Abstract
Bakgrunn
Det har vært ansett som den deteksjonsmetoder for sirkulerende tumorceller (CTCs) basert på epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM) undervurdere antall CTCs og kan gå glipp av en metastatisk undergruppe med kreft stamcelle (CSC) egenskaper. Derfor undersøkte vi EpCAM-positive og -negative CTCs i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter på ulike stadier, vurderes den kliniske verdien av disse CTCs og utforsket sin kapasitet i følgende CSC modell.
Metoder
CTCs ble beriket av uttømming av leukocytter med bi-antistoffer ved hjelp av en magnetisk perle separasjonsteknikk og deretter identifisert ved uttrykket av EpCAM og cytokeratin 7 og 8 ved hjelp av multi-parameter flowcytometri. Vi bestemte fordelingen av CTCs klassifisert av uttrykket av EpCAM i 46 NSCLC pasienter med stadium I til IV, vurderes den diagnostiske verdien av disse CTCs av langsgående overvåking i 4 indeks pasienter i løpet av adjuvant behandling og preget stemness av disse CTCs av uttrykket av CXCR4 og CD133 10 pasienter.
Resultater
EpCAM-negative (E-) CTCs ble påvist å være betydelig høyere enn EpCAM-positive (E +) CTCs i stadium IV (
p
= 0,003). Pasientene med prosentdelen av E-CTCs mer enn 95% (
r
95%) ble funnet å være signifikant øket fra 13,3% i stadium I-II til 61,1% i trinn IV (
p
= 0,006). Kaplan-Meier analyse viste at pasienter med
r
95% hadde signifikant kortere overlevelse enn de med
r
≤ 0,95 (
p
= 0,041). Langsgående overvåking av CTCs viste at pasienter med en høy prosentandel av E-CTCs i blodet var ikke reagerer på enten kjemoterapi eller målrettet terapi. Ytterligere karakterisering av CTCs avdekket at en stilk-lignende undergruppe CXCR4 + CD133 + CTCs ble funnet å være signifikant mer utbredt i E-CTCs enn i E + CTCs (
p
= 0,005).
Konklusjoner
berikelse av CTCs ved nedbryting av leukocytter med bi-antistoffer er en verdifull metode for å estimere antall CTCs, som kan potensielt brukes til å forutsi prognosen, overvåke terapeutiske effekten av NSCLC pasienter og ytterligere analysere biologi CTCs
Citation. Yin J, Wang Y, Yin H, Chen W, Jin G, Ma H, et al. (2015) Sirkulasjonstumorceller beriket av Nedbryting av leukocytter med Bi-antistoffer i ikke-småcellet lungekreft: Potensiell klinisk anvendelse. PLoS ONE 10 (8): e0137076. doi: 10,1371 /journal.pone.0137076
Redaktør: Huei-Wen Chen, Graduate Institute of Toxicology, TAIWAN
mottatt: 24 januar 2015; Godkjent: 12 august 2015; Publisert: 28 august 2015
Copyright: © 2015 Yin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av Jiangsu Natural Science Foundation (BK20141435); Innføring av talent Foundation (2011RC11); Medical Science and Technology Development Foundation, Nanjing Department of Health (YKK13088); Nøkkelen Program of Natural Science Foundation of China National (81230067); National Key Basic Research Program Grant (2013CB911400)
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft. -relaterte død [1], og ca 85% av lungekreft tilfellene er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Selv om systematisk behandling har blitt bedre, er den samlede fem års overlevelse bare 10-20% [2]. Den primære årsaken til den lave overlevelsen er fjernmetastaser av tumorceller. I metastatisk cascade, har sirkulerende tumorceller (CTCs) blitt ansett for å være sentrale aktører i dannelsen av fjernmetastaser [3]. En tidligere studie viste at CTCs uttrykker epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM) kan påvises i NSCLC stadium IV og er en roman prognostisk faktor for denne sykdommen [4]. Imidlertid har det vært antydet at de metoder basert på uttrykk for EpCAM undervurdere antall CTCs og kan gå glipp av en metastatisk undergruppe av CTCs med kreft stamcelle (CSC) egenskaper [5, 6]. En fersk studie rapporterte at CTCs oppdages 2 ganger mer effektivt ved Iset (isolering av størrelsen på epiteliale kreftceller) enn ved CellSearch, og at en undergruppe av CTCs, som uttrykte ikke EpCAM (dvs. E-CTCs), kan være påvist i blodet hos pasienter med NSCLC [7]. En annen studie har også vist at opptellingen av disse cellene er mye høyere enn for CTCs fanges opp av CellSearch [8]. Til nå har den kliniske verdien og biologi av disse E-CTCs vært uklar, og en fersk publikasjon har indikert at fremtidige studier bør omfatte påvisning av E-CTCs [9].
CTCs omgår epitel-mesenchymale overgang (EMT) er blitt ansett for å spille en viktig rolle i dannelsen av neoplasmer [5]. EMT kan generere celler med stamcelleegenskaper [10]. Under EMT, ekspresjonen av EpCAM i tumorceller vil bli nedregulert. En tidligere studie rapporterte at SDF-1 /CXCR4 akse spiller en viktig rolle ved formidling av cellemigrering og overlevelse etter en TGF-β-indusert EMT [11]. Imidlertid er det fortsatt uklart om disse (eller noen) CTCs med nedregulert EpCAM har en økt metastatisk seeding potensial eller økt motstand mot systemisk behandling, og som nylig antydet, en større prognostisk verdi [12]. Vår tidligere studie viste at CXCR4-uttrykke CTCs ble påvist i blodet hos pasienter med svulster [13]. En fersk studie rapporterte at oppregulering av CXCR4 er funksjonelt avgjørende for vedlikehold av stemness i multiresistent NSCLC celler [14]. Derfor er det nødvendig å karakterisere stemness av E-CTCs.
CTCs er sjeldne i blodet til kreftpasienter, og studier av biologien til CTCs er begrenset av lav konsentrasjon og utbytte av CTCs [9] . Selv om tidligere studier har vist at Iset teknikken er mer effektive i å fange E-CTCs i NSCLC [7, 8], en fersk studie rapporterte at lungesvulster vokser raskere og kaster et betydelig antall dødelige metastatiske celler ved små størrelser [15]. Derfor er en «objektiv» isolering fremgangsmåte for CTCs ønskelig. Vi har tidligere etablert en negativ anrikning av CTCs [16], som er basert på uttømming av leukocytter ved anvendelse av en magnetisk vulst separasjonsteknikk, og etterfølgende påvisning ved multi-parameter flowcytometri. I denne studien har vi forbedret denne teknikken ved å tappe leukocytter med bi-antistoffer til å forbedre renheten av CTCs for deres karakterisering og fremtidig anvendelse i molekylær analyse. Ved denne metoden, bestemt vi fordelingen av CTCs klassifisert av uttrykket av EpCAM i 46 NSCLC pasienter med etapper fra I til IV, undersøkt deres diagnostisk verdi i systematisk terapi ved langsgående overvåking av disse CTCs i 4 indeks pasienter, vurderes den prognostiske verdien av disse CTCs og preget stemness av disse CTCs ved å måle uttrykket av CXCR4 og CD133.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og friske frivillige før du deltar i studien. Blodprøvetakning og analyser ble godkjent av Institutional Review Board of Nanjing Medical University. Utformingen og gjennomføringen av studien omfatter mennesker ble klart beskrevet i en forskningsprotokoll.
Studier befolkning og forberedelse av blodprøver
Perifere blodprøver fra 46 NSCLC pasienter ble samlet inn fra januar til november i 2013 i Nanjing Chest Hospital og Jiangsu kreft sykehus. Pasientenes egenskaper er angitt i tabell 1. Blod ble tatt etter kassering av den første 2 ml for å unngå potensiell hudceller forurensning fra venepunksjon, og deretter behandlet i løpet av 4 timer etter innsamling. Blodprøvene fra 4 indeks pasienter ble også samlet inn ved slutten av hver periode med kjemoterapi eller målrettet behandling umiddelbart, og den terapeutiske effekten av pasienter ble vurdert i henhold til Response evalueringskriterier i solide svulster.
CTC berikelse
celle~~POS=TRUNC løsninger fra blodprøver ble fremstilt som tidligere beskrevet [16]. CTCs ble så beriket av uttømming av leukocytter med bi-antistoffer i henhold til følgende trinn: først, basert på Leukocytt felles antigen CD45, human fullblods CD45 Nedbryting Kit (EasySep, stamceller Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) ble brukt som det første skrittet for leukocytt uttømming; andre, basert på leukocytter overflateantigen CD53 ble cellene farget med PE mus anti-human CD53 antistoff (BD Bioscience, USA), vasket med PBS og deretter ytterligere utarmet med PE positiv utvelgelse Kit (EasySep, stamceller Technologies, Inc., Vancouver , BC, Canada) som det andre trinnet for leukocyttene. Prosedyren ble utført i henhold til produsentens instruksjoner med mindre modifikasjoner.
Flowcytometri
Etter berikelse, CTCs ble delt likt inn i 2 rør og farget med humant anti-EpCAM, anti-CK7 /8 , anti-CD45 (BD Bioscience, USA) i det første rør og tilsvarende isotypekontrollantistoffer i det andre røret. For å utforske biologi av CTCs i stemness ble beriket cellene sammen farget med humant anti-CXCR4 (BD Bioscience, USA) og anti-CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Tyskland) (i det første røret) og tilsvarende isotypekontrollantistoffer ( i det andre rør) i 10 prøver. Sluttkonsentrasjonen av hvert antistoff var 10 ug /ml. En FACS AriaIII system (BD Biosciences) ble utført for å bestemme uttrykket av alle merkene, og data ble analysert ved hjelp FlowJo 7.2.5 programvare (Tre Star, Ashland, OR, USA). Celler med ekspresjonen av de ovennevnte markører ble styrt av den tilsvarende isotypekontroll basert på tydelig skille mellom dem. CTCs ble definert som Cytokeratin + CD45-CD53- celler.
Spike eksperiment
Den menneskelige lungekreft cellelinje PC9 (høy uttrykk for EpCAM og Cytokeratin) ble bidratt med Kreft Center of Nanjing Medical universitet og dyrket i høy glukose DMEM-medium inneholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. PC9 celler ble høstet i henhold til den samme prosedyre som tidligere er beskrevet [16]. Null, 10, 50, 100 og 500 PC9 celler ble tilsatt i 2 ml blod fra friske frivillige. PC9 Cellene ble deretter anriket i henhold til fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Etter anrikning, ble CTCs delt likt i 2 rør og farget med humant anti-EpCAM, anti-CK7 /8, anti-CD45, og de tilsvarende isotype kontroll-antistoff. I flowcytometrisk analyse, prosentandelen av CTCs i alle forble celler (inkludert leukocytter og CTCs) etter anrikning ble definert som renheten av CTCs. Recovery og renhet ble beregnet til å evaluere resultatene av metoden, som ble fastsatt som følger: Recovery = n
1 /n
2 x 100%, renhet = n
1 /(n
1 + n
3) x 100% (n
1 var antallet PC9 celler som finnes etter berikelse; n
2 ble antall PC9 celler tilsatt i 2 ml blod; n
3 var antall leukocytter funnet etter anrikning). Spiking eksperiment i hver tilstand ble gjentatt tre ganger
For å sjekke vår CTC-plattformen er fortsatt gjennomførbar, ble PC9 cellelinje med lav uttrykk for EpCAM oppnådd i henhold til følgende trinn:. Celler ble sådd med en tetthet på 5 x 10
5-celler i fire 6 cm skåler og inkuberes i 5% CO
2, 95% luft ved 37 ° C inntil dens densitet nådde 80%. Dyrkede celler ble holdt i serumfritt DMEM (0,1% BSA, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære til over natten, og deretter stimulert med 5 ng /ml rhTGF-β1 (Peprotech, USA) i det samme medium i 3 dager. Spiking eksperimenter ble satte bruk av denne type PC9 celler (kalt PC9-EMT) i henhold til samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor.
Cutoff verdi
baseline av E + og E-CTCs ble bestemt ved sin opplisting i blodprøvene fra 11 friske frivillige. Cut-off verdier av E + og E-CTCs ble beregnet ved den øvre grense av den midlere verdi av CTCs pluss standardavvik (SD). Hvis de to typer av CTCs var både under cutoff verdier, denne pasienten ville bli definert som å ha uoppdaget CTCs og vil bli utelukket fra statistisk analyse. Hvis bare én type CTC var under verdien grenseverdien, vil denne type CTC bli behandlet som 0 for enkelhets skyld i den statistiske analysen. Prosentandelen av E-CTCs ble beregnet i henhold til det totale antall av E + og E-CTCs. Dersom prosentdelen av E-CTCs var høyere enn 95% (
r
95%)., Denne pasienten ville bli betraktet som å ha absolutt flertall av E-CTCs i blodet
Statistisk analyse
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP ble utført med Stata statistiske pakker (Stata Corporation, College station, TX, USA). Mann-Whitney og χ
2 tester ble brukt for å sammenligne de to gruppene. Cox modellen ble utført ved hjelp av SPSS (Statistical Package for Social Sciences) v. 16.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL) for å vurdere sammenhengen mellom overlevelse av pasienter og andelen av CTCs.
P
verdier 0,05 ble ansett for å presentere betydelige forskjeller.
Resultater
Evaluering av CTC berikelse metoden
Etter stimulering av TGF-β i 3 dager, uttrykk for EpCAM i PC9 celler redusert fra 97,7% til 51,7%. Ved å bruke vår metode i tilsetnings eksperimenter, middelverdi av utvinningen /renhet av PC9 og PC9-EMT-celler var 80,7% /9,5% og 74,3% /9,5%, henholdsvis. Kalibreringskurven er vist i figur 1. Det er et lineært forhold til skråningen på 0,678 (0,782) mellom logaritmene PC9 celler (PC9-EMT celler) ble funnet og PC9 celler (PC9-EMT celler) ble tilsatt.
kalibrerings~~POS=TRUNC kurver~~POS=HEADCOMP i spiking eksperimenter ved hjelp av (A) PC9 cellelinje og (B) PC9-EMT celler; (C) FACS analyse for uttrykket av EpCAM i PC9 og PC9-EMT celler stimulert av 5 ng /ml TGF-β i 3 dager.
cutoff verdier av E + og E-CTCs ble bestemt i 11 blodprøver fra friske frivillige. E + CTCs ble detektert i bare en prøve, og E-CTCs ble detektert i 8 prøver. Middelverdien av CTCs + SD var 0,09 + 0,30 og 1,18 + 0,98 /ml blod for E + og E-CTCs, respektivt. Derfor null og to ble definert som cutoff verdier for E + og E-CTCs hhv.
I 46 blodprøver, ble CTCs uoppdaget i fem prøver (1 i fase II og fire i stadium IV) på grunn av både E + og E-CTCs under tilsvarende cutoff-verdier. I 41 blodprøver med påviste CTCs, Middelverdien [utvalg] av renheten av CTCs var 10,6% [0,1% -51,1%]. Av disse prøvene, 36,6% (15 av 41) hadde en renhet på CTCs enn 10,0%. Den maksimale renhet CTCs var 51,1%. Representative resultatene av FACS analyse er gitt i S1 Fig.
Distribusjon av CTCs hos pasienter
De deteksjon priser av E + og E-CTCs er vist i figur 2A. E + CTCs ble påvist i 13 av 16 (81,3%) stadium I-II, 6 av 8 (75,0%) trinn III og 8 av 22 (36,4%) Trinn IV pasienter. E-CTCs ble påvist i 13 av 16 (81,3%) stadium I-II, 8 av 8 (100%) trinn III, og 18 av 22 (81,8%) Trinn IV pasienter. E + CTCs var fast bestemt på å bli betydelig lavere i stadium IV pasienter enn i stadium I-II pasienter (
p
= 0,007). E + CTCs og E-CTCs ble påvist å være vesentlig annerledes i stadium IV pasienter (
p
= 0,003). Videre er to av 15 (13,3%) stadium I-II, 3 av 8 (37,5%) trinn III, og 11 av 18 (61,1%) Trinn IV pasienter ble påvist å ha en absolutt flertall av E-CTCs i blodet (
r
95%). Frekvensen av pasienter med
r
95% ble påvist å være betydelig høyere i stadium IV enn i stadium I-II pasienter (
p
= 0,006, figur 2B).
(A) Fordeling av deteksjonsrater E + og E-CTCs hos pasienter på ulike stadier; (B) Prosent av detekterte pasienter med en prosentandel av E-CTCs høyere enn 95% (
r
95%); (C) Fordeling av antallet E + og E-CTCs hos pasienter på forskjellige stadier; (D) Fordeling av Andel E-CTCs i forskjellige stadier. (+ /+, Cytokeratin + EpCAM +; +/-, Cytokeratin + EpCAM-).
Ifølge cutoff-verdier, ble CTCs påvist i 41 pasienter og fordelingen av antall E + og E -CTCs er vist i figur 2C. Medianverdiene [indre kvartilområdet, IR] /ml blod fra E + og E-CTCs var 6,0 [2,5 til 12,0] og 18. [11,0 til 47,5] i fase I-II pasienter, 11,0 [3.25-16.0] og 31,5 [22,5 -31,5] i trinn III og 6,5 [2,25 til 49,25] og 15,5 [5,75 til 35,75] i stadium IV pasienter. Det var en signifikant forskjell i antallet E + og E-CTCs både i stadium I-II og III (
p
= 0,001 for begge), men ikke i stadium IV fordi antallet E + CTCs ble øket hos flere pasienter. Fordelingen av prosentdelen av E-CTCs er vist i figur 2D. Medianverdiene [IR] av prosentandelen av E-CTCs var 83,0% [50,0% -91,0%] i stadium I-II, 90,0% [72,8% -99,0%] i stadium III og 100,0% [60,5% -100,0% ] i stadium IV pasienter. Selv om en stor andel av E-CTCs ble funnet i alle ledd, det var ikke en signifikant forskjell.
Longitudinal oppfølging av CTCs i adjuvant behandling
E + og E-CTCs ble dynamisk overvåket i fire indeks pasienter, og resultatene er vist i figur 3. Pasient 1 (fig 3A og S2 figur), som hadde progressiv sykdom etter første behandling med Gefitinib, viste at sykdommen delvis til fullstendig remisjon ved behandling med pemetrexed (pemetrexeddisodium) + cisplatin . Antallet E + CTCs redusert 4-0 /ml blod, men antallet E-CTCs økt fra 15 til 44 /ml blod i den første perioden og redusert til nær 0 /ml blod i løpet av de siste tre perioder. Prosentandelen av E-CTCs var 79% ved begynnelsen, noe økt til 100% i løpet av den første perioden, ble redusert til 50% og holdt ved dette nivået i de følgende to perioder, men ble ikke oppdages i den siste periode.
(A) Gefitinib og deretter ALIMTA + cisplatin behandling; (B) Paclitaxel liposome + cisplatin og deretter strålebehandling + erlotinib behandling; (C) ALIMTA + carboplatin og deretter erlotinib behandling; (D) Erlotinib behandling. Hver behandlingsperiode var en måned.
Pasient 2 (Fig 3B og S3 figur), som hadde progressiv sykdom etter første behandling med paclitaxel liposom + cisplatin, viste stabil sykdom i løpet av den første perioden, men hadde progressiv sykdom i løpet av andre periode på grunn av en hjernemetastaser. Etter behandling med strålebehandling + erlotinib, denne pasienten viste delvis remisjon av sykdommen. Antallet E-CTCs redusert 34-3 /ml blod i den første perioden, økte til 13 /ml blod i den andre perioden og deretter redusert til 3 /ml blod i den siste perioden, mens antallet E + CTCs viste ufølsom endring fra 0, 0, 2 til 1 /ml blod i løpet av behandlingen. Prosentandelen av E-CTCs ble opprettholdt på høyt nivå (100%) i løpet av den første perioden, og deretter redusert til 87% og 75% i de to siste periodene.
Pasient 3 (Fig 3C og S4 Fig ), som hadde progressiv sykdom etter første behandling med pemetrexed + carboplatin, viste delvis remisjon i løpet av den første perioden, men hadde progressiv sykdom under den andre perioden av behandling med erlotinib. Denne pasienten døde en måned senere. Antallet E-CTCs redusert 69-10 /ml blod i den første periode, og øket til 25 og 19 /ml blod i de to siste perioder. Antallet E + CTCs viste en unormal endring 8-23 /ml blod i den første perioden, og deretter redusert til 7 /ml blod og umulig å oppdage i de to siste periodene. Prosentandelen av E-CTCs ble opprettholdt på et høyt nivå (90%) i begynnelsen, ble redusert til 30% sammen med en respons til partiell remisjon av sykdommen, og deretter øket til 78% og 100% etter sykdommens progresjon.
Pasient 4 (figur 3D og S5 figur), som hadde progressiv sykdom i den innledende diagnose, viste delvis remisjon, stabil sykdom, progressiv sykdom og stabil sykdom fra første til fjerde periode ved behandling med erlotinib. Antallet E-CTCs viste en fluctuant endring fra 23, 17, 6, 17-5 /ml blod, mens E + CTCs var nesten uoppdaget til alle tider. Prosentandelen av E-CTCs ble opprettholdt nær 100% hele tiden.
Oppfølgings
Alle pasientene hadde oppfølgings poster fra 10 til 20 måneder avhengig av samplingstiden. Sytten pasienter døde på grunn av en fjernmetastaser (stadium I-II: 3 tilfeller; stadium III: 3 tilfeller; stadium IV: 11 tilfeller). I de 17 tilfellene ble 4 pasienter ekskludert fra den statistiske analysen fordi CTCs ble uoppdaget. I 41 pasienter med påvisbare CTCs, 9 av 16 pasienter med absolutt flertall av E-CTCs i blodet (
r
95%) og 8 av 25 pasienter med
r
≤ 95% døde. Kaplan-Meier analyse viste at pasienter med
r
95% hadde signifikant kortere overlevelse enn de med
r
≤ 95% (
p
= 0,041, figur 4).
Karakterisering av CTCs i stemness
for å utforske kapasiteten CTCs følgende CSC modell, bestemt vi uttrykk for CXCR4 og CD133 på E + og E-CTC, henholdsvis 10 pasienter. CXCR4 ble påvist i 8/10 av pasienter innenfor undergruppe av E-CTCs, mens det ble påvist i bare 3/10 av pasientene innenfor undergruppe av E + CTCs. Både CXCR4 og CD133 ble påvist i 6/10 av pasienter innenfor undergruppe av E-CTCs, mens de ble oppdaget i bare 1/10 av pasienter innenfor E + CTCs gruppen. CXCR4 + CTCs og CXCR4 + CD133 + CTCs ble funnet å være signifikant høyere i E-CTCs enn i E + CTCs (
p
= 0,021 og 0,005, henholdsvis figur 5A). I tillegg ble et uttrykk for CD133 funnet å være betydelig høyere i CXCR + E-CTCs enn i andre typer CTCs (
p
= 0,029, figur 5B). Interessant, i de samme individene, antallet CTCs med ekspresjonen av CXCR4 og /eller CD133 var alltid mer innenfor undergruppen av E-CTCs enn den for E + CTCs. Ingen pasienter ble funnet at uttrykket av CXCR4 og /eller CD133 ble påvist kun i E + CTCs men ikke i E-CTCs.
Fordeling av (A) antall CXCR4 + og CXCR4 + CD133 + celler og ( B) positivitets deteksjon priser av CXCR4 + CD133 + celler i CTCs klassifisert av uttrykket av EpCAM i 10 NSCLC pasienter.
Diskusjoner
CTCs kan brukes som en prognostisk markør [17 , 18]. Imidlertid har det lave antallet og lav konsentrasjon av CTCs begrenset studier av biologien til CTCs [9, 19]. På grunn av heterogeniteten av CTCs, er det vanskelig å fange opp alle typer CTCs ved EpCAM-baserte metoder. En mer fornuftig strategi er å utarme leukocytter. Ved hjelp av den forbedrede fremgangsmåte, var renheten av CTCs økte med 10 ganger i tilsetnings eksperimenter, og opp til 50 ganger høyere i blodprøver, sammenlignet med en tidligere rapportert fremgangsmåte basert på magnetiske nanobeads [16]. Ved hjelp av denne metode, kan den midlere verdi av renheten av CTCs være opp til 10% i tilsetnings eksperimenter og 10,6% i de blodprøver av pasienter, som også støttet dens videre anvendelse i molekylær analyse. Denne metoden er sammenlignbare for påvisning av CTCs med og uten ekspresjon av EpCAM. I resultatene, 36,4% (for E + CTCs) og 81,8% (for E-CTCs) av pasientene hadde stadium IV sykdom. Disse dataene er i samsvar med de publiserte resultater som E + CTCs ble påvist i bare 23 ~ 32% av avansert NSCLC pasienter ved CellSearch og 80% av de som etter størrelse isolasjon strategi [4, 7]. Denne metoden er spesifikk for identifisering av CTCs med og uten ekspresjon av EpCAM. Både E + og E-CTCs ble funnet å være mye lavere i blodprøver fra friske frivillige i forhold til de i pasienter, som var også i overensstemmelse med en tidligere publisert studie [20]. Selv om E + og E-CTCs ble uoppdaget i fem pasienter, er det mulig at opptellingen av CTCs var lavere enn cutoff-verdier eller fraværende fra flere spesifikke markører for å identifisere de heterogene tumorceller i NSCLC [21, 22].
i den foreliggende studien undersøkte vi fordelingen av CTCs med og uten ekspresjon av EpCAM i NSCLC ved en forbedret fremgangsmåte. I resultatene, ble E + og E-CTCs detektert til å være signifikant forskjellig bare i stadium IV pasienter, selv om de ikke var i fase I-II og III-pasienter. Videre er prosentandelen av pasienter med et absolutt flertall av E-CTCs i blodet økes betydelig fra trinn I-II til IV. Videre er resultatene etter Kaplan-Meier analyse viste at pasienter med et absolutt flertall av E-CTCs i blodet hadde en kortere overlevelsestid enn pasienter med en lav prosentandel av E-CTCs. Disse resultatene antydet at prosentandelen av E-CTCs kunne brukes til å forutsi prognosen for pasienter med NSCLC.
For tiden er uklar den diagnostiske verdien av CTCs med og uten ekspresjon av EpCAM i NSCLC. I denne studien har vi gjennomført langsgående overvåking i 4 indeks pasienter i løpet av adjuvant behandling. Prosentandelen av E-CTCs ble funnet å være mer nøyaktig enn antallet E + CTCs ved vurdering av terapeutisk effekt på både kjemoterapi og målrettet terapi. Videre ble et lavt antall E-CTCs assosiert med en positiv respons hos pasienter. Disse resultatene antydet at prosentandelen av E-CTCs kan ha potensial som en markør i overvåkingen og forutsi av den terapeutiske effekt i NSCLC. Det er mulig at noncancerous cellene kan tas med i E-CTCs [9], og vi kan heller ikke finne noen klinisk verdi i det enkle telling av E-CTCs. Dette fenomenet var også konsistent med de nylig publiserte resultatene på kjemoterapi i brystkreft [23]. Men våre data tydet på at en høy andel av E-CTCs kan innebære en styrket evne til kreftceller i invasjon og spredning.
For å utforske ovenfor biologi CTCs, preget vi stemness av CTCs med ulike uttrykksprofiler av EpCAM å følge resultatene av vårt tidligere arbeid [13]. Tidligere studier har foreslått at en kombinasjon av CXCR4 og CD133 kan brukes som markør CSC [24, 25]. I våre resultater, ble CXCR4 + CD133 + CTCs oppdaget å være betydelig mer utbredt i E-CTCs enn de i E + CTCs, og antall E-CTCs med uttrykk for CXCR4 og /eller CD133 var alltid mer enn for E + CTCs i de samme personene, som foreslo at E-CTCs syntes å være mer stilk-lignende. Dette resultatet kan forklare, i det minste delvis, det dårlige resultat i pasienter med overveldende E-CTCs i blodet til en viss grad. Videre CXCR4 ble oppregulert i løpet av TGF-β indusert EMT. Potensialet forholdet mellom mer demme lignende E-CTCs og EMT bør undersøkes nærmere. Selv om et relativt lite antall pasienter som ble anvendt i denne studien, disse resultatene bidra til en bedre forståelse av forholdet mellom CSC og EMT i CTCs. Ytterligere forskning med et stort prøvestørrelse og EMT identifikasjon er nødvendig for å klarlegge status for denne type CTCs og dens funksjon i tumorprogresjon av NSCLC.
Konklusjon
Med utgangspunkt i en teknikk for CTC berikelse av uttømming av leukocytter med bi-antistoffer, denne studien vurderte klinisk verdi av CTCs med og uten EpCAM uttrykk i NSCLC. Våre data antyder at prosentandelen av E-CTCs signifikant øket fra trinn I-II til IV, og kan brukes til å vurdere den fjerne metastase, terapeutisk effekt og prognosen for pasienter i NSCLC. Videre E-CTCs syntes å være mer stilk-aktig enn E + CTCs. Disse resultatene gir det første bevis for den potensielle klinisk anvendelse av E-CTCs i NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Representant FACS analyse på CTCs i blodprøver av 4 NSCLC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Computertomografi (CT) bilder for pasient 1 behandlet med Gefitinib og deretter ALIMTA (pemetrexeddisodium) + cisplatin
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. CT-bilder av pasienten 2 behandles med paklitaksel liposom + cisplatin og deretter strålebehandling + erlotinib
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s003 plakater (TIF)
S4 Fig. CT-bilder av pasienten tre behandlet med ALIMTA + carboplatin og deretter erlotinib
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s004 plakater (TIF)
S5 Fig. CT-bilder av pasienten fire behandlet med erlotinib
doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s005 plakater (TIF)
