Abstract
Induksjon av polyploidi regnes som den reproduktive slutten av celler, men det er dokumentert at polyploid gigantiske kreftceller (PGCCs) bidra til celle repopulation under svulst tilbakefall. Men rollen til disse cellene i utvikling, progresjon og effekten av behandlingen i tykktarmskreft forblir udefinert. Derfor Hovedmålet med denne studien var å undersøke generasjon PGCCs i tykktarm kreft celler og identifisere mekanismer for dannelse. Behandling av HCT-116 og Caco-2 tykktarmskreftceller med den hypoksi ligne CoCl
2 induserte dannelsen av celler med større celle og kjernestørrelse (PGCCs), mens cellene med normal morfologi ble selektivt elimineres. Cytometri analyse viste at CoCl
2 behandling induserte G2 cellesyklus-stans og generering av et polyploid celle subpopulasjon med økt cellulær DNA-innhold. Polyploidi av hypoksi-indusert PGCCs ble bekreftet av FISH analyse. Videre CoCl
2 behandling effektivt indusert stabilisering av HIF-1α, den differensielle ekspresjonen av en trunkert form av p53 (P47) og reduserte nivåer av cyklin D1, som angir molekylære mekanismene som er forbundet med cellesyklus-stans ved G2. Generering av PGCCs bidro også til utvidelse av en celle subpopulasjon med kreft stamceller (cscs) egenskaper, som angitt ved colonosphere formasjons analyser, og forbedret chemoresistance til 5-fluorouracil og oxaliplatin. I konklusjonen, farmakologiske induksjon av hypoksi i tykktarm kreft celler fører til dannelse av PGCCs, utvidelse av en celle subpopulasjon med CSC egenskaper og chemoresistance. De molekylære mekanismene som er involvert, inkludert stabilisering av HIF-1 α, involvering av p53 /P47 isoform og cellesyklus arrest i G2, foreslår nye mål for å hindre tumor tilbakefall og behandlingssvikt i tykktarmskreft
Citation.: Lopez-Sánchez LM, Jimenez C, Valverde A, Hernandez V, Peñarando J, Martinez A, et al. (2014) CoCl
2, en Mimic av Hypoksi induserer dannelse av polyploid kjempeceller med stamceller Kjennetegn i Colon Cancer. PLoS ONE 9 (6): e99143. doi: 10,1371 /journal.pone.0099143
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 31 mars 2014; Godkjent: 09.05.2014; Publisert: 16 juni 2014
Copyright: © 2014 Lopez-Sánchez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i manuskriptet
Finansiering:. Støttet av tilskudd til A.R.-A. fra Programa de Promoción de la INVESTIGACION en Salud del Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00428 og PI13 /00 553) (https://www.isciii.es/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest vanligste kreftformen med 1,234,000 tilfeller på verdensbasis i 2008 i henhold til GLOBOCAN [1]. CRC står for 13% av alle krefttilfeller og nesten 1000 nye CRC tilfeller ble diagnostisert i 2012 i Europa [2], hvor er den tredje hyppigste kreft og etter lungekreft er det den nest hyppigste dødsårsaken [3]. Selv om dødelighet av CRC har gått noe ned fra 1990 til i dag, og til tross for fremskritt innen deteksjon og kirurgisk behandling, er det ingen kjent kur for metastatisk CRC, og 5-års overlevelse for disse pasientene er skuffende lav (ca 8%) . Eksistensen av en relativt sjelden sakte prolifererende eller hvile celle subpopulasjon, svært motstandsdyktig mot narkotika, med lignende egenskaper til stamceller og kjent som kreft stamceller (cscs), er foreslått som en hovedårsak til den alarmerende ineffektiviteten av standard kreftbehandling [ ,,,0],4], [5]. I løpet av det siste tiåret, har det vist seg at disse cscs er i stand til å formere seg og produsere hele tumormassen. Dette har ført til foreslå en modell av cscs, eller tumor hierarkisk modell, hvor tumorceller er heterogene, og bare en liten cellepopulasjon, som er på toppen av den hierarkiske pyramide, er ansvarlig for initiering og opprettholdelse av tumorvekst [5] . Men nyere studier tyder på at kreft stemness kan skaffes ved å endre genuttrykk programmer og derfor CSC biologi må skifte fra et rigid hierarkisk til en mer fleksibel modell [6], [7]. Cscs er mye mer motstandsdyktig enn differensierte tumorceller til behandlinger som benyttes i klinikken [4], [8] og, selv om behandling er i stand til effektivt å fjerne det meste av tumorceller og tumorvolum reduseres, cscs påvirkes ikke, og når terapi stopper de er i stand til å gjenoppta tumorvekst og differensiering, forklarer hendelser som tumor tilbakefall. Det har således blitt vist at risikoen for tilbakefall av CRC er proporsjonal med uttrykket i den primære tumor av gener som er spesifikke for tarm stamceller som også identifisere et CSC befolkning i tumoren [9]. Dessuten cscs ser ut til å spille en viktig rolle i formidling prosessen, tumor dvalen og metastase [10].
Hypoksi er en av de viktigste patologiske trekk ved solide tumorer, fordi det er et resultat av en ubalanse mellom proliferasjon av tumorceller og oksygentilførsels [11]. Tumor hypoksi representerer ikke bare et stort problem som påvirker terapeutisk innsats, men det er eksperimentelt bevis som utgjør en fysiologisk seleksjonspress fremme tumor aggressivitet [12]. Viktigere er hypoksi knyttet til vedlikehold og dannelse av cscs [11], [13], fremme deres fenotype og tumorigenesis [14]. Mange av de cellulære responser til hypoksi blir mediert gjennom endringer i genekspresjon som reguleres av hypoksi induserbar faktor (HIF-1α), som har blitt et meget attraktivt mål for utvikling av nye kreftterapier [11]. Under normoksisk forhold HIF-1α protein kontinuerlig degradert etter hydroksylering av Prolyl- hydroksylaser av to viktige prolinresidier i sin oksygenavhengig nedbrytningsdomene [15]. Men under hypoksiske betingelser HIF-1α stabiliseres, translocates til kjernen og, ved binding til HIF-1β subenhet, danner en aktiv transkripsjonsfaktor stand til å aktivere ekspresjon av målgener tilrettelegge cellulær tilpasning til hypoksi [13]. Cobalt chloride (CoCl
2) er en mimetisk middel som brukes
in vitro
å indusere cellulære responser mediert av hypoksi. Det antas at CoCl
2 stabiliserer HIF-1α ved inhibering av prolylhydroksylase enzymer [16].
Det er blitt foreslått at, på samme måte som normale stamceller, er kritisk for å opprettholde overlevelse av den lokale mikromiljøet cscs i sin «nisje» der mottak av de spesifikke molekylære signaler regulere deres spredning og differensiering [17]. Overraskende, selv om flere studier har nylig vist en viktig rolle av endoteliale celler (ECS) og perivaskulær nisje i reguleringen av normale stamceller og cscs, andre studier indikerer at hypoksi spiller også en viktig rolle [17]. Betydningen av en perivaskulær nisje i å regulere cscs på den ene siden og rollen til hypoksi i den andre kan virke ved første blikk paradoksal. Likevel kan ECS på tumoren mikromiljøet gjennomgå funksjonelle forandringer som fører til genereringen av en hypoksisk mikromiljøet. Således er glioblastom cscs befinner seg i intim kontakt med avvikende tumorvaskulatur [18]. Nylig ble det rapportert at hypoksi kan velge polyploide giganten kreftceller, (PGCCs) som bidrar aktivt til tumorvekst ved å generere cscs [19]. Faktisk, de fleste av humane tumorer er mobilnettet heterogen [20], og i over et århundre, har patologer observert gigantiske celle svulster, signifikant oftere etter noen form for terapeutisk intervensjon [19]. Disse cellene bidrar til tumor heterogenitet, men de fleste av sine funksjoner er ennå ikke definert. Selv om induksjon av polyploidi har tradisjonelt vært ansett som den reproduktive enden av celler, er det bevis på at kjempeceller bidra til celle repopulation under tumorresidiv [21], [22].
Selv om det er data for generering av PGCCs i eggstokkreft og brystkreft, fortsatt rollen til disse cellene i utvikling, progresjon og effekten av behandlingen i CRC udefinert. Derfor Hovedmålet med denne studien var å undersøke
in vitro
generasjon PGCCs i tykktarm kreft celler og identifisere mekanismer for dannelse.
Materialer og metoder
Cell Kultur og colonosphere formasjon assay
Caco-2-celler (ECACC, Salisbury, UK) ble dyrket i MEM med Earle s salter (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike) inneholdende 15% føtalt bovint serum. HCT-116-celler (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) ble dyrket i McCoys 5A medium (BioWest, Nuaille, Frankrike) inneholdende 10% føtalt bovint serum (PAA Laboratories). Kulturmedier ble supplert med 2 mM glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og amfotericin B (2,5 pg /ml). Celler ble holdt i en fuktig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO
2. En frisk stamoppløsning 0,4 M koboltklorid (CoCl
2) ble fremstilt i vann og tilsatt til mediet for å oppnå de ønskede sluttkonsentrasjoner.
For det colonosphere-analysen, etter behandling med forskjellige doser av CoCl
2 i 48 timer, ble cellene tripsinized, tellet og re-sådd ut ved klonal tetthet (1 celle /ul) i 96-brønns plate med ultra-lav festeflaten (Costar, Corning, NY, USA) med serumfritt Dulbeccos MEM Nutrient Blanding F + 12 Hams-medium supplert med 10 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor, 20 ng /ml epidermal vekstfaktor og 1% volum /volum metylcellulose (R 0,05
Resultater
CoCl
2 behandling induserer dannelsen av PGCCs i tykktarm kreft celler
Når HCT-116 og Caco- 2 tykktarmskreft cellelinjer ble dyrket under normale forhold noen store celler med forstørrede kjerner (PGCCs) ble sporadisk observert. Imidlertid, når cellene ble behandlet med CoCl
2 disse PGCCs tydelig økning i antall, mens celler med normal morfologi ble selektivt fjernet (figur 1A). De PGCCs indusert av CoCl
2 behandling var 3-10 ganger større enn normale celler, og med en karakteristisk morfologi, avhengig av cellelinjen (figur 1A). Dermed i HCT-116 celler behandling med CoCl
2 genererte PGCCs med cytoplasmatiske utvidelser som minner om celler av neuronal type (figur 1A), mens i Caco-2 celler indusert PGCCs ble rundet og hadde ingen grener (Fig. 1A) . Økningen i kjernefysisk størrelse etter behandling også variert mellom de to cellelinjer, og selv om en klar økning ble observert i begge cellelinjer, atom utvidelsen var mer uttalt i tilfellet med Caco-2-celler (figur 1B).
A) Både HCT-116 og Caco-2-cellelinjer ble behandlet med 300 mM CoCl
2 i 48 timer. Alle mikrofotografier ble oppnådd ved anvendelse av den samme endelige forstørrelse (x 200). Målestokken tilsvarer 20 pm. Farging av cellekjerner med DAPI ble utført for å vurdere den gjennomsnittlige atomstørrelse (endelig forstørrelse x 200). Skala barer svarer til 20 pm. B) Endringer i kjernefysisk størrelse etter CoCl
2 behandling. Data representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (* P 0,05, sammenlignet med kontrollen)
PGCCs dannelsen i kolonkreftceller er assosiert med cellesyklus endringer og polyploidi
for ytterligere å utforske de mekanismer som er ansvarlig for induksjon av PGCCs, ble cellesyklus analysert ved hjelp av strømningscytometri. I begge cellelinjene CoCl
2 behandling forårsaket store forandringer i ulike faser av cellesyklusen (figur 2). En klar reduksjon i antallet celler i G1 fase, sammen med en økning av celler i S og G2-fasene ble observert. Videre bekreftet flowcytometrisk analyse at behandlingen med CoCl
2 som etterligner hypoksi er i stand til å generere en celle subpopulasjon med en høy økning av DNA-innhold og derfor svarende til PGCCs. Den polyploid Innholdet i disse cellene ble bekreftet ved fluorescens in situ hybridisering (FISH) for å påvise tilstedeværelse av multiple kopier av DNA i de enkelte PGCCs. For Caco-2 celler FISH analyser gitt noe svar, muligens fordi denne cellelinjen har allerede et sterkt endret karyotype. Imidlertid, som det kan ses på figur 3, mens HCT-116 kontrollceller viste normal kjernefysisk størrelse og markører indikert normal disomy for kromosomer X (grønn), 18 (blå) og 21 (rød), behandling med CoCl
2, indusert PGCCs som viser en øket kjernefysisk størrelse ledsaget av polyploidi for de tre kromosommarkører anvendes.
Både HCT-116 (A) og Caco-2 (B) celler ble behandlet med de angitte doser av CoCl
2 etter 6 eller 48 timer. Deretter ble en cellesyklusanalyse utført ved strømningscytometri. Stolpediagrammene til høyre viser relative endringer for å kontrollere celler i prosentandelen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen. Data representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige kulturer.
HCT-116 celler ble dyrket i nærvær av 300 pM CoCl
2 og deretter en FISH-analyse ved anvendelse av prober for kromosomer X (grønn) , 18 (blå) og 21 (rød) ble utført.
Molecular mekanismene som er involvert i dannelsen av PGCCs i tykktarmskreft
En serie forsøk ble utført ved å analysere mulige molekylære mekanismene som er involvert i produksjon av PGCCs i tykktarm kreft celler. Først ble ekspresjonen av HIF-1α protein analysert for å bekrefte at behandlingen med CoCl
2 effektivt kan indusere dens stabilisering. Som vist i Figur 4, selv om ekspresjon av HIF-1α var udetekterbar i kontrollceller, ved behandling med CoCl
2 indusert i begge cellelinjer, og i en doseavhengig måte, en økning i ekspresjonsnivåene av dette proteinet . Derfor, etterligner av hypoksi i kolon kreftceller er forbundet med endringer i cellesyklusen og generering av PGCCs.
A) HCT-116 og Caco-2-celler ble behandlet med de angitte doser av CoCl
2 i 6 timer og deretter ekspresjon av HIF-1α, p53 og cyklin D1-proteiner ble evaluert ved hjelp av spesifikke antistoffer. B) Den tilsvarende densitometriske analyser av proteinbåndene detektert i immunoblot og normalisert til signalet fra β-aktin er også vist. Dataene er middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (* P 0,05, sammenlignet med kontrollen)
På den annen side, er et uttrykk for cyclin D1 essensielle for cellesyklus for å gå videre fra G1 til S-fasen, et punkt hvor cellen. er allerede forpliktet seg til å fullføre en ny runde med celledeling. Når cellen «bestemmer» for å starte denne S-fasen, er høye nivåer av cyklin D1 downregulated for å tillate DNA-syntese. Dersom forholdene fortsetter å tillate cellevekst, cyklin D1-nivåene øker igjen i G2-fasen. Imidlertid, hvis cellesyklusen er kompromittert ved dette punktet, cyklin D1-nivåer forblir lave. Som vist i figur 4, lavere nivåer av cyklin D1 observert ved behandling av HCT-116 eller Caco-2-celler med CoCl
2 har også foreslått en cellesyklus-stans ved G2, som bekrefter resultatene oppnådd i strømningscytometri-analyse.
Det er kjent at p53 spiller en viktig rolle i regulering av cellesyklusutvikling ved G1 og G2 sjekkpunkter. Nærmere bestemt, i respons til DNA-skade, aktivering av molekylære reaksjonsveier er regulert av p53, fører til cellesyklus-stans ved G1 [23]. Videre, mer nylig har det blitt rapportert at ekspresjon av et p53-isoform som mangler de første 39 aminosyrene og betegnet P47, er involvert i cellesyklus-stans ved G2 i respons til forskjellige cellestressbetingelser, inkludert endoplasmatiske retikulum stress, ufoldede protein respons og hypoksi [24]. Derfor vi neste analysert uttrykket av både p53 isoformer i tykktarm kreft celler etter behandling med CoCl
2. Som vist i figur 4, har behandling med CoCl
2 ikke forandre ekspresjon av full lengde protein p53 (p53FL), men induserte ekspresjon av den avkortede isoformen (p53 /P47). Disse resultater antyder at etterligner av hypoksi i tykktarmskreftceller induserer ekspresjon av p53 /P47 isoform negativ regulering av cellesyklusutvikling ved G2. Derfor er rollen til p53 /P47 ble videre undersøkt ved behandling av tykktarmskreftceller med pifithrin-α (PFT-α), som spesifikt undertrykke p53-mediert transaktivering. Behandling av Caco-2 celler med PFT-α forårsaket en uventet cytotoksisitet som utelukket påfølgende morfologiske og cellesyklus analyser. Imidlertid, og som vist i figur 5A, behandling av HCT-116-celler med 10 pM PFT-α redusert virkningen av CoCl
2 på cellesyklus Videre er denne forbehandling, som spesifikt blokkerer transkripsjonen aktivitet av p53, oppheves formasjonen av PGCCs indusert av CoCl
2 i HCT-116 celler (figur 5B). Derfor er nødvendig for hypoksi-indusert cellesyklus endringer og dannelsen av PGCCs i tykktarm kreft celler transkripsjonelt aktiv p53 /P47.
HCT-116 celler ble behandlet med 300 mikrometer CoCl
2 i nærvær eller i fravær av 10 pM pifithrin-α (PFT-α), som er en spesifikk hemmer av den transkripsjonelle aktivitet av p53. Deretter ble en cellesyklusanalyse utført ved strømningscytometri. (A) Data representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige kulturer. (* P 0,05, sammenlignet med celler eksponert for CoCl
2 i fravær av PFT-α), og (b) forandringer i cellemorfologi ble undersøkt ved hjelp av synlig mikroskopi. Skala barer tilsvarer 50 mikrometer.
PGCCs generasjon i tykktarmskreft er assosiert med en økning i en undergruppe av kreft stamceller
Det har vært antydet at hypoksi generert PGCCs kan bidra aktivt til tumorvekst ved generering av cscs [19]. Derfor bestemte vi oss for å analysere da dannelsen av colonospheres
in vitro
, som er en funksjonell analyse av selvfornyelse capbility av cscs. For dette formål, etter anrikning i PGCCs ved behandling med CoCl
2 i 48 timer, overlevende celler ble dyrket ved klonal tetthet med serumfritt medium med lav-adherens plater som hindrer cellulær adhesjon. Under disse betingelser, differensierte epitelial tumorceller dør av anoikis og bare en subpopulasjon av tumor udifferensierte celler med stilk egenskaper (cscs) overlever, som er i stand til å generere tumorospheres (colonospheres) i suspensjon ved selvfornyelse. Tidligere eksperimenter med lipofile fluorescerende flekker ble utført for å bekrefte at den enkelte colonospheres ble avledet fra enkeltceller. Således, blanding av like mange DII (rød) – eller DIO (grønn) -merkede celler før gjennomføring av den colonosphere formasjonen analysen resulterte i dannelse av kuler inneholdende bare den ene eller den annen etikett (fig S1)
som vist i figur 6, forbehandling med CoCl
2 og etterfølgende anrikning i PGGCs økt både HCT-116 og Caco-2-cellene evnen til å danne colonospheres, noe som tyder på at genereringen av PGCCs bidrar til utvidelsen av CSC subpopulasjon i begge cellelinjer. Deretter ble de dannede colonospheres disaggregert og den resulterende cellepopulasjon ble dyrket på nytt på klonal tetthet for dannelsen av sekundære colonospheres. (Figur 6). Celler avledet fra primære colonospheres dannet av CoCl
2-behandlet kolon kreftceller beholdt en høyere evne til å danne colonospheres, bekrefter en overlegen selvfornyelse kapasitet. Videre sekundære colonospheres avledet fra colonospheres dannet av celler som er utsatt for hypoksi var signifikant større i størrelse sammenlignet med de som er avledet fra kontrollceller (figur 7). Denne økningen i størrelse bekreftet at cscs generert i en cellepopulasjon beriket i PGCCs også besatt en større evne til selvfornyelse, og derfor hadde de mer markerte stemness egenskaper [25].
Etter anriking i PGCCs etter behandling for 48 uM CoCl
2, overlevende celler ble dyrket ved klonal tetthet med serumfritt medium med lav-adherens-plater og antall primære dannede colonospheres ble undersøkt etter syv dager. Primære colonospheres ble skilt ut og den resulterende cellepopulasjon ble dyrket på nytt på klonal tetthet for dannelsen av sekundære colonospheres. Grafikk viser antall primær (grå søyler) og sekundære (svarte søyler) colonospheres dannet av HCT-116 og Caco-2 celler etter hver behandling. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige kulturer. (* P 0,05, sammenlignet med kontroll)
Den sekundære colonosphere-analysen ble utført som beskrevet i figur 6 legende og under Materialer og metoder. (Endelig forstørrelse x 200). Scale bar tilsvarer 10 mikrometer.
Den generasjonen av PGCCs i tykktarm kreft celler er assosiert med resistens mot 5-fluorouracil og oksaliplatin
I forhold til flere normoksisk svulster, svulster med en høyere hypoksisk fraksjon er mer motstandsdyktig mot radioterapi og kjemoterapi [12]. Også begge PGCCs [19] som cscs [5] er blitt assosiert med resistens mot kjemoterapi. Derfor neste vi bestemte oss for å analysere i tykktarmskreft cellekulturer beriket i PGCCs den antiproliferative aktivitet av 5-fluorouracil og oksaliplatin, to brukte narkotika i kjemoterapi av tykktarmskreft. Som vist i figur 8, de cellekulturer som var blitt anriket i PGCCs ved behandling med CoCl
2, viste en økt motstand mot den antiproliferative effekt av begge legemidler.
Både HCT-116 og Caco-2- cellene ble preinkubert i 48 timer i nærvær eller fravær av CoCl
2 for PGCC anrikning og da de ble eksponert i 72 timer for forskjellige doser av 5-fluorouracil (A) eller oksaliplatin (B). Celleproliferering er vist som prosentandel av kontrollceller ueksponerte til kjemoterapeutiske medikamenter. Dataene representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (* p 0,05, sammenlignet med celler uten CoCl
2 behandling)
Diskusjoner
Hypoksi i tumorer har lenge. vært assosiert med økt tumor aggressivitet, dårligere prognose og større motstand mot strålebehandling og kjemoterapi [26]. I denne studien demonstrerte vi at etterligne hypoksi in vitro ved å bruke CoCl
2, som stabiliserer HIF-1α protein ved å hemme nedbrytning, er i stand til å generere PGCCs i tykktarmskreftcellekultur. PGCCs indusert ved behandling med CoCl
2 er stabile og besatt karakteristiske morfologi, men deres generasjon under fysiologiske
in vivo
hypoksiske betingelser gjenstår å bli bestemt. I våre eksperimenter, morfologi av PGCCs indusert ved hypoksi varierte mellom HCT-116 og Caco-2-celler (figur 1). Denne avhengigheten av cellelinje sammenfaller med studiet av Zhang et al [19] hvor PGCCs avledet tumorcellelinjer HEY (eggstokkene) og MDA -MB-231 (bryst) hadde en neuronal lignende morfologi, mens PGGCs avledet fra SKOV3 celler (eggstokk ), viste en avrundet morfologi uten cytoplasmatiske utvidelser eller grener. I vår studie, morfologi av PGCCs avledet fra HCT-116 celler faller sammen med de fra HEY og MDA -MB-231 celler, mens de som genereres i Caco- to var mer lik de som er beskrevet for SKOV3 celler. Det bør understrekes at HEI, MDA -MB- 231 og HCT-116 er markert invasive cellelinjer, er representativ for det epiteliale mesenchymale overgangen (EMT) fremgangsmåte som lider av noen av subpopulasjoner av tumorceller [27]. Derfor, eller resultater tyder på at den genetiske program som kontrollerer EMT i tumorceller også kan være en viktig faktor i dannelsen av PGCCs med høyere kapasitet for infiltrasjon og spredning.
Våre resultater viste også at dannelsen av PGCCs i tykktarmskreftceller er forbundet med endringer i cellesyklusen og påfølgende polyploidi (figurene 2 og 3). Encellede prokaryote og eukaryote celler deler av amitotic prosesser. I komplekse eukaryote celler, selv om mitose hersker, veldokumenterte endringer i den mitotiske cellesyklus finner sted for å oppnå cellevekst og utvikling under stress omstendigheter. Blant disse variasjonene er endoreplication prosess, en variant av normal mitotiske cellesyklus som involverer flere runder med DNA-replikasjon uten deltakelse av det trinn å mitose [28]. Tumorkjempeceller observert ved patologer har tradisjonelt vært ansett som inerte fra det synspunkt av tumor repopulation. Imidlertid, nye data indikerer at disse cellene er i stand til å generere klonogene avkom ved asymmetrisk fordeling og spirende [19]. Dermed har en prosess blitt beskrevet i hvilke celler unnslippe mitotisk katastrofe-indusert celledød ved å bli PGCCs at før de dør, gir opphav til flere celler via atom spirende og asymmetrisk cytokinese. Denne modusen for celledeling i kreft har blitt kalt neosis, og har vært knyttet til opprinnelsen av kreft stamceller [29], [30].
