Abstract
I tidligere arbeid har vi dokumentert den kjernefysiske translokasjon av endotelceller NOS (eNOS) og sin deltakelse i kombinatoriske komplekser med østrogenreseptor Beta (ERβ) og hypoksi Induserbare Factors (HIFs) som bestemmer lokaliserte kromatin remodellering som respons på østrogen (E2) og hypoksi stimuli, noe som resulterer i transkripsjonsregulering av gener assosiert med uønskede prognose i prostata cancer (PCA). For å undersøke hvilken rolle atom eNOS i oppkjøpet av aggressive fenotype i PCA utførte vi chip Sequencing på kromatin-forbundet eNOS fra celler fra en primær svulst med dårlig utfall og fra metastatiske LNCaP celler. Vi fant ut at: 1. de eNOS-bundet regioner (topper) er utbredt over hele genomet som omfatter flere transkripsjonsfaktorer bindingssteder, inkludert Østrogen Response Elements. 2. E2 økt antall topper, noe som indikerer hormonavhengig eNOS re-lokalisering. 3. Peak fordelingen var lik med /uten E2 med ≈ 55% av dem i extragenic DNA-områder og et spennende engasjement fra 5 «domene av flere Mirs deregulerte ved PCA. Mange potensielt nye eNOS målrettede gener er identifisert som tyder på at eNOS deltar i reguleringen av store gensettene. Den parallelle funn av nedregulering av en klynge av Mirs, inkludert MIR-34a, i PCA celler assosiert med dårlig resultat ledet oss til å avduke en molekylær forbindelse mellom eNOS og SIRT1, en epigenetisk regulator av aldring og tumorgenisiteten, negativt regulert av MIR-34a og i sin tur aktiverer eNOS. E2 forsterker MIR-34a downregulation dermed forsterke SIRT1 uttrykk, viser en ny eNOS /SIRT1 samspill finjustert av E2-aktivert ER signalering, og som tyder på at eNOS kan spille en viktig rolle i aggressive PCa
Citation. Nanni S, Aiello A, Re A, Guffanti A, Benvenuti V, Colussi C, et al. (2013) østrogenavhengige dynamisk profil for Enos DNA foreninger i prostatakreft. PLoS ONE 8 (5): e62522. doi: 10,1371 /journal.pone.0062522
Redaktør: Costanza Emanueli, University of Bristol, Storbritannia
mottatt: 20 desember 2012; Godkjent: 22 mars 2013; Publisert: 03.05.2013
Copyright: © 2013 Nanni et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana Ricerca sul Cancro til AFA; Italian Ministry of Education, University, og Stipend: PRIN 2008NY72SJ og FIRB RBFR087JMZ til AFA og FIRB RBFR10URHP til S.N. V.B. er mottaker av en FIRC (Federazione Italiana Ricerca sul Cancro) Fellowship. A.A. er støttet av midler fra Susan G. Komen for Cure Foundation. C.G. forskning er støttet av LOEWE Senter for Cell og Gene Therapy, Goethe-universitetet, Frankfurt (DE). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: medforfatter AG er en Genomnia srl ansatt og en Fe er en konsulent for Genomnia srl. Medforfattere CG annonse MCC er PLoS ONE redaksjonelle styremedlemmer. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Nitrogenoksid (NO) og dets synthases oppnådd kjendis blant onkologer grunn av bevis for hyppig deregulering av NO-produksjon i flere svulster, inkludert prostatakreft (PCA, [1], [2], [3], og av oppdagelsen av en nøkkelrolle spilt av endothelial NOS (eNOS) i tumor vedlikehold og progresjon [1 ], [3], [4] Våre tidligere eksperimentelle resultater er gitt demonstrasjon av physiopathological rolle av eNOS i tre cellulære sammenhenger:. normale humane endotelceller (HUVEC) før og etter behandling med 17β-østradiol (E2), epitelial cellekulturer . fra PCA eksplantasjoner dyrket i basal tilstand eller med E2, og prøver prostatavev fra PCA-pasienter Konfokalmikroskopi og immunohistokjemi har dokumentert, i særdeleshet, eNOS nukleær translokasjon i alle tre eksperimentelle modeller [1], [5] og ga følgende bevis: (i) eNOS-NO «kjernefysisk» signalisering er en viktig vei i endotelceller respons på angiogene stimuli og i kjøp av en mer aggressiv fenotype ved PCA; og (ii) eksistens og funksjonell rolle avgjørende kombinatoriske komplekser på kromatin Enos /ERα spesielt involvert i vedlikehold av vaskulær homeostase [6], [7] og eNOS /ERβ Enos /HIF-1α eller eNOS /HIF-2α spesifikt knyttet til uønskede kliniske resultatet av PCa [1]. I tumormodell, er disse kompleksene bestemme lokaliserte remodellering av kromatin som respons på østrogen og hypoksi stimuli, noe som resulterer i transkripsjonsregulering av prognostiske målgener [1]. Enten eNOS og dets partnere er til stede som en konstellasjon av koordinat komplekser eller i form av en makro multifaktoriell kompleks gjenstår å bli vurdert.
I de siste årene har en relevant rolle i menneskelig kreft initiering, progresjon og metastase blitt tildelt også til feilregulering av microRNAs (Mirs) [8], [9]. Hvor ekspresjonen av prognostiske målgener reguleres i sammenheng med PCa er for tiden under undersøkelse, selv om flere rapporter [10], [11], [12], [13], [14] har identifisert klynger svært relevant for prostatakreft. Her har vi utvidet på dette aspektet ved å dokumentere en betydelig nedregulering av en klynge av Mirs, utelukkende i PCA celler forbundet med uønskede kliniske utfall (G1-celler). Denne klyngen består av MIR-34a, den første MIR identifisert som en regulator av SIRT1 deacetylase [15] en kritisk epigenetisk kontrollør av aldring og tumorgenisiteten [16].
Av notatet eNOS og NO har også vært involvert i aldringsprosessen, er et relevant observasjon, da aldring ansett som en uavhengig risikofaktor i flere patologiske tilstander. Under aldring, er eNOS ofte deregulert og den vanlige NO biosyntesen forvandlet til produksjon av frie radikaler. Denne effekten bidrar til DNA-skader og genomisk ustabilitet gir en gunstig grunn for kreftutvikling. Faktisk eNOS har nylig blitt knyttet til opprettholdelse av kreft i bukspyttkjertelen [4] og til progresjon av PCa [1], en av de vanligste kreft hos eldre. Interessant, er rollen eNOS under aldringsprosessen strengt knyttet til funksjonen av SIRT1. I fysiologiske forhold, aktiveres SIRT1 eNOS ved deacetylering. Aldring, ved å svekke SIRT1 funksjonen bestemmer en redusert glukose metabolsk effektivitet så vel som en redusert produksjon av passende NO nivåer, således forverret den intracellulære miljøet.
Disse lokalene sammen med vårt opprinnelige oppdagelse at NO bane representerer en «
primum movens
«av en transkripsjons program fremme anskaffelse av en aggressiv fenotype i PCA celler, og at kjernefysisk translokasjon av eNOS påvirker kromatin ombygging av en bestemt undergruppe av PCA prognostiske gener [17] betraktelig, har bedt oss om å undersøke det fulle potensialet i denne nøkkelen signalmolekyl som master genet i utviklingen av prostatakreft. Vårt mål og utfordringen var å avsløre funksjon eNOS på et genom-wide skala av en chip-sekvensering tilnærming, med håp om å avduke en generell mekanisme forbundet med tilstedeværelse av atom eNOS i prostatakreft. Her presenterer vi eksperimentelle bevis som definerer en molekylær kretser som bidrar til aggressiv og metastatisk PCa og kan moduleres av eNOS eller SIRT1 hemmere med potensielle innvirkning på nåværende behandlinger for PCa.
Metoder
Hormoner og hemmere
17β-østradiol (E2 Sigma), NG-nitro-L-arginin metylester (L-NAME, Alexis), TSA (Sigma-Aldrich), MS275, MC1568, sirtinol, resveratrol var en slags gave av Antonello Mai (Roma, Italia)
Antistoffer
anti-ERα (HC-20 [Santa Cruz Biotechnology];. anti-ERβ (L-20 [Santa Cruz Biotechnology], anti- eNOS (eNOS /NOS Type III [BD Biosciences]; Abcam, Cambridge, Storbritannia og Cell Signaling, MA, USA), anti-HDAC1 (Abcam, Cambridge, Storbritannia og Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-HDAC2 (i Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-HDAC3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-HDAC4 (Abcam, Cambridge, Storbritannia og Santa Cruz, CA, USA), anti-HDAC5 (Abcam, Cambridge, UK) anti -SIRT1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-5-metylcytidin (Eurogentec, Seraing, Belgia), anti-α-aktin (Sigma-Aldrich), og anti- HSP70 (StressGen Bioteknologi, San Diego, California).
Cell Kultur
HUVEC og LNCaP celler ble dyrket som beskrevet [1], [5]. Primær prostatakreft kulturer ble hentet fra ferske eksplanterte prostatakreft prøvene etter godkjenning av Institutional Etisk Komité som beskrevet [17]. Udødeliggjorte PCA-celler ble oppnådd ved transduksjon av hTERT og SV40 stort T-antigen som beskrevet [1]. Kliniske data fra pasienter som inngår i den foreliggende undersøkelse har allerede blitt rapportert andre steder [17]. Utfallet av pasientene (overlevelse, metastaser, lokale og /eller biokjemisk tilbakefall) ble fulgt opp til desember 2012 (observasjonsperioden, fra juli 2002 til desember 2012). Dårlig prognose gruppe (G1) fra pasienter med PCa ble definert ved tilstedeværelsen av biokjemiske /lokalt tilbakefall, metastase, eller sykdomsspesifikke dødelighet, og god prognose gruppe (G2) er definert ved en fullstendig remisjon med kirurgi alene. Cellelinjer som stammer fra pasienter har blitt tildelt tilsvarende for G1 (C1IM, C11IM, C13IM, C19IM, C27IM, C43IM, C45IM) eller G2 (C14IM, C24IM, C25IM, C35IM, C38IM, C39IM, C40IM, C41IM) fenotyper.
transfections, Cell ekstrakter og Western blot
Forbigående transfections ble utført av Jet Pei ™ teknikk (Poly Plus Transfeksjon). eNOS vektor koding S1177A var en gave fra C.M. Counter (Duke University Medical Center, Durham, USA) [4]. Totalt ekstrakter for Co-IP immunoprecipitation ble oppnådd med USA Buffer (Tris-HCl 50 mM pH = 7,5; EDTA 5 mM NaCl 250 mM Triton 0,1%, NaF 50 mm), ble kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fremstilt som tidligere beskrevet [18 ].
behandlinger
Celler ble behandlet med 10
-7 M E2, 5 mM L-NAME, 500 nM TSA, 500 nM MS275, 10 mm MC1568, 10 mikrometer sirtinol, 25 uM resveratrol, alene eller i kombinasjon i de tidsrom som er angitt i figur sagn. Minst 72 timer før eksperimentell bruk, ble cellene byttet til medium supplert med hormonmangel serum [19].
chips og Re-chips
chip og re-chip analyser fra dyrket celler ble utført som beskrevet [1] med spesifikke antistoffer for å ERβ, eNOS, SIRT1, HDAC1, HDAC 3, HDAC 4. Negative kontroller var fravær av antistoff (NoAb) eller normal IgG. Analyse av metylering ved bruk av antistoff anti-5-metylcytidin ble utført som beskrevet i [5]. DNA-fragmenter ble gjenvunnet og analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR som beskrevet [1]. Grunning er presentert i supplerende delen.
For ChIP-sekvensering, chips ble utført som beskrevet [1], [6] med modifikasjoner. Kort sagt ble kromatin oppløsninger fremstilt ved sonikering ved hjelp Bioruptor UCD-200 (Diagenode) under dannelse av DNA-fragmenter mellom 150-500 bp i lengde. Pre-tømming av kromatin oppløsning ble utført med protein G-agarose (Pierce) og gjenvinning av immunkomplekser med protein G mettet med BSA ved en sluttkonsentrasjon på 1 pg /pl. Immunopresipitert og innspill DNA-prøver ble oppløst i dobbelt destillert H
2o. Validering av DNA før sekvensering ble utført ved qPCR å bruke primere spesifikke for hTERT og PS2 arrangører (se Supplemental avsnitt).
Bibliotek Forberedelse Chip-sekvensering og bioinformatikk analyse
NGS bibliotek forberedelse og solid sekvensering ble utført ved Genomnia. DNA-prøver i 50 ul Tris-HCl 10 mm, EDTA 1 mM, pH 8 ble skåret med Covaris ™ S2 System, med følgende innstillinger: driftssyklus 10%, intensitet 5%, sykluser /briste 200, syklus tid 60 s , antall sykluser 3. DNA størrelse etter klipping, sjekket på Bioanalyzer, var 25-400 nt med en topp rundt 140 nt. Skåret DNA (50 ng) var slutt reparert og ligert med hurtigligeringssett (New England Biolabs) til 27 pmol multiplex P1 adapter og 27 pmol av en (forskjellig for hver ligering) av strekkoder multiplex P2 dobbel-strandet adaptere (solid ™ Fragment Bibliotek oligonukleotider Kit, Applied Biosystems pN 4401151). Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter, renset ved anvendelse av Agencourt® AMPure® Kit, og nick-translasjon ble utført på ikke-ligert 3′-ender. Endelig bibliotek molekyler ble amplifisert ved PCR for 15-17 sykluser og renset ved anvendelse av Agencourt® AMPure® Kit som beskrevet tidligere. Prøvene ble kvantifisert ved hjelp qubit dsDNA HS eller BR kits og sjekket på Bioanalyzer (Agilent Technology) ved hjelp av en DNA-1000 chip. For å oppnå bindings og klonal amplifikasjon av bibliotek fragmenter på overflaten av sekvenserings-perler, ble de 8 sammenslåtte DNA-biblioteker tilsatt til emulsjonen PCR reaksjonen utført i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems). Etter forsterkning, ble emulsjonen brutt med butanol, ble perler beriket for mal positive perler, 3′-ende utvidet og kovalent festet på en sekvense lysbilde, og sekvensert ved hjelp av standard innstillinger på solid system versjon 3.5 for å produsere 50 nukleotid lang leser.
Kartlegging av sekvense~~POS=TRUNC av data
Kartlegging av Color Space sekvense leser til referanse genomet (UCSC Homo sapiens hg19 fra UCSC) ble utført med Lifetech Lifescope 2.5.1 bioinformatikk programvarepakke, etter «en priori «feilretting med sæt prosedyren. De resulterende justerings filer (parvise Inn- og Experiment) i standard.bam format ble analysert for peak ringer direkte med MACS programvareversjon 1.4.1 [20]. I tillegg ble the.bam linjer konvertert til the.bed format med bamToBed bedtools verktøyet og brukes for topp ringer med SICER analyseprogramvare [21] for å ta hensyn til den heterogene natur av disse DNA – protein interaksjoner som kan omfatte ganske lange områder for samhandling. Alle kryss mellom Mac og SICER seng filer og genom-wide funksjoner ble utført med bedTools v2.17.0 programvarepakke (https://code.google.com/p/bedtools/).
Peak Identifikasjon
Unders data analyse av sekvensering og kartlegging resultater, av MACS topp kvalitet av den relative annotering og videre peak kall ble utført med den kommersielle Integromics SeqSolve bioinformatiske programpakken. Korrelasjon av MACS og SICER topper (Experiment
versus
Input) med kjent NCBI RefSeq genet struktur og merknader ble utført med in-house Genomnia Perl-skript eller med ChIPpeakAnno Bioconductor biblioteket, versjon 2.10 [22]. Differensial peak analyse ble utført med SICER-df.sh rutinen til SICER programvare eller med Bioconductor DiffBind bibliotek [23], supplert med in-house Genomnia Perl-skript. Fjerning av åpen kromatin (falske positiver) regioner ble utført ved hjelp av «En omfattende samling av signal artefakt svarteliste regioner i det menneskelige genom», Anshul Kundaje, ftp://encodeftp.cse.ucsc.edu/users/akundaje/rawdata/blacklists/hg19 /). Statistiske test forbundet med sekvens funksjoner (evaluering av TSS og topp lengde gjennomsnittsdifferanser) ble evaluert med Welch Two Sample t-test i R-versjon 2.15.1 statistisk språk. Sekvensbundet statistiske analyser, inkludert beregninger kernel tag tetthet, ble utført med de riktige statistiske rutiner og biblioteker i R-versjon 2.15.1 statistisk språk (https://www.r-project.org/). Short-les-sekvensering av data og tilhørende eksperimentet informasjon er blitt deponert på EBI ArrayExpress database (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) med tilgangsnummeret E-mtab-1204.
SIRT aktivitet
enzymatisk aktivitet ble evaluert med HDAC analysesett (Upstate) i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp 40micrograms av samlede ekstrakter.
konfokalmikroskopi
Confocal analyse ble utført som tidligere beskrevet [1]. Prøve ble analysert med et Zeiss LSM510 Meta konfokalmikroskop med 63x forstørrelse. For hver prøvene 10 uavhengige felt ble analysert og representative bildene blir vist. Colocalization maske ble oppnådd ved LSM510 programvare for å produsere bilder som inneholder utelukkende colocalized regioner.
Exiqon Mikromatriser og dataanalyse
Total RNA rensing, inkludert mirnas, ble utført ved hjelp av miRNeasy kit (Qiagen) og prøver ble lagret umiddelbart ved -80 ° C. RNA kvantifisering og integritet ble vurdert ved hjelp av Nanodrop og Agilent 2100 Bioanalyzer. Bare prøver med et RNA integritet nummer (RIN) 8,0 ble tatt for analyse. En total på 500 ng RNA fra prøven og referansen ble merket med Hy3 ™ og Hy5 ™ fluorescerende markør, henholdsvis, ved hjelp av miRCURY ™ LNA Array kraft merkingskit (Exiqon, Danmark) ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet av produsenten. Den Hy3 ™ -merket prøver og en Hy5 ™ -merket henvisning RNA prøve ble blandet parvis og hybridisert til miRCURY ™ LNA Array versjon 5
th Generation (Exiqon, Danmark), som inneholder oppfangingsprober rettet mot alle mirnas for mennesker , mus eller rotte registrert i miRBASE versjon 16.0 på Sanger Institute. Den hybridisering ble utført i henhold til miRCURY ™ LNA rekke manuelle bruke en Tecan HS4800 hybridisering stasjon (Tecan, Østerrike). Etter hybridisering microarray Glassene ble skannet og lagret i et ozonfritt miljø (ozon nivå under 2,0 ppb) for å forhindre mulig bleking av de fluorescerende fargestoffer. De miRCURY ™ LNA rekke microarray lysbilder ble skannet med Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) og bildeanalyse ble utført ved hjelp av Imagene 9.0-programvaren (BioDiscovery, Inc., USA). De kvantifiserte signalene ble bakgrunn korrigert (Normexp med offset verdi 10 [24] og normalisert ved hjelp av den globale Lowess (lokalt Vektet scatterplot Smoothing) regresjonsalgoritmen. Differensial uttrykk for miRNAs mellom grupper ble utført ved hjelp av en t-test med én hale etter som en
p
verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant totalt 52 Mirs ble brukt til å generere en heatmap der røde og grønne farger indikerer høy og lav uttrykk henholdsvis en to-veis overvåket clustering analyse ble utført ved hjelp av Pearsons korrelasjoner.. og Ward kriterier som en kobling regel. C27IM cellelinjen ble hybridisert to ganger med korrelasjon = 0,92. Mikromatriser data har blitt deponert i Curie database på https://microarrays.curie.fr/, logg inn brukernavn og passord er tilgjengelig på forespørsel .
Moden miRNA og pri-Mir Detection
Revers transkripsjon ble utført i henhold til produsentens protokollen med TaqMan metode (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Real-time PCR ble utført tre ganger i duplikat på en ABI Prism 7500 eller 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Relativ mengde av hvert modne MIR eller pri-Mir ble målt som foldendring hjelp av to
-ΔΔCt metoden (RNU6B eller RNU19 og β-aktin eller GAPDH fungert som endogen kontroll, henholdsvis).
Statistikk
statistisk analyse ble utført med Prism 2.01 statistisk programvare (GraphPad). Forskjeller mellom faggruppene ble vurdert av to-tailed Mann-Whitney U-test og en-tailed t-test. En 95% konfidensintervall (P 0,05) ble betraktet som signifikant. Data er representert som boksplott diagram (felt viser medianer og øvre og nedre kvartiler av data og værhår indikerer minimale og maksimale verdier), som gjennomsnitt ± SEM eller som fold av induksjons (+/- behandling), som indikert i figur sagn.
Resultater
Genome-wide Profilen til eNOS bindende arrangementer i prostata kreft celler
Vi har tidligere dokumentert at i prostatakreftceller eNOS translocates til kjernen i respons til østrogen, en prosess inhibert av anti-østrogener [5]. Her viser vi ved konfokalmikroskopi at dette østrogenavhengige re-lokalisering er også effektivt forhindret av L-NAME, en hemmer av eNOS (figur S1). Dette funnet støtter sterkt en årsakssammenheng mellom eNOS aktivitet, NO produksjon og østrogen signalering.
Våre åpne spørsmål ble
i.
Hvordan eNOS spille en rolle i prostatakreft i henhold basale forhold eller som svar til østrogener, og i forlengelsen, i østrogenavhengig transkripsjonen program assosiert med prostatakreft aggressiv fenotype ?, og
ii.
Har atom eNOS funksjonen innebære molekylære interaksjoner med proteiner i stand til å endre kromatinstruktur og endre transkriptomet i østrogen-responsive prostatakreftceller? For å løse disse spørsmålene Chromatin immunoutfellinger koblet til massiv parallell sekvensering (Chip-seq) ble utført før og etter behandling med 17β-østradiol (E2, 10
7M) i to cellelinjer:
i
. C27IM celler avledet fra en primær prostatakreft med en aggressiv fenotype og vel karakterisert ved immunfenotypen, cytogenetisk markører, vekst og kolonidannelsen, genamplifikasjon, mRNA-genet og MIR profil [1], [17] og
ii
. i LNCaP-celler, en human prostata cellelinje avledet fra en lymfeknutemetastase [25], og således er representativt for den «metastatisk» fenotype. Den beholdt responsen til disse cellene til kjønnssteroidhormoner, både androgener og østrogener [19], [26], gjør dem en optimal kontroll for et hormon-responsive primærtumor aggressiv, men ennå ikke metastatisk.
Målet vår studie var å identifisere, i prostata mikromiljøet, de primære transkripsjons målene for E2 signale forbundet med eNOS. Fokuserte vi på en kort hormonell behandling (45 min) på grunnlag av tidligere studier av oss og andre som klart indikerte dette tidspunkt som er optimalt for å følge den primære og den umiddelbare effekt av E2-avhengig transkripsjon, forut for aktivering av sekundære mål [1 ], [6], [19], [27], [28].
eNOS ChIP-seq ble gjennomført og eNOS-assosierte DNA-regioner (topper) ble identifisert ved hjelp av to algoritmer, MACS 1.4.1 ( Linux-versjonen eller som inngår i den kommersielle programvaren SeqSolve ™ fra Integromics) og SICER v1.1, for å minimere topp innringer skjevhet og å vurdere den «utvidede» natur av samspillet mellom eNOS /ER komplekser med kromatin [20], [21] . Differensialanalyse av såkalte topper eller utvidede områder (øyer) ble også utført med to fremgangsmåter, som sammenligner og kryssende resultatene, av samme grunner (se Metoder og [22], [23], [29], [30]).
antall sekvense leser og eNOS-bindende aktiviteter for hver cellelinje, ubehandlet eller utsettes for E2
, er vist i tabell S1. Under begge betingelsene ble de eNOS-inneholdende DNA-topper funnet utbredt over hele genomet med konserverte regioner hyperdensity, slik det er vist overlagret på de humane kromosom ideograms for begge cellelinjer (figur S2). Dette mønsteret, som minner om genomisk fordeling av ERE nettsider beskrevet av Carroll
et al.
[31], støtter våre tidligere funn om eksistensen av eNOS /ER komplekser [1], [5], [6] .
Vi identifiseres ved MACS topp samtale analyse i C27IM og LNCaP celler henholdsvis 12,034 og 2,344 eNOS-forbundet topper før E2 behandling, og 57,802 og 34,560 etterpå (tabell S2). Av notatet, fjerning av åpne kromatin regioner som er kjent for å generere falske positiver i Chip-seq eksperimenter (de såkalte «ultra-high signal artefakt regioner») igjen hovedsakelig uforandret resultatene i form av topp nummer: 11,694 og 2333 i ubehandlet C27IM og LNCaP celler og 57616 eller 34451 i C27IM og LNCaP celler ved E2 behandling (Tabell S2 og figur 1A) (se Metoder og [32].
A) Venn-diagram av regionene viser eNOS-rekruttering i fravær ( NT) eller nærvær av østradiol (E2). Antall diskrete genomisk eNOS-rekrutterings topper identifisert av Chip-Seq i C27IM_NT og C27IM_E2 (til venstre), LNCaP_NT og LNCaP_E2 (til høyre) med MACS analyse (FDR 0,1 og P-verdi p 1e-5). Overlapping mellom toppene i NT og E2condition ble bestemt ved bruk av terskelen for en nt. B) Lengde distribusjon Enos topper i C27 IM_NT, C27 IM_ E2 (til venstre) og LNCaP NT, LNCaP E2 (til høyre). Data er presentert som lagret boksplott av peak lengder for E2 behandlet (svart) eller ubehandlet (grå). Svart linje er E2 toppene mener lengde, er grå linje NT topper mener lengde. p 2.2E-16 NT vs E2. C) Sektordiagram av Enos topper distribusjon i intra /extragenic regioner (venstre) eller avstand fra TSS (til høyre). Tall i prosent representere min-max verdier i hver kategori. D) Venn-diagram av MACS-topper i C27IM_E2 og LNCaP_E2. Overlapping mellom eNOS toppene ble bestemt ved bruk av terskelen for en nt. E) Validering av kvantitativ PCR chip-Seq Enos topper. eNOS binding ble overvåket i 9 genomiske regioner, spesifisitet ble vurdert i en «tom» region (region uten eNOS topper) av kromosom 5. Data representerer gjennomsnitt +/- SEM av 3 uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 eNOS_E2 vs eNOS_NT
Tydelig på østrogenbehandling antall topper økt betydelig (4.8- og 14 ganger i C27IM og LNCaP celler, henholdsvis) som indikerer en spesifikk hormonavhengig eNOS re-lokalisering langs genomet. En kvantitativ sekvenssammenligning av eNOS-assosierte topper før og etter E2 behandlingen avslørte eksistensen av overlappende topper mellom de to tilstander, (6805 vanlig topper i C27IM og 1368 i LNCaP-celler (figur 1A). Et tilsvarende overlapping mellom 5,190 og 1,630 gener i C27IM og LNCaP celler henholdsvis ble også funnet for enos topper assosiert med den nærmeste genet som kommenterte i NCBI RefSeq database innlemmet i UCSC Genome Browser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) (data ikke vist). De overlappende topper (og tilknyttede gener) representerer dermed et sub-sett av Enos bundet regioner som ikke responderer på østradiol behandling, noe som tyder eNOS interaksjoner med proteiner andre enn eR.
på den andre enden, de fleste av toppene er følsomme for E2, som resulterer i induksjon av
de-novo
eNOS genomet binding (50,811 toppene i C27IM og 33083 i LNCaP) eller avløsning (4,889 toppene i C27IM og 965 i LNCaP ). av interesse, i begge tilfeller, flere eNOS MACS topper indusert av østradiol eksistere
per
genet. I E2-behandlede celler fleste eNOS målgener ble bundet én eller to ganger, omtrent 5% ble bundet til 3 ganger, og omtrent 9% ble bundet til 4 eller flere ganger (Tabell S3). Videre E2 stimulering endret fordeling av eNOS som indikert av betydelig økt maksimal lengde etter E2 behandling tyder på en DNA-eNOS /ER kompleks stabilisering etter hormonell behandling (tabell S2 og figur 1B).
Distribusjon av Enos topper i forhold til den nærmeste TSS innhentet ved hjelp av Kernel tag tetthet analyse viste at
i.
deres frekvens er sentrert på TSS og reduserer på begge sider med en klar asymmetri mot intragenic områder (Figur S3A) og
ii
. E2 behandling utvidet globale området som dekkes av toppene i C27IM og i noe mindre grad, i LNCaP-celler, som vist ved hjelp av et 10.000 bp vindu, selv om toppene viste en betydelig berikelse rundt TSS følgende E2 stimulus (fig. S3b).
Bemerkelsesverdig, den globale topp distribusjon i kommenterte genomiske regioner var lik i begge forsøksbetingelser (+/- E2), med en liten utbredelse (53-58%) av toppene lokaliserte i extragenic regioner, og resten i intragenic områder, særlig innen introner (figur 1C). Som vist i figur 1D, det var betydelig overlapping mellom toppene indusert av E2 i C27IM og LNCaP celler.
Sammenheng mellom antall nettsteder identifisert ved MACS og SICER i begge C27IM og LNCaP-celler viste en betydelig samstemmighet (se Methods ), videre validert av resultatene av chIP analysen er vist i figur S4. For eksempel hTERT, et østrogen målgen, med flere kjente eres [1], [19], [33], [34], vises MACS topper og E2-økte SICER øyer i korrespondanse til områdene godt karakterisert av Chip-qPCR (figur S4A ); PS2 (TFF1), en klassisk østrogen target genet, viser E2-økt SICER-avledet øyene på steder forsterket av Chip-qPCR (figur S4B); GSTP1, et gen til taushet ved ERβ-eNOS-komplekset i fravær av ligand [5] viser MACS topper i korrespondanse til steder forsterket av chip qPCR, utelukkende i den ikke-stimulert tilstand (figur S4C).
Videre matrisen av parvise korrelasjons viser DNA-belegg på basis av den MACS topp som ringer stillingen og koordinater (fig S5a) samt den hierarkiske klynge analyse av bindingsaffinitet (heatmap) viser affiniteter for differensielt bundne områder beregnet fra lese telledata og MACS topp koordinater (fig S5b) viste at bindingssetene gruppert først i respons til E2, og da i henhold celletype. Totalt 692 E2 vs NT ulikt representert topper (FDR 0,05). Det ble identifisert, hvorav 287 med en positiv ganger endring og resten med en negativ en
Til slutt, vi validert eNOS ChIP-Seq data berikelse observert på østradiol behandling. E2 effekten ble overvåket i C27IM celler, ubehandlet (NT) eller E2-behandlet, ved hjelp av anti-eNOS antistoff og chip-qPCR på åtte genet arrangører tidligere identifiserte eller avledet fra mikroRNA profilanalyse (Figur 1E og figur 2A nedenfor) [1] . Våre resultater viser en signifikant sammenheng mellom tilstedeværelsen av Enos topper, som dukker opp fra chip-Seq datasett på østrogenbehandling (figur S4 og
data ikke vist
), og østrogen-indusert rekruttering av eNOS på samme genomiske regioner som vurderes av tradisjonell chip qPCR. Anrikninger ble normalisert til fravær av antistoff (noAb), eller et ubeslektet antistoff (Ab IgG). Spesifisitet av chip-Seq ble sikret ved hjelp av primere forsterke en genomisk region innenfor kromosom 5 mangler eNOS topper og samtidig viser fraværet av eNOS rekruttering av klassisk chip qPCR.
A) Overvåket cluster analyse av microRNAs profilering (Exiqon Array) for de to gruppene av pasienter som er definert av tilbakefall status (god eller dårlig prognose). B) Validering av kvantitativ sanntid PCR av differensial mirnas nivåer i G1 (dårlig prognose n = 7) og G2 (god prognose n = 8) gruppene, * p 0,05 vs G1 G2. C) Differensial nivå av primære transkripsjoner (pri-MIR) i G1 (n = 7) og G2 (n = 8), * p 0,05 G1 vs G2. Data er representert som boksplott på en logaritme skala.
Cluster analyse av miRNAs mønster i PCA celler.
Med sikte på å differensiere dødelig og ikke-dødelig prostatakreft og ytterligere bedring
