Abstract
Formål
For å undersøke
in vitro Hotell og
in vivo
effekten av den doble PI3K /mTOR-hemmer NVP-BEZ235 i behandling av
PIK3CA
villtype tykktarmskreft (CRC).
Experimental design
PIK3CA
mutant og villtype menneskelige CRC cellelinjer ble behandlet
in vitro
med NVP-BEZ235, og de resulterende effektene på spredning, apoptose, og signale ble vurdert. Colonic svulster fra en genmodifisert mus (GEM) modell for sporadisk villtype
PIK3CA
CRC ble behandlet
in vivo
med NVP-BEZ235. De resulterende effektene på makroskopisk tumorvekst /regresjon, spredning, apoptose, angiogenese, og signal ble undersøkt.
Resultater
In vitro
behandling av CRC cellelinjer med NVP- BEZ235 førte til forbigående PI3K blokade, vedvarende nedgang i mTORC1 /mTORC2 signalering, og en tilsvarende nedgang i celle levedyktighet (median IC
50 = 9,0 til 14,3 nM). Lignende effekter ble sett i parvise isogene CRC-cellelinjer som avvek bare i nærvær eller fravær av en aktiverende
PIK3CA
mutant allel.
In vivo
behandling av colonic tumorbærende mus med NVP-BEZ235 førte til forbigående PI3K hemming og vedvarende blokade av mTORC1 /mTORC2 signalering. Langsgående tumor overvåking av optisk kolonoskopi viste en 97% økning i tumorstørrelse i kontrollmusene (p = 0,01) sammenlignet med en 43% reduksjon (p = 0,008) i behandlede mus.
Ex vivo
analyse av NVP-BEZ235-behandlede tumorer viste en 56% reduksjon i proliferasjon (p = 0,003), ingen effekt på apoptose, og en 75% reduksjon i angiogenese (p = 0,013).
Konklusjoner
Disse studiene gir den prekliniske begrunnelsen for studier som undersøker effekten av den doble PI3K /mTOR-hemmer NVP-BEZ235 i behandling av
PIK3CA
villtype CRC.
Citation: Roper J, Richardson MP, Wang WV, Richard LG, Chen W, Kaffe EM, et al. (2011) Dual PI3K /mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 induserer Tumor regresjon i et genmanipulert mus modell av
PIK3CA
Wild-Type tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (9): e25132. doi: 10,1371 /journal.pone.0025132
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 14 juni 2011; Godkjent: 25 august 2011; Publisert: 26.09.2011
Copyright: © 2011 Roper et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute (2U01CA084301) og National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer (NIDDK) (5K08DK7803325, R03DK088014, og T32-DK07542). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i 2011 vil tykktarmskreft (CRC) fortsette å være den tredje vanligste årsaken til kreftrelaterte dødelighet i USA [1]. Til tross for den voksende arsenal av kjemoterapeutika, er median overlevelse for pasienter med metastatisk CRC fortsatt mindre enn 20 måneder, noe som understreker det akutte behovet for utvikling av nye terapeutiske tilnærminger [2].
mammalian target of rapamycin ( mTOR) er en serin /treonin kinase som regulerer cellulær proliferasjon og apoptose. mTOR binder reguleringstilknyttet protein av mTOR (Raptor) og pattedyr LST8 /G-protein β-subenheten lignende protein (mLST8 /GβL) for å danne det mTOR-kompleks 1 (mTORC1), som fremmer oversettelse gjennom fosforylering av p70 S6-kinase (S6K), S6 ribosomalt protein (S6), og eukaryot initiering faktor 4E binding protein 1 (4E-BP1). Alternativt kan mTOR binde rapamycin-insensitive følgesvenn av mTOR (Rictor), mLST8 /GβL og pattedyr stress aktivert protein kinase samspill protein 1 (mSIN1) for å danne mTOR kompleks 2 (mTORC2) [3], [4].
oppstrøms phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalveien kan aktivere mTOR. Klasse IA PI3Ks aktiveres av vekstfaktor-reseptor-tyrosin-kinaser (RTK) og er sammensatt av en heterodimer bestående av en p110α /p110β katalytisk og en P85 regulatorisk subenhet [5].
PIK3CA plakater (phosphatidylinositol 3-kinase, katalytisk, α-polypeptid) genet som koder p110α ofte mutert i mange humane kreftformer, inkludert CRC [6]. Punktmutasjoner i
PIK3CA
klynge på to hotspots: E545K i spiral domene (ekson 9) og H1047R i den katalytiske kinase domene (ekson 20). Disse mutasjonene øke p110α aktivitet og fremme CRC cellevekst, invasjon, og migrasjon
in vitro
via aktivering av PI3K veien [7]. Mutasjoner i spiralformede og katalytiske domener av
PIK3CA
konferere hovedsak identiske fenotyper i humane CRC cellelinjer [7]. AKT er en kritisk nedstrøms effektor av PI3K reaksjonsveien og fremmer cellevekst og overlevelse gjennom en rekke mekanismer, herunder fosforylering av TSC2, noe som resulterer i aktivering mTORC1 [5]. Full aktivering av AKT oppnås etter fosforylering på Thr308 og Ser473 med henholdsvis PDK1 og mTORC2, [5], [8] -. [11]
På grunn av sin sentrale rolle i kreftutvikling, er mTORC1 blokaden et attraktivt terapeutisk strategi for CRC. Behandling av APC Δ716 mus med mTORC1 inhibitoren everolimus hemmer cellulær proliferasjon og tumorangiogenese, noe som resulterer i en reduksjon både i antall og størrelse av tarmsvulster [12]. Vi har nylig rapportert at behandling av en genmodifisert mus (GEM) modell for sporadisk CRC med mTORC1 hemmer rapamycin resulterer i en 80% reduksjon i enkelte tumorvekst, som observert av langsgående koloskopi overvåking [11]. Imidlertid kan den kliniske effekten av mTORC1 blokade dempes ved samtidig tapet av en mTORC1 avhengig negativ feedback loop på PI3K signale (reflekteres av økt AKT fosforylering på Thr308), og fortsatte mTORC2-mediert aktivering av AKT gjennom fosforylering på Ser473 [9 ] – [14]. Faktisk, den første kliniske studie undersøker effekten av mTORC1 inhibitor everolimus i avanserte solide tumorer demonstrert beskjeden fordel i bare én av 16 pasienter med kolorektal kreft og generell økt fosforylering av AKT på Ser473 [13]. Til sammen ser det ut til at terapeutiske strategier der PI3K og mTOR er samtidig hemmet kan være mest effektive.
NVP-BEZ235 (Novartis) er en dual pan-klasse I PI3K og mTOR kinase inhibitor som har vist seg å redusere tumorvekst i en rekke forskjellige xenograft og flere genetisk konstruert mus (GEM) modeller og er for tiden i kliniske forsøk [14] – [50]. Det har vært antydet at bruken av slike midler kan være begrenset til tumorer med aktiverende mutasjoner i
PIK3CA product: [51], [52]. Som aktivere
PIK3CA
mutasjoner er sett i bare 17% av CRC, ville dette innebære slike midler kan være rettet mot bare en liten andel av pasientene [53]. Fordi NVP-BEZ235 hemmer villtype og mutante former av
PIK3CA
med sammenlignbar effekt [32], hypotese vi at NVP-BEZ235 kan ha betydelig effekt ved behandling av
PIK3CA
vill skriver CRC.
i dette manuskriptet, beskriver vi resultater fra
in vitro
behandlingsstudier viste sammenlignbar effekt av NVP-BEZ235 mot både
PIK3CA
mutant og villtype human CRC cellelinjer. Vi beskriver også resultater fra
in vivo
behandlings studier som viser signifikant effekt i en GEM modell for sporadisk villtype
PIK3CA
CRC. Til sammen våre funn gir en overbevisende preklinisk begrunnelsen for kliniske studier for å undersøke bruken av NVP-BEZ235 i behandling av
PIK3CA
villtype CRC pasienter.
Materialer og metoder
In vitro
behandling av menneskelig CRC cellelinjer
HCT116 (
PIK3CA
mutant, kinase domene på H1047R), DLD-en (
PIK3CA
mutant, spiraldomene på E545K), og SW480 (
PIK3CA
villtype) menneskelige CRC cellelinjer (ATCC) og isogen DLD-1
PIK3CA
mutant og villtype celler (hentet fra B. Vogelstein) ble opprettholdt i DMEM (Invitrogen) med 10% FBS og 1 x penicillin /streptomycin (Invitrogen). Cellene ble sådd ut i forskjellige innledende tettheter (HCT116: 3000 celler /brønn, DLD-1: 5.500 celler /brønn, SW480: 4500 celler /brønn, DLD-en
PIK3CA
mutant: 7000 celler /brønn, og DLD -1
PIK3CA
villtype: 9.000 celler /brønn) til å gjøre rede for differensialvekstkinetikk. Etter 16 timer ble cellene inkubert med økende konsentrasjoner av NVP-BEZ235 (Novartis), og legemiddel inneholdende vekstmedium ble skiftet hver 24 timer. Celleviabilitet ble vurdert 16 timer etter den første platekledning og 48 timer etter oppstart av medikamentell behandling ved hjelp av kolo MTS analysen CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation Assay (Promega), i henhold til produsentens anvisninger. Cellenes levedyktighet etter medikamentbehandling ble normalisert med den i ubehandlede celler også dyrket i 48 timer. IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp av 4 parameter lineær regresjon i GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). For western blot analyse ble cellene belagt med 0 nM eller maksimal hemmende dose (500 nM) NVP-BEZ235 for 2, 6, 24 eller 48 timer.
Sekvensering av colonic svulster fra en GEM modell for sporadisk CRC
C57BL /6J
Apc
betinget knockout mus (Apc CKO) ble behandlet med Adeno-Cre, som tidligere beskrevet [11]. Etter obduksjon ble 10 tumorprøver oppsamlet i 1 ml RNA Senere (Invitrogen, Inc), som er lagret over natten i 4 ° C, deretter fjernet fra RNA senere og arkiveres på -80 ° C. RNA ble ekstrahert fra prøvene ved bruk av RNeasy (Qiagen, Inc.), og cDNA ble dannet med revers transkriptase (RT Omniscript, Qiagen, Inc.). Primere designet av forfatterne av studien ble brukt til å lage 553 bp og 477 bp amplikonene (PCR utføres ved hjelp av Platinum PCR SuperMix High Fidelity, Invitrogen, Inc) spenner kodoner 532-554 av ekson 9 (spiral domene, 9F: 5 «GCAGTGTGGTGAAGTTTCCA 3», 9R: 5 «TGGCCAATCCTTTGATTTGT 3») og c1011-1062 av ekson 20 (kinase domene, 20F: 5 «ACTGCGTGGCAACCTTTATC 3», 20R: 5 «TGATGGTGTGGAAGATCCAA 3») av
Pik3ca
genet, henholdsvis, som inkluderer mutasjon hotspot regioner. Sanger-sekvensering av de amplikonene ble utført på biopolymerer Facility ved Harvard Medical School, og resultatene analysert med Sequencher 4.10.1 (Gene Codes, Inc).
In vivo
behandling av en GEM modell for sporadiske CRC
APC CKO mus ble behandlet med Adeno-Cre og etterfulgt av optisk kolonoskopi, som tidligere beskrevet [11]. Som et colonoscopic metrisk for tumorstørrelse, ble tumorstørrelsen Index (TSI) beregnet som (tumor område /tarmlumen område) x 100 (%). Tumor-bærende mus ble tilfeldig fordelt til behandling med enten kontroll bærer alene (n = 8) eller 45 mg /kg kroppsvekt NVP-BEZ235 på 10% 1-metyl-2-pyrrolidon /90% PEG 300 (n = 8) etter daglig oral tvangsforing i 28 dager. Behandlingen Dosen ble valgt basert på litteratur som indikerer at 40-50 mg /kg kroppsvekt NVP-BEZ235 effektivt behandler murine tumormodeller uten ugunstige virkninger [15], [24], [26], [28], [32], [ ,,,0],47]. Basert på farmakokinetiske studier som viser maksimal vev konsentrasjon en time etter NVP-BEZ235 administrasjon, ble tumorbærende mus ofret en time etter siste behandling dose [32]. Kolon tumorvolumet ble vurdert ved hjelp calipers (bredde x lengde x høyde) og svulster ble høstet for både vestlige blot analyse og immunhistokjemi.
Western blot analyse
Konsentrasjoner av fullcelle eller tumorlysatene ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad). 10 ug og 25 ug protein lysat for hele cellen og tumor, henholdsvis, ble separert på 10% SDS /PAGE-gel, overført til nitrocellulosemembran, blokkert i 1% BSA i en time, inkubert ved romtemperatur i to timer med primært antistoff og en time med sekundært antistoff. Deteksjon ble utført ved hjelp av Amersham ™ ECL ™ Western blot Detection Reagenser (GE Healthcare). p-AKT Thr308 (1:1000 fortynning), p-AKT Ser473 (1:2000 fortynning), total AKT (1:1000 fortynning), p-S6 Ser240 /244 (1:3000 fortynning), p-S6 Ser235 /236 (1:1000 fortynning), S6 (1:1000 fortynning), kløyvde caspase 3 (1:1000 fortynning), og kløyvde PARP (1:1000 fortynning) ble oppnådd fra cellesignalisering Technologies (Beverly, MA). β-aktin (1:5000 fortynning) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Peroxidase AffiniPure Donkey Anti- Rabbit Ig sekundært antistoff (1:10,000 fortynning) ble hentet fra Jackson Immunoresearch (West Grove, PA) [11].
Immunohistochemistry
Fem mikrometer parafininnstøpte vevssnitt ble deparaffinized i xylen etterfulgt av alkohol rehydrering. Antigen henting ble utført i en × citratbuffer (pH 6,0) (Zymed) ved hjelp av en medisinsk Decloaking Chamber (Biocare Medical). Lysbilder ble blokkert ved romtemperatur med peroksidase Blokkering Reagens (DAKO), normal esel /kaninserum, og Avidin /Biotin Blokkering Kit (Vector Laboratories). Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff og 30 minutter ved værelsestemperatur med sekundært antistoff. Vectastain ABC kit (Vector Laboratories) ble brukt for deteksjon henhold til produsentens anvisninger. Lysbilder ble farget med Liquid DAB + Substrat kromogen System (Dako) per produsentens instruksjoner og kontra med Mayers hematoksylin løsning og Scotts Bluing løsning. p-AKT Ser473 (1:50 fortynning), p-S6 Ser240 /244 (1:50 fortynning), p-S6 Ser235 /236 (1:100 fortynning), ble hentet fra cellesignalisering Technologies (Beverly, MA). CD31 (1:100 fortynning) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California). KI-67 (1:100 fortynning) ble hentet fra USA Biological (Swampscott, MA). TUNEL analysen (Apoptag) ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA) [11]. KI-67 proliferasjon Indeksen ble beregnet som det gjennomsnittlige antall KI-67 positive celler /totalt antall kjertelceller pr høy effekt felt (gjennomsnitt av 16 høye kraftfelter) x 100, og microvessel tetthet (MVD) ble beregnet som antall CD31 positive celler per høy effekt felt (gjennomsnittlig 16 høy effekt felt). TUNEL positivitet indeksen ble beregnet som gjennomsnittet antall tunel positive celler /totalt antall kjertelceller per høy effekt felt (gjennomsnittlig 16 høy effekt felt) × 100. Målingene ble utført av tre blinde, uavhengige observatører i fire kontroll og fire behandlede svulster.
statistikker
Sammenligninger av slutttumorvolumet, KI-67, MVD og apoptotiske celler mellom kontroll og NVP- BEZ235 behandlet kohorter ble beregnet ved hjelp av de to-tailed Independent-Samples T Test. Før og etter behandling TSI verdiene ble sammenlignet med Wilcoxon signed-rank test. P 0,05 ble ansett som vesentlig for alle analyser. Alle analyser ble beregnet ved hjelp av SPSS 18.0 for Windows (IBM, Inc).
Resultater
In vitro
NVP-BEZ235 behandling av humane CRC cellelinjer reduserer celleformering, men har ingen effekt på apoptose
for å undersøke effekten av
in vitro
NVP-BEZ235 behandling på mobilnettet levedyktighet, tre menneskelige CRC cellelinjer (HCT116, DLD-en, og SW480) ble behandlet med økende mengder av NVP-BEZ235 i 48 timer, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved en kolorimetrisk assay MTS. Disse undersøkelser avslørte en lignende nedgang doseavhengig i levedyktighet etter at NVP-BEZ235 behandling (bety IC
50 av tre separate forsøk = 14,3 ± 6,4, 9,0 ± 1,5 og 12,0 ± 1,6 nM for HCT116, DLD-1, og SW480 cellelinjer, henholdsvis; p = 0,74) for alle tre cellelinjer (figur 1A). For å finne ut om den observerte nedgangen i mobilnettet levedyktighet etter NVP-BEZ235 behandling resulterte fra en induksjon av apoptose, western blot analyse for kløyvde caspase-3 og spaltet PARP ble utført, avslører ingen økning i disse apoptotiske markører med NVP-BEZ235 behandling (Figur 1B ). Samlet utgjør disse studiene tyder på at
in vitro
behandling med NVP-BEZ235 resulterer i en tilsvarende reduksjon i celleformering i to CRC cellelinjer husing tydelig
PIK3CA
mutasjoner (HCT116 og DLD-1) så vel som i en
PIK3CA
villtype kolorektal cancer celle (SW480), med ingen effekt på apoptose.
(A) Cellenes levedyktighet av HCT116, DLD-1, og SW480 CRC celle linjer ble vurdert ved MTS-analyse etter behandling med økende konsentrasjoner (0-500 nM) av NVP-BEZ235 i 48 timer. Resultatene som er vist er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. (B) Western blot analyse for p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, p-S6
Ser235 /236, kløyvde caspase 3, og kløyvde PARP ble utført etter 2, 6, 24 og 48 timer inkubasjon med (-). 0 eller (+) 500 nM NVP-BEZ235
In vitro
NVP-BEZ235 behandling av menneskelige CRC cellelinjer resulterer i vedvarende mTORC1 og mTORC2 hemming, men forbigående PI3K blokade
for å undersøke effekten av
in vitro
NVP-BEZ235 behandling på PI3K (p-AKT
Thr308) , mTORC1 (p-S6
Ser235 /236 og p-S6
Ser240 /244), og mTORC2 (p-AKT
Ser473) mTOR signalering, western blot analyse ble utført. Etter to timer med NVP-BEZ235 behandling, nivåer av p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, og p-S6
Ser240 /244 var betydelig redusert. Mens en vedvarende nedgang ble observert i nivåene av p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, og p-S6
Ser240 /244, full hemming av p-AKT
Thr308 var tapt i så lite som seks timer (Figur 1b). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at
in vitro
NVP-BEZ235 behandling resulterer i vedvarende hemming av mTORC1 og mTORC2 signale, men det PI3K blokaden er forbigående.
Effekten av
in vitro
NVP-BEZ235 behandling av humane CRC cellelinjer er ikke avhengig av PIK3CA mutasjonsstatus
sammenlignbar effekt av NVP-BEZ235 behandling i
PIK3CA
mutant (HCT116 og DLD-1) og
PIK3CA
villtype (SW480) menneskelige CRC cellelinjer tyder på at den kliniske effekten ikke kan være begrenset til pasienter med tumorer inneholde aktivere
PIK3CA
mutasjoner. For ytterligere å undersøke denne muligheten, vurdert vi effekten av NVP-BEZ235 på cellulær proliferasjon og intracellulær cellesignalisering i sammenkoblede
PIK3CA
mutant og vill-type cellelinjer.
PIK3CA
mutant cellelinjen ble avledet fra DLD-en gjennom forstyrrelse av villtype
PIK3CA
allelet av målrettet homolog rekombinasjon, mens
PIK3CA
vill-type celle linjen ble avledet gjennom forstyrrelse av mutant
PIK3CA
allel (en slags gave fra B. Vogel) [7]. Som sådan, skiller den genetiske sammensetningen av disse cellene bare på
PIK3CA
locus, noe som gjør disse ellers perfekte isogene kontroller. Vi fant lignende IC50 er for NVP-BEZ235 både
PIK3CA
mutant og villtype DLD-1 celler (bety IC
50 av tre separate forsøk = 15,1 ± 6,0 og 12,1 ± 4,3 nM for DLD-en
PIK3CA
mutant og vill-type cellelinjer, henholdsvis, p = 0,82, figur 2A). Western blot-analyse av p-AKT og p-S6 avslørte vedvarende inhibering av p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, og p-S6
Ser240 /244; imidlertid, inhibering av p-AKT
Thr308 var forbigående i begge cellelinjer (figur 2B). Videre har NVP-BEZ235 behandling ikke øke nivåene av spaltet kaspase-3 og spaltet PARP i begge cellelinje (figur 2B). Samlet er disse funnene tyder på at
PIK3CA
mutasjonsstatus ikke forutsi effekten av NVP-BEZ235 behandling i humane CRC cellelinjer.
(A) Celleviabilitet av mutant og villtype isogen
PIK3CA
-celler ble bestemt ved MTS-analyse etter behandling med økende konsentrasjoner (0-500 nM) av NVP-BEZ235 i 48 timer. Resultatene som er vist er gjennomsnitt av fire uavhengige eksperimenter. (B) Western blot analyse for p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, p-S6
Ser235 /236, kløyvde caspase 3, og kløyvde PARP ble utført etter 2, 6, 24 og 48 timer inkubasjon med (-). 0 eller (+) 500 nM NVP-BEZ235
In vivo
NVP-BEZ235 behandling induserer tumor regresjon i en GEM modell for sporadisk PIK3CA villtype CRC
for å undersøke effekten av
in vivo
NVP-BEZ235 behandling på colonic tumorvekst, vi brukte en roman GEM modell for sporadisk CRC at vi har nylig beskrevet [11]. Adenovirus uttrykker Cre recombinase (Adeno-Cre) ble brukt til å indusere colonic svulster i floxed
Apc
mus. Svulster fra 10 mus ble analysert for tilstedeværelse av aktiverende mutasjoner ved direkte sekvensering av exoner 9 og 20 i
Pik3ca
genet. Ingen mutasjoner ble identifisert, noe som tyder på at disse musene er representative for
PIK3CA
villtype CRC. Optisk koloskopi ble brukt til å random behandling av sammenlignbare størrelse colonic svulster med kontroll narkotika kjøretøy eller 45 mg /kg NVP-BEZ235 ved daglig oral sonde i 28 dager. Vi merket ingen toksisitet eller bivirkninger i løpet av denne behandlingsregime. Etterfølgende langsgående vekst eller regresjon av individuelle tumorer i kolon, ble bestemt ved hjelp av optisk kolonoskopi, som tidligere beskrevet [11]. For hver svulst, ble en relativ tumorstørrelse Index (TSI) metrisk beregnet som tumorstørrelse (T) normalisert til colonic luminal området (L) (figur 3A).
Mus med kolon svulster ble randomisert til behandling med kontroll fortynningsmiddel (N = 8) eller 45 mg /kg NVP-BEZ235 (N = 8) ved daglig oral tvangsforing i 28 dager. Resulterer colonic tumorvekst eller regresjon ble serie undersøkt ved optisk koloskopi. (A) Tumor størrelse Index (TSI) ble beregnet som tumorområdet (T) delt på Lumen Area (L) x 100. (B) Representant svulst koloskopi stillbilder i løpet av 28 dagers behandlingsperioden. (C) Tumor volum av kontroll og NVP-BEZ235-behandlede tumorer ved obduksjon (gjennomsnittlig 65 mm
3 sammenlignet med 5 mm
3; p = 0,01). (D) Slutt TSI vs. Tumor Volume (R
2 = 0,89, P 0,0001). Endring i gjennomsnittlig TSI for (E) kontroll (32% pre-behandling vs. 57% etter behandling, P = 0,01) og (F) behandlet (32% vs. 20%, p = 0,02) kohorter.
Et representativt tidsforløpet for koloskopi bilder for kontroll (n = 8) og NVP-BEZ235-behandlede tumorer (n = 8) er vist i figur 3B. Tumorvolumet ved obduksjon var betydelig større kontroll vs. behandlede grupper (65 mm
3 mot 5 mm
3; p = 0,01; Figur 3C). I henhold til våre tidligere analyser [11], den endelige TSI i begge behandlingsgruppene positivt korrelert med tumorvolumet ved obduksjon (R
2 = 0,89, p = 0,0001, figur 3D). Den midlere TSI i kontrollgruppen økte betydelig i løpet av behandlingsperioden (32% pre-behandling sammenlignet med 57% etterbehandling, p = 0,01, figur 3E), mens det i den NVP-BEZ235 kohort signifikant redusert (36% vs. 20%, p = 0,008; figur 3F). Hver tumor i kontrollgruppen økte i størrelse; behandlede tumorer alle redusert i størrelse. Samlet utgjør disse resultatene viser at
in vivo
behandling med NVP-BEZ235 resulterer i betydelig tilbakegang i
PIK3CA
villtype colonic svulster.
In vivo
NVP-BEZ235 behandling av en GEM modell for sporadisk CRC resulterer i vedvarende mTORC1 og mTORC2 hemming, men forbigående PI3K blokade
for å undersøke effekten av
in vivo
NVP-BEZ235 behandling på PI3K og mTOR signalering, ble utført western blot-analyse i colonic tumorer som ble høstet en time etter endelig medikamentdosering på dag 5 og 28 i behandlingen. Western blot analyse for nivåer av p-AKT
Thr308, p-S6
Ser240 /244, og p-AKT
Ser473 ble utført som surrogater for aktivering av PI3K, mTORC1, og mTORC2 trasé, henholdsvis. En vedvarende reduksjon i nivåene av p-AKT
Ser473 og p-S6
Ser240 /244 ble observert i tumorer i mus behandlet med NVP-BEZ235, sammenlignet med kontroll fortynningsmiddel (figur 4A og 4B). Disse funnene ble bekreftet av tumor immunhistokjemi (Figur 4C). I likhet med de
in vitro studier,
en innledende reduksjon i nivåene av p-AKT
Thr308 ble observert ved fem dager etter behandling, men normalisert etter 28 dager (Figurene 4A og 4B). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at
in vivo
NVP-BEZ235 behandling resulterer i vedvarende hemming mTORC1 og mTORC2, men forbigående PI3K blokade.
Mus med kolon svulster ble randomisert til behandling med kontroll fortynningsmiddel eller 45 mg /kg NVP-BEZ235 ved daglig oral gavage i fem dager. Western blot-analyse av p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, og p-S6
Ser240 /244 ble utført i tumorer behandlet med (-) kontroll fortynningsmiddel eller (+) NVP-BEZ235 for ( A) fem og (B) 28 dager. (C) Immunhistokjemi p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, og p-S6
Ser235 /236 ble utført i tumorer behandlet med kontroll fortynningsmiddel eller NVP-BEZ235 i 28 dager.
In vivo
NVP-BEZ235 behandling av en GEM modell for sporadisk CRC hemmer spredning, har ingen effekt på apoptose, og blokkerer tumor angiogenese
for å undersøke effekten av
in vivo
NVP-BEZ235 behandling på celleproliferasjon, ble colonic svulster undersøkt av immunhistokjemi for markøren spredning KI-67. Denne analysen viste at proliferasjonen ble redusert med 56% etter 28 dager med NVP-BEZ235 behandling (p = 0,003, figur 5A). For å vurdere effekten av NVP-BEZ235 behandling på mobil apoptose, ble colonic svulster undersøkt av TUNEL analysen. Ingen forskjeller ble sett mellom svulster behandlet med kontroll fortynningsmiddel og NVP-BEZ235 (p = 0,9, figur 5B). Som PI3K og mTOR trasé spille en betydelig rolle i tumorangiogenese [54], [55], undersøkte vi effekten av NVP-BEZ235 behandling på microvessel tetthet (MVD) gjennom immunhistokjemi for endotelial markør CD31. Denne analysen viste at MVD ble redusert med 75% etter 28 dager med NVP-BEZ235 behandling (p = 0,013, figur 5C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at
in vivo
behandling med NVP-BEZ235 resulterer i en betydelig reduksjon i tumor spredning, ikke induserer cellulær apoptose, og hemmer tumor angiogenese.
(A) Representant immunhistokjemi for spredning markør KI-67 etter behandling med kontroll fortynningsmiddel eller NVP-BEZ2355 i 28 dager (p = 0,003). KI-67 spredning indeksen ble beregnet som gjennomsnittlig antall positive tumorceller per høy effekt felt. (B) TUNEL immunhistokjemi ble utført i tumorer behandlet med kontroll fortynningsmiddel eller NVP-BEZ235 i 28 dager (p = 0,9). TUNEL farging ble kvantifisert som prosent positive celler per høy drevet feltet. (C) Representative immunhistokjemi for endotelial markør PECAM etter behandling med kontroll fortynningsmiddel eller 45 mg /kg NVP-BEZ2355 (p = 0,013). Microvessel tetthet ble beregnet som gjennomsnittlig antall positive fartøy per høy effekt felt.
Diskusjoner
På grunn av sin sentrale rolle i initiering og progresjon av CRC, blokade av mTOR og PI3K signalveier har dukket opp som en overbevisende mål for utvikling av nye CRC therapeutics [10], [56] – [59]. Vi og andre har vist virkningen av mTORC1 pathway inhibering i prekliniske modeller CRC [11], [12]. Men en tidlig klinisk studie undersøke mTORC1 inhibitorer i humane CRC pasienter viste beskjedne resultater, muligens på grunn av tap av en mTORC1 avhengig tilbakekoblingssløyfe som begrenser PI3K-aktivering og /eller fortsatte mTORC2-mediert aktivering av AKT [3], [60]. Til sammen ser det ut doble PI3K /mTOR-hemmere, som NVP-BEZ235, er nødvendig for maksimal terapeutisk effekt.
Noen studier har antydet at
PIK3CA
mutant kreft er «oncogent avhengige» til PI3K signalering, som fører til økt følsomhet for PI3K-hemmer [7], [61], [62]. Imidlertid har en gruppe rapporterte ingen sammenheng mellom
PIK3CA
mutasjonsstatus og respons på PI3K hemmere [63]. Likevel har en annen gruppe rapporterte utelukkende rettet mot
PIK3CA
mutante pasienter for PI3K /mTOR terapi [64]. Som
PIK3CA
mutasjoner er sett i bare 17% av menneskelig CRC, vil denne tilnærmingen vesentlig begrenser den kliniske effekten av slike midler [53]. Fordi NVP-BEZ235 like hemmer mutant og villtype former for
PIK3CA
, hypotese vi at NVP-BEZ235 ville ha betydelig effekt på human villtype
PIK3CA
CRC [32]. Til støtte for dette, fant vi sammenlign følsomhet for
in vitro
NVP-BEZ235 behandling i
PIK3CA
mutant (HCT116, kinase domene mutasjon, DLD-en, spiralformede domene mutasjon) og
PIK3CA
villtype (SW480) CRC cellelinjer, så vel som i sammenfallende
PIK3CA
mutant og vill-type isogene cellelinjer. Direkte sekvensering av hot spot regionene på eksoner 9 og 20 av
Pik3ca
i kolon svulster validert vår GEM modellen som et surrogat for
PIK3CA
villtype CRC, som vi brukte i vår
in vivo
NVP-BEZ235 behandlingsstudier. Samlet utgjør disse funnene tyder på at NVP-BEZ235 behandling kan ha klinisk nytte i 83% av CRC pasienter med villtype
PIK3CA
. For å vurdere denne funksjonen ytterligere, søkte vi å undersøke om NVP-BEZ235 vil være effektiv i en GEM modell for sporadisk
PIK3CA
villtype CRC.
Tradisjonell
in vivo
target validering tilnærminger stole på xenograft plattformer. Dessverre er disse modellene ikke er helt logisk respons hos mennesker, fordi de kommer fra høy passasje tumorcellelinjer dyrket
in vitro
. Disse cellelinjene ble implantert i ektopiske steder som ikke ligner den colonic mikromiljøet, og derfor unnlater å rekapitulere den heterogene natur av kreft og dens understøttende stroma [65]. Selv om GEM kreft modeller løse disse svakhetene, de fleste GEM Modellene bruker bakterie-linje eller vev-wide modifisering av gener som er kjent for å være mutert i menneskelig CRC. I tillegg har mange CRC GEM modeller hovedsakelig representert med små tarmsvulster [66]. For nøyaktig modellere menneskelige sporadisk CRC, har vi nylig beskrevet en prosedyre der Adeno-Cre gis til floxed mus til somatisk inaktivere
Apc
genet i en stokastisk måte og begrense tumordannelse til den fjerne tykktarmen. Den reproduserbar anatomisk lokalisering av disse svulstene tillater bruk av optisk koloskopi å undersøke enkelte svulster i en langsgående måte [11].
For å undersøke effekten av
in vivo
NVP-BEZ235 behandling, vi brukt vår GEM modell for sporadisk CRC. I våre studier, var det sterk sammenheng mellom de endelige tumor størrelser vurderes av kolonoskopi versus obduksjon (R
2 = 0,89), og dermed validere vår koloskopi baserte svulst dimensjonering protokollen. I samsvar med vår
in vitro
NVP-BEZ235 behandling av humane CRC cellelinjer, colonic svulster fra GEM modellen redusert med 43% i størrelse etter
in vivo
behandling med NVP-BEZ235, mens kontrolltumorer økt i størrelse med 97% (p 0,0001). Lignende funn er rapportert med en annen dual PI3K /mTOR-hemmer, PKI-587, i en xenograft modell av CRC [67].
