Abstract
Slett celle eggstokkreft er en epitelial eggstokkreft histotype som er mindre mottakelig for kjemoterapi og bærer dårligere prognose enn serøs og endometrioid histotypes. Til tross for dette, er pasienter med disse tumorene behandlet på lignende måte som alle andre eggstokkreft. Forrige genomisk analyse har foreslått at klare celle kreft representerer en unik svulst subtype. Her genereres vi den første hele genomisk uttrykk profilering ved hjelp av epitel komponent av klare celle eggstokkreft og normal eggstokkoverflateprøver isolert med laser capture mikrodisseksjon. Alle matriser ble analysert ved hjelp av BRB ArrayTools og PathwayStudio programvare for å identifisere signalveier. Identifiserte trasé validert ved hjelp av serøs, klare celle kreftcellelinjer og RNAi teknologi.
In vivo
valideringer utført ved hjelp av en orthotopic musemodell og liposomalinnkapslede siRNA. Pasient-avledet klar celle og serøs ovarietumorer ble podet under nyrekapselen på NOD-SCID-mus for å evaluere det terapeutiske potensialet for den identifiserte pathway. Vi identifiserte store aktiverte veier klare celler involverer i hypoksisk cellevekst, angiogenese, og glukosemetabolismen ikke sett i andre histotypes. Knockdown av viktige gener i disse banene er sensibilisert klare celle eggstokkreft cellelinjer til hypoksi /glukose deprivasjon.
In vivo
eksperimenter med pasient avledet svulster viser at klare svulster celle er utsøkt sensitive til antiangiogenesis terapi (dvs. sunitinib) sammenlignet med serøs svulster. Vi ga en histotype bestemt, gen signatur forbundet med klarcellet eggstokkreft som identifiserer viktige aktivert trasé kritisk for deres clinicopathologic egenskaper. Disse resultatene gir et rasjonelt grunnlag for en radikalt annerledes behandling for eggstokkreft klare celle pasienter
Citation. Stany MP, Vathipadiekal V, Ozbun L, Stone RL, Mok SC, Xue H, et al. (2011) identifisering av nye terapeutiske mål i microdissected klarcellet eggstokkreft. PLoS ONE 6 (7): e21121. doi: 10,1371 /journal.pone.0021121
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 02.02.2011; Godkjent: 19 mai 2011; Publisert: 06.07.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av egenutført Research Program av National Cancer Institute ved National Institutes of Health (MJB) og OvCaRe (et initiativ fra Vancouver General Hospital og University of BC Hospital Foundation og BC Cancer Foundation) (YZW), BC Cancer Foundation og Pfizer Canada (Investigator initiert prosjekt, SLE og YZW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser. Pfizer Canada er et helseteam selskap. SLE og YZW mottatt etterforsker initiert prosjektmidler fra Pfizer Canada. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Slett celle kreft i eggstokkene (CCOC) ble opprinnelig beskrevet som en mesonephroma ovarii i 1939 av Schiller på grunn av sin tilsvarende utseende for å nyrecellekarsinom [1]. Videre studier siden den gang, har gitt bevis for at disse svulstene er for eggstokkreft opprinnelse [2], [3], [4], [5], [6] CCOC representerer 4-14% av alle epitelial eggstokkreft og sin kliniske atferd skiller seg fra de andre epiteliale histotypes [4], [6], [7]. Pasienter med stadium I CCOC har en 27% risiko for tilbakefall [8] med en fem års overlevelse for over 60% sammenlignet med 80%, for serøs svulster [8]. Pasienter med sent stadium sykdom har også en dårligere prognose når sammenlignet med pasienter med fremskredet stadium serøs eggstokkreft [8]. Dette gjenspeiler trolig CCOC er lavere respons til den tradisjonelle platina /taxan-basert kjemoterapi, rapporteres å være mellom 11-45% i løpet av førstelinjebehandling [8], [9]. CCOC pasienter har også høyere forekomst av tromboemboliske hendelser sammenlignet med pasienter med andre ovarialcancer histotypes [10].
Histologisk CCOC cellene er «klar» på grunn av den høye cytoplasmatiske glykogeninnhold som er et produkt av H E farging [11], [12]. CCOC har blitt funnet å ha ultrastructural likheten for å fjerne cellekreft i skjeden og livmorslimhinnen. Denne ultra likheten bærer over til genetiske likheten også. Zorn et al. funnet liknende genekspresjonsprofiler av klare celletumorer ovarier, endometrium, og nyre med bruk av en 11 000 probeset matrise [13]. Denne genetisk overlapping, men ikke strekker til sammenligning av serøse og endometrioid histotypes av eggstokkreft og livmor opprinnelse. En annen genuttrykk profil CCOC bruke en 7129 probe sett rekke demonstrerte det å være svært forskjellig fra de andre histotypes [14]. Disse studiene tyder på at det finnes lignende veier som fører til klarcellet histotype uansett utgangspunkt.
I denne studien presenterer vi resultatene av den første hele genomet uttrykk profilering av microdissected CCOC prøver. Gene ontologi og sti analyse identifisert store aktiverte veier involvert i hypoksisk cellevekst, angiogenese, og glukosemetabolismen. Vi antok at disse banene kan gi en mekanisme for den aggressive klinisk natur CCOC. Vi viser at klare celle kreft cellelinjer overlever bedre enn serøs cellelinjer under hypoxi og glukose fratatt forhold, og dette er delvis på grunn av disse aktiverte baner som involverer HIF1 α og enolase.
In vivo
eksperimenter med pasient avledet vev viser at klare celle tumorxenotransplantater er utsøkt sensitive til antiangiogenesis (sunitinib) sammenlignet med serøs svulster. Kombinasjonsbehandling av sunitinib og RNAi til HIF1α og enolase demonstrerer synergistisk antitumoraktivitet. Disse resultatene gir et rasjonelt grunnlag for spesifikk behandling for disse pasientene.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
eggstokkreft vevsprøver ble oppnådd med informert skriftlig samtykke fra pasienter som gjennomgår bilateral salpingoophorectomy på Vancouver General Hospital etter en protokoll godkjent av University of British Columbia klinisk forskningsetiske Board, Canada. Prøver som brukes til profilering ble samlet under protokoller godkjent av Institutional Review styrene i Brigham and Women Hospital (Boston, MA, USA) og ble oppnådd med informert skriftlig samtykke fra pasientene. Dyr omsorg og eksperimenter ble utført i samsvar med de retningslinjer og godkjenning ved University of British Columbia – British Columbia Cancer Agency forskningsetikk Board (UBC BCCA REB) (Nummer: H04-60131) og MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care og bruk komiteen, USA (IACUC nummer: 12-02-18233).
Vevsprøver, mikrodisseksjon, RNA isolering og forsterkning
ti klare celle eggstokkreft prøver ble innhentet fra de primære svulster tidligere ubehandlet eggstokkreft pasienter ved Brigham and Women Hospital (Boston, MA). Et sett med 10 normale eggstokk-flate epitel (OSE) cytobrushing prøver ble også oppnådd fra de normale eggstokker hos pasienter ved tidspunktet for kirurgi for godartede indikasjoner. Frysesnitt (7 mikrometer) ble festet på rammen lysbilder (Leica, Wetzlar, Tyskland), faste i 70% alkohol i 30 sekunder, farget med 1% metyl grønn, skyllet i avionisert vann og lufttørkes. Mikrodisseksjon ble utført ved hjelp av en MD LMD laser microdissecting mikroskop (Leica). Tumorceller (~5,000) ble dissekert for hvert enkelt tilfelle. RNA ble isolert, ekstrahert og renset som tidligere beskrevet [15]. For å generere tilstrekkelig cRNA for microarray analyse, ble en to-syklus amplifikasjonsprotokoll (Affymetrix) benyttes som tidligere har vært beskrevet [16].
Microarray analyse
Alt rekke data er Minimum Informasjon om en Microarray Experiment (MIAME) kompatibel og rådata har blitt deponert i en MIAME kompatibel database (GEO, deponeringsnummer: GSE29450)
data~~POS=TRUNC normalisering
Globalt normalisering mot et mål verdi. 500 ble brukt på alle 20 av arrays under vurdering ved hjelp av Gene Chip kjøreprogramvare (Affymetrix). Normaliserte data ble lastet inn i National Cancer Institute microarray analyse Database (mAdb) for kvalitetskontroll screening og sortering før nedstrøms analyser (https://nciarray.nci.nih.gov/index.shtml). Biometrisk Forskning Branch (BRB) ArrayTools versjon 3.2.2 programvare utviklet av legene. Richard Simon og Amy Peng Lam av Biometrics Forskning grenen av National Cancer Institute ble brukt til å filtrere og fullføre den statistiske analysen av tabellen data. BRB-ArrayTools er en multifunksjonell Excel-tillegg som inneholder verktøy for bearbeiding og analyse av microarray data ved hjelp av R-versjon 2.0.1 miljø (R Development Core-Team, 2004). Hybridisering kontroll probe sett og probe sett scoret som fraværende på α1 = 0,05 eller marginal (M) på α2 = 0,065 ble ekskludert. I tillegg ble det bare de karakterutskrifter til stede i mer enn 50% av arrays og viser en variasjon i topp 50-persentilen evaluert.
Klasse sammenligning genet ontologi, og sti analyse.
En multivariabel permutasjon test i BRB ArrayTools ble anvendt for å identifisere differensielt uttrykte gener. En liste over probesets inneholder 10% falske positiver på en tillit på 95% ble oppnådd etter en total på 2000 permutasjoner. Differensial uttrykket ble betraktet som signifikant ved en p-verdi på 0,001. En tilfeldig variasjon
t
test og totalvurdering ble utført som tidligere beskrevet [16].
For å identifisere spesielle funksjonelle kategorier av gener som ble høyanriket i CCOC, vi identifisert genet ontologi ( GO) kategorier som var statistisk signifikant blant listen over forskjellig regulerte gener. En Ling T-kvadrat test ble utført for å identifisere viktige GO kategorier. For å identifisere signalveier involvert i CCOC ble genet liste som ble generert fra microarray analyse importert til PathwayStudio programvare (Ariadne Inc, Rockville, MD).
Kvantitativ RT-PCR
kvantitativ real-time PCR ble utført i 10 klare celle eggstokkreft prøver og de 10 OSE prøvene. 50 ng av dobbel-forsterket produktet ble brukt fra alle 20 prøver ved hjelp av primer setter spesifikke for 12 utvalgte gener og housekeeping gener GAPDH, GUSB, og cyclophillin. En iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) ble anvendt i forbindelse med ett-trinns QRT-PCR med SYBR grønn sett (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA) i henhold til tidligere beskrevne sykkelforhold [17]. For å beregne den relative uttrykk for hvert gen, ble to
-ΔΔCT metode som brukes i snitt C
T-verdier for de tre housekeeping gener.
Cellelinjer og kulturforhold
de menneskelige klarcellet eggstokkreft cellelinjer ES-2, ble TOV21G, og RMG1, og serøs cellelinjer OVCA 420 og OVCA 432 opprettholdes i en 01:01 blanding av medium 199 (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, California) og medium 105 (Sigma, St. Louis, MO) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% L-glutamin. De humane serøse eggstokk-kreft-cellelinjer SK-OV-3 og OVCAR-3 ble opprettholdt i RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies) supplementert med 10% FBS og 1% L-glutamin. CAOV3 og OVCA 429-celler ble holdt i DMEM (Invitrogen Life Technologies) supplementert med 10% FBS og 1% L-glutamin. ES-2, ble TOV21G, SKOV3, OVCAR3 CAOV3 og RMG1 cellelinjer kjøpt fra American Type Culture Collection og japansk Innsamling av forsknings Bioressurser. OVCAR 420, ble OVCAR 432 og OVCA 429 hentet fra Laboratorium for gynekologisk onkologi ved Brigham and Women Hospital [18].
Hypoksi /Glukose deprivasjon vilkår
celler fra klarcellet og serøs eggstokkene opprinnelse ble belagt og plassert i bestemmelsene for normoxia med DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamin eller hypoksi med glukose-fri DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamin (Invitrogen Life Technologies). Hypoksi ble fremstilt ved å spyle en inkubator (Forma Thermo Series II, Thermo Fischer Scientific, Inc., Waltham, MA) med nitrogen for å oppnå en blanding av 1% O
2, 5% CO
2 og 94% nitrogen. Inkubatoren ble opprettholdt ved 37 ° C.
analyser celleproliferasjon
kreft cellelinjer ble sådd i 96-brønners plater i 8 replikater (ES-2, TOV21G, OVCA 420, SK- OV-3, OVCAR-3, OVCA-420, OVCA-429: 5 × 10
2 celler per brønn, CAOV3, OVCA-432, RMG1: 1 × 10
3 celler /brønn) og plasseres i enten betingelser normoxia med medier som inneholder normal glukose (NN) eller hypoksi /glukosemangel (HG) i 24, 48 og 72 timer. Etter disse periodene ble det relative antallet av levende celler målt ved hjelp av fluorometrisk, resazurin-baserte Cell Titer blå assay (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner ved 560
Ex /590
Em nm i et Victor3 multi-label teller (PerkinElmer, Tyskland). Dobling ganger for hver cellelinje under hver tilstand ble beregnet ved hjelp av Prism 4,02 programvare (Graph Pad, San Diego, USA). Fold endring i fordoblingstid av hypoksi /glukosemangel sammenlignet med normale forhold ble beregnet og i gjennomsnitt for hver cellelinje over to eksperimenter. Gjennomsnittlig ganger endring ble beregnet for de serøs cellelinjer og tydelige cellelinjer og sammenlignet.
Cell syklustesten
cellesyklus status ES-2 og OVCA 420 celler ble sammenlignet i forhold av normoxia og hypoksi /glukosemangel ved strømningscytometri. I korthet, 7,5 x 10
4 ES2 celler og 2,0 x 10
5 OVCA420 celler ble sådd i 60 mm
2 plater i triplikat og inkubert over natten. Mediet ble endret på den neste dag, og cellene ble plassert under de ovenfor angitte betingelser. Etter 48 timers inkubering (normoxia ved 37 ° C eller hypoksi /glukosemangel ved 37 ° C), ble media og adherente celler samlet opp og sentrifugert ved 1500 χg i 5 minutter. Pelleten ble vasket i 2 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) og sentrifugert ved 1500 χg i 5 minutter. Cellene ble resuspendert i 200 ul kald PBS. 2 ml iskald 70% etanol ble tilsatt, og cellene ble inkubert på is i 30 minutter for å permeabilisere. Cellene ble deretter sentrifugert ved 1500 χg i 10 minutter. Supernatanten ble dekantert, og 900 ul av romtemperatur PBS ble brukt til å resuspendere cellene. 100 ul RNase A (10 mg /ml, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, New Jersey) og 10 ul av propidiumjodid (1 mg /ml, Sigma) ble tilsatt, og rørene ble deretter inkubert ved 37 ° C i 30 minutter , unngå lys. DNA-innholdet ble bestemt ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton, Dickinson og Company, Franklin Lakes, NJ) og histogrammer av DNA-innholdet ble analysert ved hjelp FlowJo 7,2 (Tre Star, Inc., Ashland, OR) for å karakterisere befolkningsfraksjonene i hver fase av cellesyklusen.
caspase-3-assay
de direkte målinger av kaspase 3 aktivitet ble foretatt ved hjelp av et caspase-3-fluoro-sett (Invitrogen Life Technologies). Kort, 2,0 × 10
5 OVCA420 celler ble sådd i 60 mm
2 plater og inkuberes over natten. På dag 0 ble mediet skiftet, og platene ble deretter anbragt i betingelsene for normoxia /normal glukose eller hypoksi /glukosemangel. Celler ble samlet opp ved 24, 48 og 72 timer. Cellene ble oppsamlet, pelletert, resuspendert i 50 pl avkjølt Cell Lysis Buffer, og inkubert på is i 10 minutter. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). 50 ul av 2 x reaksjonsbuffer og 10 mM DTT ble tilsatt til hver 50 pl alikvot av cellelysat. 5 pl 1 mM DEVD-AFC-substrat ble deretter tilsatt til hver prøve og unngå lys. Prøvene ble deretter inkubert ved 37 ° C i 1 time i mørke. MEF-celler (60 mm plate, 80% sammenflytende) behandlet med 10 pl cykloheksimid og 30 ng TNFa ble anvendt som en positiv kontroll. Fluorescens ble deretter vurdert i en Victor3 multi-label teller (PerkinElmer, Tyskland) med 405
Ex /535
Em nm filtre. Økning av Casase-3 aktivitet ble bestemt av relativ fluorescens per mikrogram protein.
nekrose analysen
For å analysen for tilstedeværelse av nekrose, den CytoTox-ONE ™ homogen membran integritet analyse ble anvendt som anbefalt av fabrikanten (Promega). Denne analysen måler frigjøring av LDH fra celler med skadet membraner. I korthet, 5 x 10
3 OVCA-420 celler ble utplatet i en 96-brønners plate i tre eksemplarer. Mediene ble endret neste dag, og cellene ble plassert i bestemmelsene for enten normal oksygen /normal glukose eller hypoksi /glukose deprivasjon. 48 timer senere ble platene fjernet fra inkubatoren og ekvilibrert til 22 ° C. For å generere en maksimal LDH Slipp-kontroll, ble 2 ul lyseringsløsning tilsatt til kontrollbrønnene som er plassert i normal oksygen /normal glukose. 100 ul CytoTox-ONE ™ reagens ble tilsatt til hver brønn. Etter 10 minutters inkubering ved 22 ° C, ble 50 ul stoppløsning til hver brønn. Platene ble rystet i 10 sekunder. Fra hver brønn ble 100 ul overført til en ugjennomsiktig plate og fluorescens ble registrert ved 560
Ex /590
Em nm i et Victor3 multi-label teller (PerkinElmer, Tyskland). Etter subtrahering av bakgrunnen kulturmediet, ble den prosentvise cytotoksisitet beregnet ved å dividere den eksperimentelle fluorescensen av den maksimale LDH utløsning fluorescens.
Behandling av cellelinjer med siRNA oligonukleotider
knockdown av HIF1 α og enolase 1 ble utført ved anvendelse av siRNA oligonukleotider (Qiagen, Inc.). En omvendt transfeksjon protokollen ble utført ved hjelp Oligofectamine (Invitrogen Life Technologies, Inc) som anbefalt av produsenten i en 96-brønns plate format. For hver brønn, 50 nM av siRNA og 0,5 pl Oligofectamine transfeksjon reagens ble fortynnet i 50 ul serumfritt DMEM og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. ES-2 celler, TOV-21g celler, og RMG-1-celler ble sådd i en 96-brønns plate ved 1,0 x 10
4 celler, 2,0 x 10
4 celler, og 5,0 x 10
4 celler per brønn, respektivt. Egge siRNA ble brukt som en negativ kontroll. 48 timer etter transfeksjon, ble mediet erstattet med glukose-fri DMEM, og cellene ble plassert under betingelsene for hypoksi. Veksten ble vurdert til 0 og 24 timer med Cell Titer Blå analyse (Promega). De proliferasjonsanalyser for ES2 og TOV21G cellelinjer ble utført ved anvendelse av 75 nM siRNA for 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon.
In vivo
reduksjon ved ENO1 eller HIF1 α ved hjelp av siRNA-DOPC med eller uten sunitinib hemmer CCOC tumorprogresjon hos atymiske nakne mus
Kvinnelige atymiske nakne mus ble kjøpt fra National Cancer Institute, Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). ES2 celler ble trypsinert, vasket og resuspendert i Hanks balanserte saltoppløsning (Gibco, Carlsbad, CA) og injisert intraperitonealt i mus (1 x 10
6 celler /mus). For å ned-regulere enolase og HIF1 α in vivo, ble den respektive siRNA som anvendes. Non-targeting, uspesifikke sekvensen 5′-ATT TCT CCG AAC GTG TCA CGT-3 «ble brukt som kontroll, mens de menneskelige spesifikke sekvenser ble brukt for enolase (5′-GCG CAT TGG AGC AGC AGA GGT TTA3») og HIF -1 α (5 «CAG TTG TCA CCA TTA GAA A-3). Disse mål spesifikke sirnas ble kjøpt fra Sigma-Aldrich og fremstilt som tidligere beskrevet [19], [20]. Den frysetørkede DOPC innlemmet siRNA ble hydrert med PBS og injisert intraperitonealt to ganger ukentlig etter våre tidligere publiserte protokoller [21] på 5,0 mg siRNA /200 ml suspensjon. Det samme volum av PBS injisert intraperitoneal ble anvendt som en kontroll.
SU11248 /sunitinibmaleat (Sutent, Pfizer) ble suspendert i karboksymetylcellulose kjøretøy formulering, inneholdende karboksymetylcellulose natrium (0,5% vekt /volum), NaCl (1,8% vekt /volum), Tween 80 (0,4% vekt /volum), benzylalkohol (0,9% vekt /volum), og omvendt osmose avionisert vann (tilsettes til sluttvolum) og justert til pH 6,0 som tidligere beskrevet [22]. Sunitinib struktur og aktivitet, er blitt rapportert [23]. Narkotika prøver ble utarbeidet en gang ukentlig og holdt i mørke ved 4 ° C. Mus ble behandlet med 40 mg /kg i 200 ul kjøretøy ved gavage en gang daglig. Daglig gavage med vehikkel alene ble anvendt som en kontroll. Syv dager etter ES2 celle injeksjon, ble musene tilfeldig delt og behandlet med kontroll, enolase eller HIF1 α siRNA-DOPC ± sunitinib (n = 10 /gruppe). Behandlingen ble fortsatt i 3 uker, ved hvilket tidspunkt alle mus i forsøket ble avlivet og obdusert, og tumorene ble høstet. Tumorvekt og nodul verdi ble registrert. Svulstvev ble frosset i optimal skjæring temperatur (OCT) media for å forberede frosne lysbilder for etterfølgende CD31 farging.
Immunhistokjemisk farging for CD31
Immunhistokjemisk farging for CD31 antigenet ble utført på frosne lysbilder å evaluere svulst microvessel tetthet (MVD). Objektglass ble fiksert i kald aceton i 10 minutter. Endogen peroksidase ble blokkert med 3% H
2o
2 i metanol og ikke-spesifikke epitoper ble blokkert ved anvendelse av 5% normalt hesteserum og 1% normalt geiteserum. Platene ble deretter inkubert med anti-mus CD31 (1:800 fortynning, PharMingen San Diego, CA) ved 4 ° over natten. Etter vasking med PBS, ble det passende HRP-konjugert sekundært antistoff i blokkeringsløsning tilsatt i 1 time ved romtemperatur. Lysbilder ble utviklet med 3, 3 «-diaminobenzidine (DAB) kromogen (Invitrogen, Carlsbad, California) og kontra med Gil No. 3 hematoxylin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). MVD ble beregnet ved å vise 10 representative 200 × felt per lysbilde i hver behandlingsgruppe og telle antall microvessels per felt. En microvessel ble definert som en åpen lumen med minst en CD31-positiv celle i umiddelbar nærhet av den.
Differensial virkning av sunitinib på transplanterpasientavledet eggstokkreft tumorer
seks til åtte ukers gamle kvinnelige NOD-SCID mus ble avlet av BC Cancer Research Centre Animal Resource Centre, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada. Musene ble holdt under spesifikke, patogenfrie forhold i sterile filter-topp bur i høy effektivitet partikkelfilter luft-filtrert ventilerte stativer, og fikk sterile gnager chow og vann. Eggstokkreft vevsprøver ble oppnådd med informert samtykke fra pasienter som gjennomgår bilateral salpingoophorectomy på Vancouver General Hospital. I korthet, for å utvikle transplanter kreftvev linjer, ble frisk tumorvev skåret i små biter og podet inn i subrenal kapsel området av hunn-NOD-SCID-mus for etterfølgende serietransplantasjon og karakterisering som tidligere beskrevet [24], [25]. Et panel av eggstokkreft vev xenograft modeller, dvs. tre serøs carcinoma vev linjer (LTL237, 247 og 259) og en cellekreft vev linje (LTL175) klart (https://livingtumorlab.com/PDC_Ovarian.html), ble brukt.
for sunitinib effektstudier, 96 biter av vev (4 × 2 × 1 mm
3) fra xenografter av hvert etablert svulstvev linjen ble podet i henhold til nyre kapsler med 24 kvinnelige NOD-SCID-mus, som tidligere beskrevet [25]. Når implantatene var godt etablert, og nådde et gjennomsnittlig volum på fra 20 til 50 mm
3 [24], [25], ble dyrene sorteres i fire grupper (6 mus /gruppe, 2 grafts pr nyre). Behandling oppdrag var å sunitinib eller inaktive kjøretøy (negativ kontroll). Sunitinib ble administrert som en 0,5% karboksymetylcellulose suspensjonen med en dose på 40 mg /kg kroppsvekt (oralt, en gang daglig i to uker) funnet effektive for en rekke mus xenograft-modeller, som beskrevet andre steder [26]. Musene ble gitt sammen med mat og vann
ad libitum
og overvåket daglig for endringer i generell helse og tegn til stress, inkludert kroppsvekt tap, diaré, endringer i mat /vanninntak, utseende (sammenkrøket stilling, nedsenket øye , anstrengt pust) og atferd (apati). Virkninger på tumorvekst ble bestemt ved måling av tumorvolumet ved obduksjon ved hjelp calipers, og formelen: volum (mm
3) = 0,52 x lengde x bredde x høyde (mm), som tidligere beskrevet [25] og ved histokjemisk analyse av tumor vevssnitt (se nedenfor).
Måling av tyrosin-fosforylering av VEGFR2 og PDGFRp i xenotransplantater via Western blotting
i løpet av 2 timer fra den siste administrasjonen av sunitinib i de ovennevnte effektstudier, xenoimplantater fra behandlede og kontrollmus ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 C for senere bruk. Lysater ble fremstilt ved homogenisering av vevene med kald lyseringsbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 nM MgCl
2, 10% volum /volum glycerol, 1% Triton X-100, 1% natrium-ortovanadat, 2 mM NaF, 2 pg /ml aprotinin, 2 ug /ml leupeptin, og 2 mikrogram /ml pepstatin-A) som beskrevet andre steder [26]. For immunoprecipitation, ble protein beløp justert til 500 mikrogram. Proteiner ble precleaned med protein A-Sepharose (katalog nr. 16-125, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanter (1 ml) ble inkubert med 4 pg kanin anti-VEGFR2 (katalog nr. 07-716) eller anti-PDGFRp (Cat. No. 05-825) antistoff (Upstate Biotechnology Inc.) i 90 minutter ved 4 ° C og, etter tilsetning av 25 ul 50% (v /v) Protein A-Sepharose, videre inkubert i 60 min ved 4 ° C. Antigen-antistoff-kulekomplekser ble vasket minst tre ganger med lyseringsbuffer, fulgt av tilsetning av 25 ul ladningsbuffer og koking i 1 min for protein eluering. Proteiner ble separert ved 5% SDS-PAGE-gel og deretter overført til PVDF-membran for påvisning av fosforylert tyrosin ved bruk av et muse-monoklonalt antistoff mot fosfotyrosin (Cat. No. sc-7020, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Membraner ble deretter strippet og reprobed for deteksjon av total VEGFR2 og PDGFRp anvendelse av de samme antistoffpreparater anvendt for immunopresipitering.
Apoptose deteksjon
parafininnstøpte vevssnitt (5 um tykke) ble undersøkt ved TUNEL analyse (ApopTag® Apoptose Detection Kit, Chemicon, Temecula, California) som tidligere beskrevet (26). I korthet Snitt ble inkubert i 15 minutter med 20 mikrogram /ml proteinase K ved romtemperatur, og deretter grundig vasket i destillert vann. DNA-fragmenter fremstilt ved den apoptotiske prosess ble merket med digoksygenin nukleotider via en 60 minutters inkubasjon ved 37 ° C med terminal deoksynukleotidyl transferase (TdT) i et fuktighetskammer. Seksjonene ble deretter skylt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med anti-digoksygenin konjugert med fluorescein. Etter at kontra med 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), ble platene undersøkt med hensyn til prosentandelen av fluorescein-merkede celler ved anvendelse av et Zeiss Axioplan-2 fluorescens mikroskop.
Histologi, immunhistokjemi, og microvessel tetthet estimering
Fremstilling av parafininnstøpte vevssnitt, deres farging og immunohistokjemiske analyser ble utført som tidligere beskrevet (23, 24). Anti-von Willebrand faktor VIII antistoffer (Cat. No. A0082, DAKO Diagnostics Canada Inc .; 1:200) ble brukt til identifisering av mikrokar. Alle vevssnitt ble lett motfarget med 5% (vekt /volum) Harris hematoxylin (H E). Kontrollsnitt ble behandlet parallelt med kanin ikke-immun IgG (Dako, Carpinteria, CA) som ble brukt ved de samme konsentrasjoner som de primære antistoffer. Microvessel tetthet, dvs. antallet blodkar per x 400 mikroskopisk felt, ble bestemt ved mikroskopisk analyse av von Willebrand faktor VIII-fargede vevssnitt.
Statistisk analyse
Data er uttrykt som middel ± SEM ANOVA ble brukt til å sammenligne flere gruppemiddelverdier. Shaffer statistikk og t-test ble anvendt for å analysere noen forskjell mellom to grupper. Sammenligning av andelen av celler i ulike cellesyklusfaser ble utført med to-veis ANOVA med bruk av Prism 4,02 programvare (Graph Pad). Verdier ble ansett som statistisk signifikant ved P 0,05, med unntak av microarray analyse, hvor signifikans ble satt til p 0,001
Resultater
Hele genomet uttrykk profiler av microdissected CCOC identifiserer differensielt uttrykte gener
de genuttrykksmønster av RNA isolert fra epiteliale komponenten av 10 Tøm celle ovarialcancer prøver isolert med laser capture mikrodisseksjon ble sammenlignet med tilsvarende isolert RNA fra 10 normale eggstokkene overflaten epitel prøver ved hjelp av Affymetrix U133 pluss 2 arrays. Etter normalisering og innledende analyse, 16,013 informative probesets gått filtrering kriterier. Ved hjelp av en multivariat permutasjon test som gir 95% sikkerhet at antall falske funn fikk ikke overstige 10%, 3,288 probesets til 2,559 gener ble funnet å være differensielt regulert, definert av en 1,5-ganger eller større forskjell i uttrykk med en statistisk signifikans på p & lt 0,001. Grafisk representasjon av denne differensial genekspresjon kan sees i figur 1a. For å validere microarray data, ble 12 gener som var forskjellig uttrykt tilfeldig valgt for QRT-PCR-analyse. Ti av de 12 genene ble uttrykt forskjellig på QRT-PCR, noe som gir en samlet microarray validering sats på 83% (Figur 1b, c og tabell S1).
(a) Grafisk representasjon av hele genomet uttrykk profilering av Clear Cell Eggstokkreft Specimen (CCOC) og Ovarian Surface Epitel (OSE). (B) og (c) Sammenligning av QRT-PCR-data og mikroarray data for de seks uttrykt og fire underexpressed gener som benyttes for validering (d) Pathway analyse av differensielt regulert gener som er identifisert i den klare celle eggstokkreft microarray. Gener som inngår i analysen ble pålagt å ha en fold endring ≥1.5. Flere probe sett ble i gjennomsnitt for hvert gen.
Red
, genet er oppregulert.
Blå
, genet er nedregulert.
Identifikasjon av aktiverte trasé i CCOC
For å identifisere aktiverte trasé stede i CCOC, funksjonelle kategorier av forskjellig uttrykt gener ble identifisert ved hjelp av genet ontologi (GO) analyse. Statistisk signifikante kategorier demonstrere et stort antall gener involvert i karbohydratmetabolismen, glukosemetabolisme, glykolyse, og blodkarutvikling (tabell 1). De 3,288 probesets og deres tilhørende relative uttrykk data når sammenlignet med OSE ble importert til PathwayStudio 6.0-programvare. Trasé som er involvert i angiogenese, koagulering, glukosemetabolisme, celleproliferasjon og celle-motilitet var tydelig (figur 1d). For eksempel, HSPCA, som har vist seg å stabilisere HIF1α (27), ble funnet å være over-uttrykt.
