktivitet mot p53 og tilrettelegging p53 ubiquitinering og degradering [17]. I tillegg har fosforylering av MDM2 på Ser166 og Ser188 av AKT vist seg å stabilisere MDM2-protein ved å hemme selv ubiquitinering [19]. Men det ble også rapportert at AKT-mediert fosforylering av MDM2 ser ikke ut til dramatisk påvirke MDM2 subcellulære lokalisering [18]. Således, selv om det er klart at AKT positivt regulerer MDM2, de nøyaktige molekylære mekanismene som synes å være celletype og kontekstavhengige.
Tidligere studier antyder at MDM2 kan reguleres på det translasjonelle nivå. Forbedret oversettelse av MDM2 er blitt observert i humane choriocarcinoma-cellelinjer [32]. Den MDM2 mRNA inneholder en distinkt 5 «utranslatert region (UTR) som spiller en rolle i translatorisk effektivitet [33]. I tillegg økte MDM2 ekspresjon indusert av BCR /ABL ekspresjon er assosiert med øket MDM2 oversettelsen på grunn av regulering ved 5 «UTR fra MDM2 mRNA [34]. Videre hemning av IGF-1-signalisering, enten ved å knockout av IGF-1-reseptor (IGF-1R), eller ved en IGF-1R kinase-inhibitor, har vist seg å redusere MDM2 oversettelse mediert via sin 5 «UTR [35]. Spesielt har det blitt rapportert at hepatocytter vekstfaktor (HGF) letter MDM2 oversettelse via mTOR i embryonale hepatocytter [36].
I denne studien, viser vi at både IGF-1 og heregulin signale aktivere MDM2 gjennom AKT -mTOR veien. Denne studien har to viktige implikasjoner. Først cellulære responser på ulike spenninger konvergerer på p53-MDM2 vei, som tjener som sentral sensor for stress. For det andre, er det to viktige regulatoriske mekanismer for å modulere MDM2 proteinnivåer: p53-avhengig transkripsjonsregulering og mTOR-avhengige translasjonelle kontroll. Stress-signaler, inkludert DNA-skade, hypoksi, næringsmangel og oksidativt stress, aktiverer p53, som i sin tur transkripsjonelt opp-regulerer ekspresjon MDM2. Vekstfaktor-signalering, på den annen side aktiverer AKT-mTOR-reaksjonsvei for å forbedre MDM2 proteintranslasjon. Denne delikate regulering av MDM2 sikrer at p53 er under streng kontroll. Videre våre data viser at eIF4E eller S6K ablasjon ikke i vesentlig grad påvirker MDM2 basalnivåer. Men stanse av enten eIF4E eller S6K fullstendig avskaffet IGF-1-indusert MDM2 oppregulering. Disse resultatene indikerer at den mTOR-reaksjonsveien er nødvendig for vekstfaktor-mediert MDM2 oppregulering.
Inhibering av mTOR å bruke spesifikke farmakologiske hemmere fører G1 /S cellesyklus-stans, demping av cellevekst, og apoptose [37 ]. Prekliniske studier indikerer at rapamycin og dets derivater hemme kreftcellevekst og proliferasjon, som har vist seg både
in vitro
og i en rekke humane kreft ved hjelp av dyremodeller [38]. I tillegg ble det rapportert at hemming av mTOR fremmer apoptose gjennom translasjonell kontroll av Mcl-en, en BCL-2 som familiemedlem [39]. Men i de fleste tilfeller er hemmingen av mTOR alene ikke effektivt indusere apoptose; heller, sensitizes det cellene apoptotiske stimuli. For eksempel øker rapamycin muligheten for cisplatin, for å indusere apoptose i humane promyelocytisk leukemicellelinjer og ovarie cancer-cellelinjer [40]. RAD001, et rapamycinderivat, har vist seg å sensibilisere et antall av p53-positive cancerceller til cisplatin-indusert apoptose ved å hemme p21 protein uttrykk gjennom undertrykkelse av oversetter [41]. Videre rapamycin lysfølsomt flere myelomcellelinjer til deksametason-indusert apoptose, forbundet med redusert uttrykk for cyclin D2 og survivin [42]. Det har også blitt rapportert at ekspresjon av konstitutivt aktive mutante 4E-BP1 etterligner effekten av rapamycin i å forbedre apoptose i multiple myelomceller, noe som tyder på at mTOR inhibitorer sensibilisere celler ved å hemme cap-avhengige oversettelse [43]. I samsvar med denne oppfatningen, små molekyler som er rettet mot cap-avhengige oversettelse initiering av hemming av eIF4A kan gjenopprette narkotika følsomhet i en muslymfom modell [44].
I denne studien, observerte vi at rapamycin og doxorubicin kombinasjonsbehandling førte til redusert MDM2 ekspresjon, noe som resulterte i økt apoptose, impliserer at p53 kan være involvert i denne prosess. Våre data viser at doxorubicin oppregulert p53, som forventet. Men mens rapamycin /doxorubicin kombinasjonsbehandling ikke signifikant innvirkning p53 protein nivåer, fosforylering på serin 15 på p53 ble økt, noe som tyder på at p53 aktivitet ble indusert. Viktigere, ektopisk uttrykk for MDM2 reverseres apoptose, samtidig med redusert p53 protein nivåer og serin 15 fosforylering. Likevel kan MDM2 også ha p53-uavhengig funksjon for å inhibere apoptose i nærvær av doksorubicin /rapamycin kombinasjonsbehandling.
Oppsummert viser vår studie at rapamycin sensitizes kreftceller overfor kjemoterapeutiske legemiddel-indusert apoptose og antyder at mTOR -targeted kreft-behandling kombinert med kjemoterapi kan være mer effektiv i behandling av p53-positive kreft.
Materialer og metoder
cellekultur, medikamentell behandling og Plasmider
Menneskelig bryst MCF-7-celler, osteosarkomceller U2-OS-celler og ikke-småcellet lungekarsinom H1299-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 4,5 g /l glukose supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; sertifisert, GIBCO) , 100 enheter /ml penicillin (Gibco), 100 ug /ml streptomycin (GIBCO), og 2 mM L-glutamin (GIBCO). Alle cellelinjer ble passert ved å bruke 0,05% Trypsin-EDTA-oppløsning (GIBCO). Celler ble opprettholdt i en fuktet 37 ° C inkubator under en 5% CO
2 atmosfære. Celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). MCF-7, U2-OS eller H1299 celler ved 60-70% konfluens ble serum-sultet i 24 timer i serumfritt DMEM før IGF-1-behandling. IGF-1 (Sigma) ble fremstilt som en 100 pg /mL stamløsning i vann. Kjemiske hemmere LY294002, PD98059, SB202190 (Calbiochem), og Rapamycin (Sigma) ble utarbeidet som 1000 × stamløsninger. Doksorubicin (Sigma) ble fremstilt som en 2 mg /ml stamløsning. Heregulin-beta (Upstate) ble fremstilt som en 20 mikrogram /ml oppløsning i PBS. For UV-behandling, ble media fjernet og cellene bestrålt med lokk fjernet i en Spectrolinker XL-1000 UV Kryssbindings (Spectronics Corporation). Etter bestråling, ble media lagt til rettene og cellene ble dyrket som angitt for hvert forsøk før samling av både flytende og tilhenger celler.
Adenoviral Infeksjon, Transient Transfeksjon og RNA interferens
Celler på 60% konfluens ble infisert med adenovirus som koder for AKT eller et vektorkontroll, og inkubert i to timer ved 37 ° C med mild agitering i tyve minutters mellomrom, etterfulgt av tilsetning av dyrkingsmedier og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 i 24 timer. H1299 celler på 80% sammenflytning eller U2-OS celler ved 50% konfluens ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. Media ble erstattet åtte (H1299) eller seks (U2-OS) timer etter transfeksjon. Liten interfering RNA mot eIF4E (AAGCAAACCUGCGGCUGAUCU), S6K (GGACATGGCAGGAGTGTTT) og egge siRNA styrer spesifikk for hver siRNA oligonukleotid ble kjøpt fra Shanghai GenePharma Co., Ltd og transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Western Blot Analysis
Celler ble samlet opp, vasket med PBS og resuspendert i EBC
250 lyseringsbuffer (250 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5% Nonidet P-40, 50 mM NaF, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid , 2 ug /ml aprotinin, og 2 ug /ml leupeptin). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad). Like mengder protein ble lastet, separert ved SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner (Millipore), og hybridisert til et passende primært antistoff og HRP-konjugert sekundært antistoff for etterfølgende påvisning ved forsterket kjemiluminescens. Monoklonalt antistoff SMP14 spesifikt for MDM2 (Santa Cruz) ble brukt på 1:200 fortynninger. Monoklonalt antistoff DO-1 spesifikt for p53 (Santa Cruz) ble anvendt ved en fortynning på 1:250. Polyklonalt antistoff C-11 spesifikk for aktin (Santa Cruz) ble anvendt ved en fortynning på 1:1000. Antistoffer spesifikke for PARP (# 9542), fosfor-AKT (Ser473; # 9271), total AKT (# 9272), Phospho-S6 ribosomalt protein (serin 235/236; # 2211), S6 ribosomalt protein (# 2217), S6 kinase (# 9202), eIF4E, Phospho-4EBP1 (Ser65; # 9456) eller 4EBP1 (# 9452) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology og brukes ved 1:1000 fortynninger
flowcytometrisystemer Analysis
Cellene ble trypsinert, vasket med kald PBS og fiksert i 70% etanol ved 4 ° C over natten. Celler ble farget med propidiumjodid (PI) supplert med 80 pg /ml RNase A ved 37 ° C i mørke i en time. Cellene ble deretter utsatt for flowcytometri analyse av FACScan Flowcytometer (Becton Dickson), og dataene ble analysert ved hjelp av Cell quest software (Becton Dickson).
Kvantitativ PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp Tryzol i henhold til produsentens instruksjoner (Gibco). RNA ble revers transkribert ved hjelp iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad). Reaksjonen ble også utført i fravær av revers transkriptase for å tjene som en negativ kontroll. Q-PCR ble utført i 25 mL reaksjonsvolumer (8 ng cDNA, 12,5 mL Taqman Universal PCR Master Mix, 1,25 mL Demand Gene Expression Reagens, Applied Biosystems) for både MDM2 og GAPDH. Q-PCR reaksjonen ble utført i en ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Den Q-PCR-betingelsene var som følger: 10 minutter ved 95 ° C etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og gløding /som strekker seg ved 60 ° C i ett minutt. Relative kvantiteringsstandarder verdier ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt metoden.
celleviabilitet analysen
Både flytende og tilhenger celler ble samlet og resuspendert i PBS. Like volumer av trypan blå flekk-oppløsning (0,4%, Gibco) og cellesuspensjon ble blandet og farget i fem minutter ved romtemperatur. Antallet flekker og ufargede celler ble talt med en hemacytometer. Minst 500 celler per prøve ble tellet. Prosenten av levedyktigheten representerer forholdet mellom ufargede celler til totale celler. Elevens
t-
test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans av forskjeller mellom gruppene.
Takk
Vi takker Dr. J Lawrence (University of Virginia, Charlottesville, Virginia) for pCMV4-4EBP1 og pCMV4-4EBP1-5A plasmider.
