Abstract
Nylig viste vi at onkolytiske vacciniavirus GLV-1h68 har en betydelig terapeutisk potensial i behandling av lymfeknutemetastaser av menneskelig PC-tre prostata carcinoma in tumorxenotransplantater. I denne studien ble underliggende mekanismer for virus-mediert metastaser reduksjon analysert. Immunhistokjemi vist at virus-behandling resulterte i en drastisk reduksjon av blod og lymfekar, som representerer vesentlige ruter for PC-3-celle migrasjon, i både tumorer og metastaser. Dermed GLV-1h68 drastisk redusert viktige ruter for metastatisk spredning av PC-3 celler. Videre analyse av viral fordeling i GLV-1h68-injiserte tumorbærende mus ved plakk-analyser avslørte betydelig høyere virus titer i metastaser i forhold til faste tumorer. For å belyse forholdene potensielt medier fortrinnsrett viral kolonisering og utrydding av metastaser, ble microenvironmental komponenter av uinfiserte svulster og metastaser sammenlignet med mikroskopiske undersøkelser. Disse analysene viste at PC-tre lymfeknutemetastaser viste økt vaskulær permeabilitet, høyere status av tumorceller spredning som bestemmes av BrdU- og Ki-67 analyser og mindre nekrose av PC-3 celler enn solide tumorer. Videre et økt antall immunceller (MHCII
+ /CD68
+ makrofager, MHCII
+ /CD19
+ B-lymfocytter) kombinert med en oppregulert uttrykk av proinflammatoriske cytokiner ble observert i metastaser i forhold til primære PC-3 svulster. Vi foreslår at disse microenvironmental komponentene mediert metastatisk tropisme av GLV-1h68. Derfor kan vacciniavirus-basert onkolytiske virotherapy tilby en ny behandling av metastatisk prostata karsinom hos mennesker
Citation. Donat U, Weibel S, Hess M, Stritzker J, Hartl B, Sturm JB, et al. (2012) Fortrinnsrett Kolonisering av metastaser av Onkolytiske vacciniaviruskonstruksjoner Strain GLV-1h68 i et menneske PC-tre prostatakreft Modell i nakne mus. PLoS ONE 7 (9): e45942. doi: 10,1371 /journal.pone.0045942
Redaktør: Maciej S. Lesniak, The University of Chicago, USA
mottatt: 25 juni 2012; Godkjent: 23 august 2012; Publisert: 25.09.2012
Copyright: © Donat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser. Drs. Jochen Stritzker, Nanhai G. Chen, Ivaylo Gentschev og Aladar A. Szalay er ansatte i Genelux Corporation og har økonomiske interesser i Genelux Corporation. Dr. Barbara Hartl er ansatt i Genelux GmbH. Genelux Corporation også gitt en tjeneste Grant til Universitetet i Würzburg. Dr. Ulrike Donat og Dr. Stephanie Weibel er mottakere av et postdoktorstipend. Dr. Julia Sturm og Mr. Michael Hess er mottakere av en utdannet fellesskap fra Universitetet i Würzburg. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Det finnes ingen patenter eller produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Ifølge nyere studier, mer enn 90 % av kreftpasienter dør på grunn av direkte eller indirekte effekter av metastaser. Pasientens prognose blir derfor straks koblet til metastatisk trinn av carcinoma [1]. Metastatiske tumorceller infiltrere friskt vev og tverrskips barrierer for å få tilgang til lymfesystemet eller blodsirkulasjon. Tendensen til en tumorcelle for å angi lymfatiske eller blodårer er avhengig av evnen til å følge bestemte strukturer, slik som retikulære fibre i subkapsulær sinus av en drenerende lymfeknute eller endoteliale cellene som kler blodkarene [2].
Prostatakreft er kjent for å metastasere til ben, lunger og lymfeknuter [3], [4]. Det representerer den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn. Siden prostatakreft forløper asymptomatically, blir diagnosen ofte gjøres når metastaser har allerede dannet. Nåværende behandlingsstrategier for metastaser er lik de som brukes for primære tumorer [1]. Behandling av avansert prostata kreft er utført via konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling. Uheldigvis er disse behandlinger ofte resultere i utvikling av resistente tumorer og metastaser [5], [6]. Videre har det blitt vist at å holde veksten av fast tumor i sjakk kan fremme istedenfor å undertrykke dannelsen av metastaser [7]. Bekjempelse både dannelse og vekst av metastaser er derfor nøkkelen til suksess i kreftbehandling
Derfor er onkolytiske virotherapy en av de mest lovende nye strategier i kampen mot begge. Solide svulster og metastaser. Onkolytiske virus er i stand til selektivt å replikere i kreftceller, noe som resulterer i destruksjon av tumorvev, men etterlater friskt vev uskadd [8]. I 2007, Zhang
et al.
Først beskrev svekkede rekombinante vacciniavirus GLV-1h68 [9], [10]. Den onkolytisk Effekten av denne virus er vist i bryst, pankreas og prostata tumor xenografter [10] – [12]. Videre Gentschev
et al.
Vist, i prinsippet, den store terapeutiske potensialet i GLV-1h68 i behandling av lymfeknutemetastaser som stammer fra prostata carcinoma-cellelinjen PC-3 [11].
i denne studien, karakterisert vi de underliggende mekanismer av virus-mediert reduksjon av metastaser. For en detaljert analyse, vi først visualisert metastatisk spredning av PC-3-celler i lymfesystemet av nakne mus ved å sette
mRFP1
-Gene som koder for det røde fluorescerende protein under kontroll av CMV-promoteren inn i tumorcellegenomet . Ved viral injeksjon inn i PC-3-RFP tumor-bærende mus, viste vi at viruset behandling dramatisk redusert mengden av blod- og lymfekar, som er nødvendige ruter for metastatisk spredning av tumorceller, i tumorer, så vel som i metastaser [13] , [14]. Videre har vi oppdaget at betydelig høyere virus titer i PC-3 lymfeknutemetastaser enn i solide tumorer, og vi viste at nyrelymfeknutemetastaser ble kolonisert til en enda høyere grad enn lumbale seg. Så vidt vi vet er dette Virustropisme til metastaser har så langt ikke blitt beskrevet i litteraturen. Derfor setter vi ut for å analysere mekanismene som fører til fortrinnsrett viral kolonisering. I denne sammenheng, ble flere microenvironmental aspekter, slik som tumor og metastaser blodkar og perfusjon, proliferativ status og omfanget av PC-3-celle-nekrose, immuncellebelastning samt cytokin ekspresjon i primære tumorer og lymfeknutemetastaser analysert.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Den menneskelige prostata carcinom cellelinje PC-3 (DSMZ ACC465) var dyrket i RPMI 1640 (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) supplert med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) og 1% penicillin-streptomycin-løsning (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland). PC-3-RFP-celler ble dyrket under samme betingelser med unntak av tilsetning av 10 ug /ml blasticidin. Den afrikanske grønn apenyre fibroblastcellelinje CV-1, oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC CCL-70), ble dyrket i DMEM høy glukose (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) supplert med 10% FCS og 1% penicillin- streptomycin løsning. Humane epitelceller nyreceller (293ft) ble vennlig gitt av P. Hill (University of Nottingham, som opprinnelig ble oppnådd fra Invitrogen) og dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FCS og 2 mM L-glutamin (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland).
generasjon PC-3-RFP Cells
cDNA sekvens av den røde fluorescerende protein (
mRFP1
) ble satt inn i PC-3 celle genomet ved hjelp Vira Strøm ™ Lentiviral Expression System Kit (Invitrogen GmbH, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
mRFP1
kodende plasmid PCR TK-SEL-mRFP ble gitt av Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) og brukes til å generere
mRFP1-
inneholder lentiviral vektorer som beskrevet tidligere [15]. Replication-inhabil
mRFP1
kodende lentiviruses ble produsert i 293ft celler ved en co-transfeksjon av plasmidene pLP1, pLP2, PLP /VSVG som leverer lentiviral strukturelle og replikering proteiner og pLENTI6 /V5-MÅL-mRFP uttrykk plasmid bruker Lipofectamine
TM2000. Etter transduksjon av PC-3-celler med mRFP-koding lentiviruses og blasticidin (10 ug /ml) valg, en stabil RFP-uttrykk PC-3-klon ble utvalgt og RFP-ekspresjon i 98% av alle celler ble bekreftet ved flowcytometri .
virusstamme
svekket vaccinia virusstamme GLV-1h68 ble bygget som tidligere beskrevet av Zhang
et al.
[10]. Tre ekspresjonskassetter som koder for
Renilla
luciferase-GFP fusjonsprotein, β-galaktosidase, eller β-glucuronidase ble rekombinert inn i
F14.5L
,
J2R Hotell og
A56R
loci, henholdsvis av foreldre LIVP virus genomet. GLV-1h68 ble dyrket i CV-1 celler og renset gjennom sukrosegradienter.
Tumor Implantasjon og Virus Administration
Svulster ble generert ved å implantere 2 × 10
6 PC-3 eller PC -3-RFP celler i 100 mL PBS subkutant i høyre abdominal flanken av 6-8 uker gammel kvinne atymiske nakne
Foxn1
nu
mus (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Tyskland). En enkelt dose på 1 x 10
7 plakkdannende enheter (pfu) GLV-1h68 i 100 ul PBS ble injisert intravenøst (i.v.). For å studere viral kolonisering av PC-3-RFP metastaser, ble GLV-1h68 administreres etter magelymfeknutemetastaser var håndgripelig; vanligvis 45-60 dager etter PC-3-RFP celle implantasjon, å etterligne avansert stadium av prostata kreft. Siden avansert stadium av sykdommen er assosiert med vekttap uavhengig av viral infeksjon, ble vekten målt to ganger i uken, og musene ble avlivet før standardsatser ble overskredet. De analyserte behandlingsperioder ikke overstige 14 dager. Etter virus injeksjon helsetilstanden til musene ikke endret.
Alle dyreforsøk ble godkjent av regjeringen i Unterfranken, Tyskland (protokoll nummer AZ 55.2-2531.01-17 /08) og /eller Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Explora Biolabs, som ligger i San Diego Science Center (San Diego, USA) (protokollnumre: EB08-003; EB11-25).
Påvisning av menneske PC-3 celler i Lymfe noder via RT-PCR
tilstedeværelsen av humane PC-3-celler i større målestokk lumbar og nyre lymfeknuter ble analysert ved RT-PCR ved anvendelse av primere for human β-aktin som tidligere beskrevet [11]. En lymfeknute ble definert til å bli utvidet når maksimal diameter skredet 2 mm.
Fluorescens Imaging av Svulster og lymfeknutemetastaser
Bilder av GLV-1h68 eller PBS behandles PC-3-RFP svulst -holdige mus ble tatt enten med (MA, USA Sylinder, Hopkinton,) Maestro EX Imaging System eller med en MZ16 FA Stereo-fluorescens mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland). For avbildning av mus med Maestro EX Imaging System, ble dyrene bedøvet ved hjelp av 2-3% isofluran. Digitale bilder ble behandlet med Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, USA).
Analyse av virustiter i Svulster og metastaser
Mengden av viruspartikler i tumor og metastaser lysatene ble bestemt av standard plakk analyser. Derfor ble PC-3 tumorer og metastaser skåret ut 3, 7 og 14 dager etter GLV-1h68 injeksjon, hakket og 2 volumdeler av lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl med 2 mM EDTA, pH 7,4) supplementert med 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid og proteinase inhibitor cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Tyskland) ble tilsatt. Prøvene ble homogenisert ved hjelp av en Fastprep Shredder (Thermo Scientific, Karslruhe). Etter 3 fryse og tine sykluser etterfulgt av ultralydbehandling seriefortynninger ble titrert på konfluente CV-1-celler i 24-brønners plater. Alle prøvene ble målt i duplikater.
Immunohistochemistry
For histologi, svulster og metastaser ble skåret ut og fiksert i 16 timer i 4% paraformaldehyde /PBS, pH 7,4. Fremstilling av 100 um seksjoner og merkingsfremgangsmåter ble utført som beskrevet tidligere [16] fra Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Sveits). Etter merking ble vevssnitt montert i Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). Vevsprøver ble seksjonert (10 um tykkelse) med kryostaten 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Tyskland). Etter dehydrering i 10% og 30% sukrose (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) prøver ble innebygd i Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura Finetek Europa B.V., Alphen aan den Rijn, Nederland). Frysesnitt ble lagret ved -80 ° C og inkubert med primære antistoffer i 1 time. Etter vask med PBS, ble seksjonene farget i 1 time med sekundære antistoffer og endelig montert i Mowiol 4-88.
Antistoffer og reagenser
endotelceller blodkar ble farget med en hamster monoklonalt anti-CD31 antistoff (Chemicon International, Temecula, USA; MAB1398Z) og endothelial lymfeårer med en kanin polyklonale anti-LYVE-1 antistoff (Abcam, Cambridge, UK, ab14917). Ikke-spesifikk rotte-IgG (Jackson Immunoresearch, Pennsylvania, USA, 01200003) ble anvendt for å analysere permeabiliteten av blodårene i PC-3-RFP tumorer og metastaser. Derfor, ble 10 mg /kg rotte-IgG injisert intravenøst (i.v.) i PC-3-RFP tumor-bærende mus. Seks timer etter injeksjonen ble musene avlivet og 100 mikrometer deler av svulster og metastaser ble forberedt. Merking av antigen presenterende celler ble utført med et monoklonalt rotte anti-MHC klasse II (I-A /I-E) antistoff (eBioscience, San Diego, USA; 14-5321). B-celler ble farget med en rotte monoklonale anti-CD19 antistoff (Abcam, Cambridge, UK, ab25232), makrofager med en rotte monoklonale anti-CD68 antistoff (Abcam, Cambridge, Storbritannia, ab53444). Markøren Ki-67 proliferasjon ble merket med et kanin polyklonalt anti-Ki-67-antistoff (Abcam, Cambridge, UK, ab15580). For analyse av BrdU-inkorporering i DNA av PC-3-RFP celler i tumorer og metastaser, 120 mg /kg BrdU ble injisert intraperitonealt (i.p.). Tre timer senere ble tumorer og metastaser skåret ut og 10 um snitt ble fremstilt. Merkingen ble utført ved anvendelse av rotte-monoklonalt anti-BrdU-antistoff (Abcam, Cambridge, UK; ab6326) etter 30 min inkubering med 2 M HCl og vasking i PBS. Nuclei var Hoechst 33342-merkede (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). DyLight488-, DyLight549- og DyLight 649-konjugerte sekundære antistoffer (esel) ble hentet fra Jackson Immunoresearch (Pennsylvania, USA). Alle primære og sekundære antistoffer ble fortynnet 1:100 i PBS i tilfelle av 10 um eller seksjoner i PBS /0,3% Triton-X-100 i tilfellet med 100 um seksjoner.
Fluorescensmikroskopi
Mikroskopiske studier ble anvendt for å sammenligne tumor blodkar, status celleproliferasjon og spesifikke immuncellepopulasjoner av tumorer, så vel som metastaser. For å undersøke fluorescens-merket tumor og metastase seksjoner, ble følgende mikroskoper brukt: En stereo-fluorescens mikroskop MZ16 FA (Leica) er utstyrt med en digital CCD kamera og Leica IM1000 4.0-programvaren (1300 × 1030 pikslers RGB-fargebilder), en TCS SP2 AOBS konfokal laser mikroskop (Leica) er utstyrt med LCS 2,16 programvare (1024 × 1024 pikslers RGB-fargebilder) og en Axiovert 200 M mikroskop (Zeiss) med Axiovision 4.5 programvare (1388 × 1040 piksler gråtonebilder). Digitale bilder ble behandlet med Photoshop 7.0 (Adobe Systems, USA) og slått sammen for å gi pseudo-farget bilder.
Analyser av Digital Fluorescens Images
For analyser av digitale bilder av svulsten, LN og RN seksjoner, er det viktig å merke seg at det var en svulst per mus, men antallet av lumbar og renale lymfeknutemetastaser avvek fra mus til mus. I de fleste tilfellene var til stede per mus 2 LNS og 2 RNS. Per tumor eller metastase bilder av 2 seksjoner ble analysert, hvor data fra alle korsrygglymfeknutemetastaser ble slått sammen til LN og data innhentet fra alle nyrenes lymfeknuter ble slått sammen til RN.
Måling av lymfe og blod fartøy tetthet .
lymfe og blod fartøy tetthet ble målt i digitale bilder (× 80 og × 100 forstørrelse) av anti-LYVE-1 og anti-CD31 farget 100 mikrometer seksjoner. Åtte bilder per tumor, ble LN og RN analysert per farging. Eksponeringstid for enkeltbilder ble justert for å sikre god synlighet av alle påvisbare blod- og lymfekar og innredet med 8 like langt horisontale linjer ved hjelp av Photoshop 7.0. Alle lymfe eller blodårer som krysser disse linjene ble telt for å få fartøyet tetthet per seksjon.
Måling av blodkar diameter.
måling Blodkar diameter ble utført ved hjelp av digitale bilder (× 100 forstørrelse) på 100 um delene farget med anti-CD31 ved bruk av Leica IM1000 4,0 programvare. Bilder av svulster og lymfeknutemetastaser ble oppnådd med individuelle eksponeringstider for å få optimale CD31 signaler og inkluderer signalavhengig variasjon av fartøy diameter. Enkeltbilder ble kledd med tre like langt horisontale linjer og diameter på alle blodårene som krysser disse linjene ble målt. Blodårediameter ble bestemt i 4 bilder per svulst, LN og RN.
Kvantifisering av § merking.
For å kvantifisere permeabilitet av blodkar, digitale bilder (× 160 forstørrelse) på 100 mikrometer histologi deler av svulster og metastaser ble analysert. Det totale arealet positive til IgG (merket med anti-rotte-DyLight488) ble bestemt i 16 forskjellige områder per sample. Mengden av nekrotisk vev i PC-3 svulster eller metastaser ble bestemt i digitale bilder av 100 um seksjoner. Kjerner ble merket med Hoechst 33342. Den fraksjon av en seksjon ikke farget av Hoechst grunn av kjerner degradering ble definert som nekrotisk område. I dette tilfellet ble bilder av 2 hele deler per prøve analysert. Mengden av MHC-II, CD19 og CD68-positive celler i PC-3 tumorer og metastaser ble målt i digitale bilder av 10 um seksjoner. To hel del bilder per prøve ble analysert. Analyser av mengden av IgG, nekrotisk vev og MHC-II-, CD19- og CD68-positive celler i digitale bilder som ble utført med ImageJ programvare (https://rsbweb.nih.gov/ij) etter konvertering RGB-bilder til 8 -bit gråtonebilder ved hjelp av Photoshop 7.0.
Måling av fluorescens intensitet.
Måling av CD31 og Ki-67 intensitet ble gjort i digitale bilder av 100 mikrometer og 10 mikrometer deler av PC- 3 svulster og metastaser. For hver farging, ble 8 forskjellige bilder per prøve ervervet med identiske innstillinger. RGB-bildene ble konvertert til 8-bits gråskala med en intensitet varierer fra 0-255. Fluorescens intensitet av CD31 og Ki-67 stainings representerer den gjennomsnittlige lysstyrken på alle flekker relatert piksler, og ble målt ved hjelp av ImageJ. Bilder av CD31 flekker ble tatt på 100x, bilder av Ki-67 ved 400x forstørrelse.
Protein Isolering og karakterisering
Protein lysates av PC-3-RFP svulster, korsrygg og nedsatt lymfeknutemetastaser av 3 mus 49 dager etter tumorcelle implantasjon ble analysert med en immun-relaterte protein antigen profilering (RodentMAP® v2.0, regler basert medisin, Austin, USA) ved hjelp av antistoffbundet perler. Lysater ble utført som beskrevet tidligere [11]. Resultatene ble normalisert basert på totale proteinkonsentrasjonen.
Statistical Analysis
En to-tailed Student
t
test ble brukt for statistisk analyse.
P
verdier av ≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant. Stjernene viser en signifikant forskjell mellom forsøksgruppene. (* Indikerer p≤0.05; ** indikerer p≤0.01; *** indikerer p≤0.001)
Resultater
Visualisering av metastatisk spredning av PC-3-RFP tumorceller via lymfesystemet i Nude Mice
for å analysere metastatisk spredning av PC-3 celler i nakne mus, var det nødvendig å etablere primære svulster ved å implantere 2 × 10
6 RFP-uttrykk PC-3-celler subkutant inn i høyre flanke av nakne mus. Om 70 dager etter implantering vi visualisert metastasized tumorceller i lumbar (LN) og renal (RN) lymfeknuter i levende PC-3-RFP tumorbærende mus (Figur 1a). Foruten deteksjon i lumbale og renal lymfeknuter, ble PC-3-RFP celler også visualisert i skip som forbinder de lymfeknute parene (Figur 1b). For å finne ut om disse fartøyene er lymfatiske eller blodkar immunohistologiske stainings ble utført. Merking av LYVE-1 (lymfatisk markør) og CD31 (blodåre markør) i vevssnitt klart frem en lymfatisk opprinnelsen til disse tumorcelleholdige fartøy-lignende strukturer (Figur 1c).
2 × 10
6 PC-3 eller PC-3-RFP-celler ble implantert inn i den høyre flanken til nakne mus. (A) Real time avbildning av en levende naken mus som bærer en PC-3-RFP svulst 70 dager etter implantasjon, dorsal og ventral visning. T, svulst; LN, lumbale lymfeknutemetastaser; RN, nyrelymfeknutemetastaser. (B) Korsrygg (LN1, LN2) og renal (RN1, RN2) lymfeknutemetastaser i magen av en PC-3-RFP solid tumor-bærende mus 65 dager etter implantasjon. Høyre bilde: migrasjon av PC-3-RFP celler mellom LN og RN. (C) 100 mikrometer tverrsnitt av delen mellom LNS og RNS farget med henholdsvis anti-CD31 og anti-LYVE-1-antistoff,. (D) For human β-actin positive lymfeknuter 21, 28, 35 og 42 dager etter implantasjon av PC-3-celler, og (e) tettheten av lymfekar i tilsvarende primære PC-3-tumorer. Svulster, lumbale og renal lymfeknuter på 4 mus ble analysert per tidspunkt. For å bestemme lymfe fartøy tetthet, 100 mikrometer deler av PC-3 svulster ble utarbeidet og 2 seksjoner ble farget med anti-LYVE-1 antistoff. Fire bilder (x 80 forstørrelse) per seksjon ble analysert som beskrevet i materialer og metoder. Skala barer representerer 2 mm (b og venstre bilde c) og 200 mikrometer (høyre bilder c). Alle bilder er representative eksempler.
Til sammen vi visualisert metastatisk spredning av PC-3-RFP tumorceller fra den definerte primærtumor stedet på høyrekanten til regional korsryggen og fjerne nyrenes lymfeknuter i nakne mus.
i tillegg er en tidsbasert sammenheng mellom dannelsen av lymfeknutemetastaser og tettheten av lymfekar i de tilsvarende PC-3-tumorer ble vist. Over tid, en kontinuerlig økning av lymfeknuter positivt for metastasized PC-3 celler ble observert (figur 1D). Samtidig lymfe fartøy tetthet i PC-3 svulster økt (figur 1e) som indikerer sammenheng mellom mengden av lymfeårer i solide svulster og lymfeknutemetastaser formasjon.
GLV-1h68 behandling reduserer dramatisk blod og lymfe Vessel Tetthet i PC-3-RFP Svulster og metastaser
Nylig har det blitt vist at GLV-1h68 behandling av PC-3 tumorbærende mus resulterer i en betydelig reduksjon av lymfeknutemetastaser [11]. I tillegg viste vi at GLV-1h68 er også et effektivt middel i behandlingen av PC-3 lungemetastaser, som i hovedsak oppsto ved metastatisk spredning av PC-3 celler via hematogenous ruten (figur S1). For å forstå det terapeutiske potensialet i GLV-1h68, analyserte vi effekten av viral-behandling på tumorassosierte blod- og lymfekar siden de spiller en viktig rolle som ruter for metastatisk spredning til fjerne organer og lymfeknuter [13], [14].
for CD31-positive blod så vel som for LYVE-1-positive lymfekar en betydelig reduksjon av fartøyet tetthet i PC-3 svulster, LNS, og RNS ble observert på grunn av intravenøs (iv) injeksjon av GLV -1h68 (figur 2). Blodkar-tetthetsmålinger viste en reduksjon av densiteten med 46% i tumorer og LNS og med 60% i RNS i vaccinia-virus-injiserte mus, henholdsvis (figur 2a og b). Lignende resultater ble oppnådd for lymfen fartøyet densitet (figur 2c og d) indikerer at effekten av GLV-1h68 var sterkest i nyrelymfeknutemetastaser.
Analyse ble utført 57 dager etter implantering av 2 x 10
6 PC-3 celler og 7 dager etter injeksjon av 1 x 10
7 pfu GLV-1h68. For å finne ut blod og lymfe fartøy tetthet, 100 mikrometer deler av svulster, LNS og RNS av 5 PBS og 5 GLV-1h68-behandlede mus ble farget med anti-CD31 eller anti-LYVE-1 antistoff. Blod og lymfeårer ble telt i 4 bilder (× 100 forstørrelse) fra hver av 2 deler per prøve. (A) Blodkar tetthet i PC-3-tumorer /metastaser og (b) representative bilder av anti-CD31 fargede seksjoner. Blodårene er vist i gråtoner, med GLV-1h68 uttrykt GFP i grønt. (C) lymph fartøyet tetthet i PC-3-tumorer /metastaser og (d) representative bilder av anti-LYVE-1 fargede seksjoner. Lymfeårer vises i gråtoner, med GLV-1h68 uttrykt GFP i grønt. Skala barer representerer 500 mikrometer.
I sammendraget, resultatene viser tydelig at onkolytiske svulstvev ødeleggelse i PC-3 svulster og metastaser er betydelig forbedret med utryddelsen av tumor blodkar samt lymfekar.
Fortrinnsrett Kolonisering av lymfeknutemetastaser Sammenlignet primære PC-tre svulster ved GLV-1h68
Siden vi har observert en sterkere reduksjon av blod og lymfe fartøy tettheter i nyrelymfeknutemetastaser i forhold til primære svulster vi dro ut for å undersøke viral koloniserings mønstre av primære svulster, LNS og RNS. For å oppnå dette målet, PC-3-RFP tumor-bærende mus ble injisert i.v. med 1 × 10
7 plakkdannende enheter (PFU) GLV-1h68. For å etterligne den situasjon av avansert stadium kreftpasienter og for å sikre tilstedeværelse av metastaser i lymfeknuter vi injisert vaccinia virus i den siste fasen av sykdommen 55 dager etter tumorcelle implantasjon. Multispektrale avbildning av svulster og metastaser avdekket klare GFP signaler i svulster, LNS og RNS allerede 3 dager etter virus injeksjon (dpi). Overraskende, GFP intensitet var den høyeste i RNS, etterfulgt av LNS og deretter solide tumorer (figur 3a). Basert på disse funnene antar vi en mer effektiv kolonisering av lymfeknutemetastaser ved GLV-1h68 forhold til primære PC-tre svulster.
1 × 10
7 pfu GLV-1h68 var intravenøst injisert inn i PC-3-RFP tumor-bærende mus. (A) PC-3-RFP tumorbærende mus 3 dager etter injeksjon av GLV-1h68. (B) Virustitere i PC-3-RFP tumorer, LNS og RNS 3, 7 og 14 dager etter injeksjon av GLV-1h68. Virus injeksjon ble utført 55 dager etter tumorcelle implantasjon. Tumorer og lymfeknutemetastaser av 6 mus ble analysert for hver gruppe (n = 6). (C) 100 mikrometer deler av et PC-3-RFP tumor og nyrelymfeknutemetastase 77 dager etter implantasjon og 7 dager etter virus-injeksjon. PC-3-RFP celler er vist i rødt, med GLV-1h68 uttrykt GFP i grønt. Alle bilder er representative eksempler. Skala barer representerer en mm (b) og 2 mm (c).
For ytterligere analyse, viral kolonisering mønstre for svulster, LNS og RNS ble studert i en tid kurs på dag 3, 7 og 14 etter virus injeksjon av plakk analyser. Faktisk ble det vist at det var betydelig høyere virale titere i lymfeknutemetastaser i forhold til primære PC-3-RFP tumorer ved alle de tre tidspunkter (figur 3b). Interessant, 3 og 7 dpi RNS ble kolonisert i en høyere grad enn LNS. På dag 7 etter virus injeksjon 1,4 × 10
9 pfu av GLV-1h68 per gram vev ble bestemt i RNS. I motsetning til dette ble bare 28% av RN viruskonsentrasjonen påvist i LNS, og så lite som 2% i primærsvulster. Etter to uker, de første forskjellene i virustiter mellom LNS og RNS var ikke lenger påvisbar.
I tillegg mikroskopisk analyse av PC-3-RFP tumor og metastaser seksjoner viste, som forventet fra høyere virale titere, også høyere GFP signaler i metastaser i motsetning til solide svulster 7 dager etter GLV-1h68 injeksjon (figur 3c). Videre viste vi at preferanse kolonisering av metastaser i forhold til faste tumorer hos GLV-1h68 ikke er begrenset til lumbar og renale lymfeknutemetastaser. Høyere GFP signaler og virale titere ble også observert i inguinal (IN) og hofte (SN) lymfeknutemetastaser (fig S2). I tillegg undersøkelse av en annen rute virus injeksjon avslørte lignende GLV-1h68 koloniserings mønstre 7 dager etter intratumor (det) injeksjon (figur S3).
Til sammen utgjør disse resultatene indikerte en meget selektiv kolonisering metastaser av GLV-1h68 i forhold til primære svulster.
Analyse av Microenvironmental Faktorer i primærsvulster og metastaser Nødvendig for Enhanced viral Konsentrasjoner i lymfeknutemetastaser
for å finne årsakene til den forbedrede viral kolonisering av lymfeknutemetastaser, vi analyserte status for PC-3 svulster og metastaser før vacciniavirus injeksjon skjedde. Forskjellige forskjeller i mikromiljøet av tumorer og metastaser som kan være avgjørende for viruset for å kolonisere metastaser i en høyere grad enn tumorene hadde blitt vurdert. Derfor blodkar, proliferativ status for PC-3 celler, grad av nekrose, immunceller og cytokin uttrykk i svulster, LNS og RNS ble analysert i uinfiserte PC-3-RFP tumorbærende mus. Å etterligne situasjonen for avansert stadium kreftpasienter når diagnosen kreft vanligvis skjer, vi analysert microenvironmental parametre i den siste fasen av sykdommen mellom 45-60 dager etter tumorcelle implantasjon.
Økt vaskulær permeabilitet i lymfeknute metastaser.
Først av alt, analyserte vi enten forskjeller forekommer i vaskulaturen angående tetthet og permeabilitet av fartøy mellom tumorer og metastaser, som fører til en høyere første mengde av viruspartikler i de forskjellige tumorvev. Histologi av PC-3-RFP svulster, LNS og RNS ble utført og blodårene ble merket med CD31. Selv om det var ingen forskjeller i blodåren densitet mellom tumorer og metastaser observert 57 dager etter tumorcelle implantasjon (figur 2a PBS-gruppen), fluorescens intensiteten av CD31-farging var signifikant høyere i LNS og RNS i forhold til faste tumorer (figur 4a) . Generelt, er blodkaret markør CD31 sterkt oppregulert på endotel-celler i betent vev eller på områder av pågående leukocytt-transmigrasjon og er assosiert med økt vaskulær permeabilitet [17]. Derfor ble en detaljert mikroskopisk undersøkelse av blodkar vedrørende fartøyets diameter og vaskulær permeabilitet i tumorer sammenlignet med de i metastaser utført. Betydelig, LNS og RNS avslørt høyere blodårediameter (gjennomsnittlig diameter 15 mm) enn solide PC-3-RFP svulster (gjennomsnittlig diameter 10 mm) (figur 4b). For å finne ut om disse utvidede blodårer faktisk bidra til økt vaskulær permeabilitet i lymfeknutemetastaser, bloduttredelse mønstre av intravenøst injisert rotte-IgG ble analysert histologisk. Interessant ble det betydelige høyere mengder ekstravasert IgG påvist metastaser (midlere IgG-positiv område ca. 60%) sammenlignet med tumorer (bety IgG-positiv område 25%).
