Abstract
Kjemoterapi motstand observert i pasienter med kolorektal kreft (CRC) kan være relatert til nærværet av kreft stamceller (cscs), men den underliggende mekanisme (er) forblir uklar. Carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer) er nært involvert i tumor tilbakefall, og målretting dem øker chemo-følsomhet. Vi undersøkte om fibroblaster kan øke cscs dermed formidling kjemoterapi motstand. Cscs ble isolert fra enten pasientavledet xenotransplantater eller CRC cellelinjer basert på ekspresjon av CD133. Først cscs ble funnet å være naturlig resistent mot celledød indusert av kjemoterapi. I tillegg, fibroblast-avledet kondisjonert medium (CM) fremmet prosent, clonogenicity og tumorvekst av cscs (dvs. CD133 + og TOP-GFP +) ved behandling med 5-fluoruracil (5-FU) eller oksaliplatin (OXA). Videre undersøkelser viste at exosomes, isolert fra CM, på samme måte tok de ovennevnte virkninger. Hemming av exosome sekresjon sank andelen, clonogenicity og tumorvekst av cscs. Til sammen våre funn tyder på at, i tillegg til målretting cscs, nye terapeutiske strategier blokkerer kafeer utskillelsen selv før kjemoterapi skal utvikles for å oppnå bedre kliniske fordeler i avanserte CRC
Citation. Hu Y, Yan C, Mu L, Huang K, Li X, Tao D, et al. (2015) fibroblast-deriverte Exosomes Bidra til Chemoresistance gjennom Grunning kreftstamceller i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (5): e0125625. doi: 10,1371 /journal.pone.0125625
Academic Redaktør: Christopher Heeschen, spansk National Cancer Centre (CNIO), SPANIA
mottatt: 04.01.2015; Godkjent: 24 mars 2015; Publisert: 04.05.2015
Copyright: © 2015 Hu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (. nr 81172065, 81272660), Program for New Century gode talenter i University (No. NCET-12- 0208), Scientific Research Foundation for den returnerte Overseas Chinese Scholars, State Kunnskapsdepartementet (No. JYBHG201002), de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (Hust, No.01-18-540005), Tongji Hospital midler til returnerte utenlandske forskere og Outstanding Young Scientists (2012yq004) (alle til JCQ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og dens dødelighet har vært jevnt økende de siste tiårene [1]. Chemotherapies har ikke dramatisk forbedret kliniske utfall av pasienter med residiverende eller metastatisk CRC. En bedre forståelse av mekanismene bak motstanden i CRC er avgjørende for utvikling av mer effektive terapeutiske tilnærminger som kan dra nytte CRC pasienter.
CRC er heterogen, manifestere spraglete cellulære morfologi og histopatologiske presentasjoner. Eksperimentelle bevis for eksistensen av kreft stamceller (cscs) i CRC ble nylig vist ved hjelp av primære humane CRC tumorprøver [2, 3]. Cscs er antatt å være naturlig motstandsdyktig mot cellegift. Tilbakevendende CRC ved cellegiftbehandling er ofte beriket for cellene uttrykker CSC markører som ABCB5 [2, 4]. Likevel er de underliggende mekanismene fortsatt blir definert.
carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer) er nært involvert i tumor vedlikehold og progresjon. Kafeer er også rapportert å spille viktige roller i regulering av svulst følsomhet for en rekke chemotherapies, og målretting dem dramatisk reduserer chemoresistance [5, 6]. Her har vi først bekrefte at kjemoterapi fortrinnsvis rettet mot ikke-cscs grunn av cellestyrte motstanden cscs, og videre avdekke at kafeer prime cscs og øke stoffet motstand på kjemoterapi gjennom CAF-avledet exosomes.
Materiale og metode
Etikk erklæringen
Colorectal adenokarsinom vevsprøver ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgiske prosedyrer innenfor Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersoner og alle protokoller ble godkjent av etisk komité Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (IRB ID: 20141106) og ble gjennomført i henhold til prinsippene i Helsinkideklarasjonen .
antistoff og reagenser
monoklonale mus anti-human CD133 og mus anti-human EpCAM antistoffer ble kjøpt fra Miltenyi Biotec (hovedkontor, Tyskland). Anti-α-SMA-antistoff ble oppnådd fra Dako (Danmark). Anti-FAP ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK) og anti-vimentin ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Wnt3a og anti-beta-aktin ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Alexa Fluor 488-konjugert geit anti-mus IgG ble tilveiebragt fra Jackson Immunoresearch (Pennsylvania, USA). GW4869, 5-fluorouracil (5-FU) og oksaliplatin (OXA) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, USA). Matrigel ble oppnådd fra B.D. (Franklin Lakes, NJ).
Cellelinjer og cellekultur
humane tykktarmkreftceller (SW620) og humane fibroblast-celler avledet fra normale tykktarm vev (18Co) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Manassas VA). Kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) ble isolert fra kolorektal kreft prøver. SW620-celler, 18Co-celler og kafeer avledet fra primære tumorer ble dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, California, USA) supplert med 10% FBS (Life Technologies, NY, USA) i en 37 ° C fuktet inkubator med en atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft.
Fremstilling av enkeltcellesuspensjoner fra tumorer
Primære kolorektale svulster eller xenograft tumorer ble hakket helt til størrelsen 1 mm
3, og deretter suspendert i DMEM /F12 media (Invitrogen, California, USA) som inneholder 1,5 mg /ml kollagenase ⅳ (Invitrogen, California, USA), 20 ug /ml hyaluronidase (Sigma, St. Louis, USA), 1% penicillin /streptomycin (Life-teknologi, NY , USA) og 1.25mg /ml amfotericin B (Sigma, St. Louis, USA) ved 37 ° C i 1 time. Etter fordøyelse, ble vevene vasket med PBS og filtrert gjennom en 40μm mesh (BD Falcon, CA, USA). For å eliminere røde blodceller, ble cellene inkubert i røde blodceller lyseringsbuffer (eBioscience, California, USA) på is i 10 minutter og vasket to ganger med PBS. Cellene ble deretter resuspendert i PBS for eksperimenter.
Isolering av kafeer og etablering av CRC xenografttumorer (XhCRC)
For å isolere kafeer, enkeltceller hentet fra en kvinnelig pasient med Duke B kolorektal adenokarsinom ble dyrket i DMEM med 10% FBS. Etter å ha inkubert i 3 timer, ble de ikke-adherente celler ble vasket bort med PBS, og etterlot adherente celler som hovedsakelig besto av makrofager, epitelceller, og fibroblaster. Etter dyrket i flere dager, makrofager og epitelceller døde av, forlater celler som var fibroblast-lignende og konsekvent α-SMA, vimentin og FAP positive. Primære fibroblast kulturer ble brukt til eksperimenter opp til passasjen 10. For å etablere CRC xenograft tumor modell ble enkelt primære kolorektal kreft celler avledet fra en kvinnelig pasient med Duke C kolorektal adenokarsinom implantert i bilaterale ryggen av kvinnelige NOD /SCID-mus.
fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og rensing av CD133
+/- CRC celler
FACS ble utført i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av en FACS Aria II Cell Sortering (BD, biovitenskap, CA , USA). For å skille CD133
+ og CD133
– /lo celler i SW620 celler, celler ble merket med PE /APC-konjugert mus anti-human CD133 antistoffer. Vanligvis bare toppen (CD133
+) og bunn (CD133
– /lo) 10-20% celler ble renset ut. For å skille CD133
+ og CD133
– /lo celler i xenotransplantater, ble XhCRC tumorer dissosiert til enkeltceller som beskrevet ovenfor, og deretter farget med APC-konjugert mus-anti-human CD133 og PE-konjugert mus-anti-humant EpCAM antistoffer, og EpCAM
+ CD133
+ og EpCAM
+ CD133
– /lo CRC cellene ble renset ut
Celledød analyse
Cell død. cscs og ikke-cscs ble vurdert ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). I korthet ble cellene sådd ut i fullstendig medium ved 3000 celler /brønn i 96-brønners plater. Etter 12 timer etter såing, ble cellene behandlet med enten 5-FU (1 uM) eller OXA (1 uM). Og 72 timer senere ble 10 ul CCK-8-løsning ble tilsatt til hver brønn. Deretter Platene ble inkubert ved 37 ° C i 1 time og cellelevedyktigheten ble bestemt ved scanning med mircoplate avleser ved 450 nm.
Kondisjonert medium fremstilling
fibroblaster ble platet ut og dyrket i DMEM /F12 media med 10% FBS i 24 timer, og deretter vasket tre ganger med PBS og til slutt dyrket i 3 ml serumfritt DMEM /F12 media i 2 timer. Kondisjonert medium ble oppsamlet og filtrert gjennom et 0,22 um filter (Millipore Merck, Massachusetts, USA) for å fjerne cellerester.
Isolering og karakterisering av exosomes utgitt av fibroblaster
Exosomes ble isolert fra dyrkede fibroblaster ved hjelp av Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen, California, USA). I korte trekk, ble 0,5 ml av total exosome isolasjon reagens tilsatt til hver 1 ml av filtrerte kondisjonert medium og blandet godt ved å snu. Etter å ha inkubert over natten ved 4 ° C ble blandingen sentrifugert ved 12.000 x g i 70 min ved 4 ° C og alle Supernatanten ble fjernet ved aspirasjon [7]. Exosome pellets ble resuspendert med en praktisk volum av DMEM /F12 medium. En annen exosome isolasjonsmetoden utføres ved seriesentrifugering som beskrevet tidligere [8]. Cellulær supernatant ble først sentrifugert ved 2000 x g i 30 min, 10 000 x g i 40 minutter for å utarme døde celler og celleavfall. Og deretter, exosomes og exosome-utarmet løselige fraksjoner ble separert ved ultrasentrifugering ved 100.000 x g 4 ° C i 70 min.
Morfologien og partikkelstørrelsen til exosomes ble karakterisert via et transmisjonselektronmikroskopi (FEI Tecnai 20, Philips) opererer på 160kV. Exosome proteiner ble ekstrahert fra exosomes ved hjelp av SDS-lyseringsbuffer (250 nm Tris-HCL, pH 7,4, 2,5% SDS). Proteiner ble lastet på 10% SDS-polyakrylamidgeler, elektroforetisk overført til nitrocellulosemembraner. Muse anti-humane CD81 antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, klone: 1.3.3.22, 1: 100) ble brukt for immunblotting. Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av Super Signal West Femto maksimal følsomhet substrat (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Hemming av exosome utgivelsen
For ytterligere å validere effekten av exosomes, exosome frigi ble blokkert av dyrkning med 10 uM GW4869, en spesifikk inhibitor for nøytral sfingomyelinase 2 (nSMase2) [9]. Etter inkubering i 24 timer ble mediet som inneholdt GW4869 kassert, og cellene ble vasket med PBS i 3 ganger. Så frisk DMEM /F12 medium ble tilsatt, og kondisjonert medium ble høstet som beskrevet ovenfor.
Sphere-formasjon analysen
Grunnleggende prosedyrer for kule-formasjon analysen ble tidligere beskrevet [10]. Celler ble resuspendert i standard sfære dannende medium [DMEM /F12 (Invitrogen, California, USA) supplementert med 1 x B27 serum erstatning (Invitrogen, California, USA), 20 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor, og 20 ng /ml basisk fibroblastvekstfaktor faktor (Sigma, St. Louis, USA). CRC celler ble sådd på 300 ~ 500 celler /brønn i 24-brønners ultra-lave festeplater (Corning, Massachusetts, USA) med eller uten administrasjon av 5-Fu (1 um) eller OXA (1 uM). For serie sfære-formasjons analyser, ble de første generasjons kulene høstet, disaggregert med 0,025% trypsin /EDTA, filtrert gjennom 40 pm sikt og re-belagt som ovenfor. Denne prosessen ble gjentatt inntil 3 generasjoner. Når behandlet med kjemoterapi, eller /og CM /exosomes, kjemoterapi eller /og CM (200 ul) /exosomes (lik 200 ul CM) ble tilsatt hver 2 dager. Etter fem ~ 14days, kuler med diameter ≥ 50 pm ble scoret og vist som clonogenicity (%) i tallene.
Animal studie
Animal protokoller ble godkjent av Universitetet komité for bruk og vedlikehold av dyr (UCUCA) ved Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology. I alle eksperimenter ble levedyktighet av celler bekreftes ved trypan blå eksklusjon test og cellene ble resuspendert i 100 ul PBS /Matrigel-blanding (1: 1 volum), etterfulgt av injeksjon inn i det subkutane vevet av venstre og høyre tilbake område ved anvendelse av en 27-gauge nål. SW620-celler ble subkutant implantert i 4 uker gamle hunn BALB /c-nu-mus, og XhCRC cellene ble implantert i fire-ukers gamle hunn NOD /SCID-mus. Fire til fem mus ble inokulert per gruppe. CM (200μ) eller exosomes (tilsvarende 200 ul CM) ble så injisert subkutant hver 2 dager. Samtidig alle musene ble injisert intraperitonealt med et kjemoterapeutisk middel, 5-FU (100 mg /kg kroppsvekt) eller OXA (10 mg /kg kroppsvekt) en gang i uken. Svulster ble overvåket, og tumorvolumene ble undersøkt hver tredje dag. Etter ofret, svulstene ble fjernet fra mus og veid for å vurdere tumorutvikling. For å begrense utvannings analyser, 100.000, 10.000, 1000, og 100 renset CD133
+ og CD133
– /lo CRC celler ble implantert inimmunodeficient mus. Tumor-initiere frekvens og statistisk signifikans ble evaluert med Extreme begrensende fortynning Analysis (ELDA) «limdil «-funksjonen (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html).
immunfluorescens mikros
immunfluorescens mikroskopi ble tidligere beskrevet [11] .CAFs eller XhCRC celler ble dyrket på 0,17 mm Dekk eller glassbunn petriskåler i monolag over natten. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter ved romtemperatur og etterfulgt av blokkering i 5% (w /v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS-buffer i 1 time. Primære antistoffer ble fortynnet i 1:50 i 5% BSA. Etter å ha inkubert over natten ved 4 ° C, ble cellene deretter skylt tre ganger med PBS og etterfulgt av inkubasjon med Alexa 488 Fluor-konjugerte sekundære antistoffer (fortynnet 1:50 i 5% BSA) i 2 timer ved romtemperatur. Til slutt, DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol, Sigma) ble anvendt for å visualisere cellekjerner i 10 minutter ved romtemperatur. Lysbilder ble undersøkt under et konfokal mikroskop (FV1000, Olympus).
Dil-merket exosomes overføre
Renset exosomes avledet fra 18Co cellene ble merket med lipofile fluoescentcarbocyanine fargestoffer DII i henhold til produsentens protokoll (i Santa Cruz Biotecnology, CA, USA) .18Co-exosomes ble suspendert i 100 ul PBS og inkubert med 1 ul Dil i 15 minutter ved 37 ° C, vasket to ganger for å fjerne overskudd av fargestoff, og inkubert med SW620-celler ved 37 ° C over natten.
lentiviral reporter analyser
TCF /LSF reporter kjører uttrykk for GFP (TOP-GFP) lentivirus ble kjøpt fra SBO Medisinsk bioteknologi Company, Shanghai, Kina. SW620 celler ble infisert med TOP-GFP lentivirus på MOI = 25 til 72 timer. For sfære formasjons analyser, TOP-GFP
+ og TOP-GFP
– fraksjonene ble sortert ut av FACS og belagt i ultra-lave festeplater som beskrevet ovenfor. Å evaluert effekten av CM /exosomes på Wnt aktivitet CD133
+ fraksjoner, 50000 CD133
+ SW620 celler ble infisert med TOP-GFP lentivirus og belagt i 6-brønners plater, etterfulgt av CM /exosomes behandling eller pluss kjemoterapi. Etter 3 dager inkubasjon, ble uttrykk for TOP-GFP analysert ved flowcytometri.
Statistisk analyse
Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Generelt uparet tosidige Student
t
-test eller to-veis ANOVA testen ble utført på IBM SPSS statistikk 18 å sammenligne forskjeller mellom bruk av ulike behandlingsgruppene. En
P
-verdi 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
CD133 identifiserer cscs i en CRC cellelinje og xenograft avledet fra primære kolorektal kreft svulst
cscs er en sjelden befolkning innenfor endetarmskreft som utviser selvfornyende og tumorigent kapasitet [12]. Anvendelse av CD133, en overflate trakter, for å berike cscs er avgjørende for å skille tumorigene og ikke-tumorigene celler [2]. Vi først etablerte xenografttumorer (XhCRC) stammer fra en kvinnelig pasient med Duke C kolorektal adenokarsinom i kvinnelig NOD /SCID-mus. Når xenografttumorer vokste opp, ble svulstene behandlet i enkeltcellesuspensjoner, og vi deretter sortert ut to celle populasjoner (dvs. EpCAM
+ CD133
+ og EpCAM
+ CD133
– /lo) basert på uttrykk for epitel markør (dvs. EpCAM) og den antatte CSC markør (dvs. CD133) (fig 1A) sikret renhet EpCAM
+ CD133
+ og EpCAM
+ CD133
– /lo celler var både 96% (fig 1B). For å bekrefte at EpCAM
+ CD133
+ celler berike cscs, gjennomførte vi begrensende fortynning analyser. Som forventet, EpCAM
+ CD133
+ celler viste høyere tumor-genererende kapasitet (
P
0,001) (figur 1C). Tilsvarende renset CD133
+ SW620 celler, en mye brukt CRC cellelinje, også initiert mer (
P
0,001) (figur 1C). I samsvar med LDAs, serielle sfære-formasjons analyser viste at rensede EpCAM
+ CD133
+ celler var i stand til å bli passert i minst tre generasjoner og viste en økt sfære som forplanter seg kapasitet, mens EpCAM
+ CD133
– /lo celler dannes mye mindre kuler i en
o generasjon (
P
0,001) og EpCAM
+ CD133
– /lo celle-initiert kuler avbrutt av 2
o generasjon (fig 1D og 1E). I tillegg renset CD133
+ SW620 celler, ble også vist en gradvis økt sfære fremmende kapasitet sammenlignet med CD133
– /lo SW620cells (
P
0,001) (fig 1F og 1G ). Disse data indikerte at CD133
+ CRC celler besatt langsiktig clonogenicity i både xenografttumorer og SW620 celler, noe som tyder på at CD133
+ CRC celler i vår eksperimentelle systemet, kan berike for mulige cscs. For enkelhets skyld, herfra og utover, henviser vi til EpCAM
+ CD133
+ eller CD133
+ og EpCAM
+ CD133
– /lo eller CD133
– /lo celler som cscs og henholdsvis ikke-cscs, etter
(A) Skjematisk av CD133
+ og CD133
-. /lo kreftceller sortering fra dissosiert kolorektal xenograft tumor ved FACS. (B) Et representativt eksempel på post-sortering analyse av den sorterte CD133
+ og CD133
-. /Lo XhCRC celler (C) Tumor-initiere hyppigheten av CD133
+ og CD133
– /lo CRC celler i immunodeficient mus (DG) serie~~POS=TRUNC sfære formasjons analyser for renset CD133
+ og CD133
– /loCRC celler (dvs. XhCRC og SW620). Spheres ble nummerert (D, F) og representative bilder vises (E, G) .Scale barer, 100 um ***
P
0,001.
cscs utstillings celle-autonome chemoresistance
Som cscs har blitt rapportert å være relativt motstandsdyktig mot kjemoterapi [13-16], vi forhørt responsen cscs og ikke-cscs med konvensjonelle kjemoterapeutiske midler (5-FU eller oksa) av CCK-8 aktivitetsanalyser. Faktisk, i både XhCRC og SW620 celler, kjemoterapi-indusert celledød ble betydelig redusert i cscs i forhold til ikke-cscs (figur 2A,
P
0,01 i 5-Fu gruppen,
P
0,001 i OXA gruppe, 2B,
P
0,001), noe som indikerer at cscs kan være naturlig motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske midler. For å bestemme den endelige cellulære fenotype ansvarlig for denne forskjellen, behandlet vi bulk XhCRC og SW620 celler med 5-Fu eller OXA i 3 dager, og deretter oppdaget andelen av celler som uttrykker CD133 ved flowcytometri. Som forventet, CD133
+ -celler øket 0,5-1 ganger etter kjemoterapeutisk behandling (figur 1D og 1E), og dessuten den gjenværende CRC-celler (dvs. inneholdende mer CD133
+ -celler) viste også en økt Sphere forming kapasitet (fig 2E,
P
0,01, 2F,
P
0,001), noe som tyder på at kjemoterapi, ja, beriker cscs i tykk- og endetarmskreft gjennom CSC-celle-autonome chemoresistance.
(A, B) Celledød analyse av cscs og ikke-cscs fra XhCRC eller SW620-celler ble bestemt ved CCK-8 aktivitetsanalyse ved kjemoterapeutisk behandling (5-FU eller OXA). **
P
0.01, ***
P
0,001. (C, D) Anrikning av cscs i bulk celler fra XhCRC (C) og SW620-celler (D) ble bestemt ved FACS-analyse basert på CD133 uttrykk ved kjemoterapi. (E, F) Sphere dannende kapasitet av bulk celler (XhCRC eller SW620 celler) forbehandlet med kjemoterapi eller DMSO (Ctrl). **
P
0.01, ***
P
0,001.
fibroblast-deriverte kondisjonert medium primet SW620 cscs og dermed bidratt til resistens
Nyere studier har vist at svulsten mikromiljøet formidler stoffet motstand [17], og carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer), som en viktig komponent i mikromiljøet, er dypt involvert i kjemoterapeutisk resistens [18, 19]. Faktisk, etter cellegiftbehandling, kafeer kan være påsatt og holdt cscs bassenget og dermed bidra til legemiddelresistens [20]. Men en fersk studie vist at kafeer, selv uten aktivering av kjemoterapeutika, fremme svulst stemness i tykk- og endetarmskreft [21], noe som tyder på at kafeer kan prime CRC celler til å øke svulst stemness før kjemoterapi, og som kan dermed bidra til terapeutisk motstand.
for å avgjøre om fibroblaster prime cscs dermed bidra til resistens, høstes vi kondisjonert medium fra dyrket 18Co (18Co-CM) uten bruk av kjemoterapeutika. Vi deretter utført sfære formasjons analyser med 18Co-CM i SW620 cscs ved administrasjon av 5-Fu eller OXA. Expectedly, 18Co-CM behandlet SW620 cscs generert flere og større områder enn SW620 cscs kontroll medium (
P
0,001) (figur 3A). For ytterligere å bekrefte effektene av 18Co-CM in vivo, vi implantert 50000 cscs subkutant i bilaterale ryggen av BALB /c-nu-mus (n = 5), som ble injisert intraperitonealt med kjemoterapeutiske midler hver uke, og fikk også injeksjon av 18Co- CM eller kontroll medium hver 2. dag. I samsvar med
in vitro
resultater, 18Co-CM behandlede mus manifestert høyere svulst forekomst, raskere tumorvekst og større svulster, som illustrerer at 18Co-CM er i stand til å beskytte xenografttumorer fra kjemoterapi (Fig 3B og 3C). disse funnene tyder på at fibroblast-deriverte kondisjonert medium uten kjemoterapi behandling kan prime cscs og dermed fremme chemoresistance i CRC.
(A) Sphere dannende kapasitet på SW620 cscs behandlet med 18Co-avledet CM under kjemoterapi (5-Fu eller OXA). Representative mikroskopiske bilder vises. Skala barer, 100 pm. (B, C) 18Co-avledet kondisjonert medium påvirket tumorvekst av SW620 cscs i Balb /c-nu-mus behandlet med OXA. Tumorvekstkurver er vist i C, som er vist i D er tumorvekter og bilder på slutten av eksperimentene. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD; *
P
0,1; **
P
0,05; ***
P
0,001.
CAF-avledet kondisjonert medium primet XhCRC cscs og fremmet chemoresistance
For å undersøke om kafeer prime cscs isolert fra pasient-avledet xenograft (XhCRC) og dermed bidra til resistens. Vi først separert og dyrkede primære carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer) fra en kvinnelig pasient med Duke B kolorektal adenokarsinom og farging bekreftet at disse cellene var positive for fibroblast markører som vimentin [22], α-SMA [23] og FAP [ ,,,0],24] og negative for epitelcelledifferensiering markør EpCAM [25] (figur 4A). Vi høstet kondisjonert medium fra dyrkede kafeer (CAF-CM) og utførte sfære-dannelse analyser med CAF-CM eller kontrollere medium i XhCRC cscs. I samsvar med funn i SW620 cscs, CAF-CM også fremmet sfære-genererende kapasitet XhCRC cscs og beskyttet dem fra kjemoterapi (5-Fu eller OXA) (fig 4C,
P
0,001 i 5-Fu gruppe
P
0,01 i OXA gruppe). Som tidligere rapportert, kan kjemoterapi ikke bare indusere kreft celle apoptose, men også endre svulsten mikromiljøet i solide svulster [20, 26]. For å vurdere om cellegift gjør noen forskjeller i kreftfremkallende effekter av kafeer, behandlet vi kafeer med 5-Fu /OXA eller DMSO i 12 timer, og etter skylling kjemoterapi, ble kondisjonert medium høstet som beskrevet i
Materialer og metoder
. Men våre data viste at det var ingen signifikant forskjell mellom kjemoterapibehandlet kafeer og DMSO-behandlet kafeer, alt CAF-CMS kan forbedre sfære dannende kapasitet på XhCRC cscs (Fig 4D,
P
0,001 DMSO -cm /5-Fu vs. kontroll,
P
0,01 OXA-CM vs kontroll), noe som tyder på at kafeer allerede prime cscs gjennom parakrint måte før kjemoterapi. For ytterligere å utforske effekten av CAF-CM på tumorvekst av XhCRC cscs, vi subkutant injisert 50000 XhCRC cscs inngå bilaterale ryggen av kvinnelige NOD /SCID mus (n = 4), som samtidig fikk OXA og CAF-CM. I samsvar med
in vitro
funn, CAF-CM-behandlede XhCRC cscs generert raskere voksende og større svulster sammenlignet med kontrollmedium (Fig 4E og 4F). Tilsvarende ved behandling med 5-Fu, CAF-CM-behandlede XhCRC cscs initiert flere svulster sammenlignet med kontrollmedium (Fig 4G).
(A) kafeer avledet fra pasientprøve ble validert av positiv farging for CAF markører (α-SMA, vimentin og FAP) og negativ farging for en epitelial markør (EpCAM). Skala barer, 30 pm. (B) XhCRC cscs ble validert av positiv farging for epitel markør (EpCAM) og CSC markør (CD133), Scale barer, 10 um. (C) Sphere dannende kapasitet av XhCRC cscs i kafeer-avledede kondisjonerte medier (f.eks 5-FU, OXA, DMSO-behandlede kafeer). (D) Sphere dannende kapasitet på XhCRC cscs behandlet med CAF-avledede CM under kjemoterapi (5-FU eller OXA). Representative mikroskopiske bilder vises. Skala barer, 50 pm. (E, F) CAF-avledet CM påvirkes på tumorvekst av XhCRC cscs i hunn NOD /SCID-mus behandlet med OXA. Tumorvekstkurver er vist i E, som er vist i f er tumorvekter og bilder på slutten av eksperimentene. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD; *
P
0,1; **
P
0,05. (G) CAF-avledet CM påvirket på tumorvekst av XhCRC cscs transplantert i kvinnelig NOD /SCID-mus ved behandling med 5-Fu.
Sammen er disse resultatene viser tydelig at kafeer prime cscs og dermed fremme chemoresistance ved kolorektalkreft via sekresjon løselig faktor (er).
Fibroblaster-avledet exosomes prime cscs å være mer chemoresistance
Nyere bevis tyder på at exosomes, løselige faktorer som skilles av en rekke celler , har vært implisert i metastaser og medikamentresistens [8, 27, 28]. Vi antok at exosomes kan også bidra til resistens i vårt eksperimentelle system. Derfor må vi først renset exosomes fra 18Co-CM og CAF-CM som beskrevet i
Materialer og metoder
, og deretter bekreftet sin strukturell karakter under fase-kontrast elektronmikroskopi (Fig 5A) og ved immunoblotting av exosome markør protein CD81 (fig 5B). For å undersøke om fibroblast-utskilt exosomes kan overføre til CRC celler, merket vi exosomes med Dil, et lipofilt fluorescentcarbocyanine fargestoff. Vi observerte at Dil-merket exosomes avledet fra 18Co celler ble tatt opp av SW620 celler etter 12 timer co-inkubasjon (figur 5C). Vi deretter behandlet cscs med rensede exosomes stedet for CM, og funnet ut at både SW620 og XhCRC cscs behandlet med exosomes generert flere kuler (
P
0,01) (figur 5D og 5E), noe som tyder på at exosomes, som er avledet fra fibroblaster, kan prime cscs å bli mer chemoresistance. For ytterligere å bekrefte at fibroblast-utskilt exosomes fremfor andre oppløselige faktorer tar de ovennevnte virkninger, vedtok vi standard differensial ultrasentrifugering, i stedet for Total Exosome Isolation Kit, for å isolere exosomes. I likhet med kit-renset exosomes, CM-pellet-behandlet SW620 cscs dannet flere kuler sammenlignet med kontroll pellets (
P
0,001 i 5-Fu gruppen,
P
0,01 i OXA gruppe), og exosome fattige supernatant fra 18Co-CM tok ikke denne effekten (
NS kontroll pellet vs supernatant
) (figur 5F). For ytterligere å bekrefte om fibroblast-avledet exosomes mekle i legemiddelresistens, behandlet vi fibroblaster (18Co og kafeer) med GW4869, en bestemt nøytral sfingomyelinase (nSMase) hemmer som blokkerer exosomes slipp, og deretter fått CM (dvs. exosome-utarmet CM) . I samsvar med tidligere funn, exosome fattig CM bemerkelsesverdig redusert chemoresistance av cscs (Fig 5G,
P
0,001, 5H, i 5-Fu gruppen,
P
0,001 i OXA gruppe). I tillegg
in vivo
Forsøkene viste også at XhCRC cscs, mens behandlet med CAF-avledet exosomes, genereres raskere voksende (Fig 5I og 5K) og større svulster (
P
0,05 ) (fig 5J og 5L) under kjemoterapi (5-Fu eller OXA). Disse dataene viste klart at fibroblaster-avledet exosomes primet cscs å være mer resistens.
(A) Transmisjonselektron mikroskopisk bilde av exosomes avledet fra 18Co celler og kafeer. Skala barer, 100nm. (B) Western blotting av CD81 i exosomes. (C) Representant mikroskopi av SW620 celler eksponert for Dil-merket exosomes for 12h. (D, E) Sphere dannende kapasitet av SW620 eller XhCRC cscs behandlet med 18Co /CAF-avledede exosomes under kjemoterapi (5-FU eller OXA). (F) Sphere dannende kapasitet av SW620 cscs behandlet med ultra-sentrifugerings-renset 18Co-avledede exosomes under kjemoterapi (5-FU eller OXA). (G, H) Fibroblaster ble behandlet med 10 mM GW4869 (oppløsning i DMSO) i 24 timer. CMS avledet fra GW4869 /DMSO-forbehandlet fibroblaster ble lagt til cscs. (I-L) CAF-avledet exosomes berørt på tumorvekst av XhCRC cscs i kvinnelig NOD /SCID mus behandlet med 5-Fu eller OXA. Tumorvekstkurver er vist i I (5-FU) og K (OXA), og tumorvektene og bilder på slutten av eksperimentene er vist i L (5-FU) og J (OXA). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD; *
P
0,1; **
P
0,05.
Exosomes prime cscs gjennom Wnt signalveien
Det er tidligere vist at Wnt signal aktivitet er en funksjonell markør for kreftstamceller og er avgjørende viktig for å opprettholde stemness i tykktarm kreft. På en lignende måte som den normale tarm stamceller, er Wnt aktivitet ikke bare en celle-iboende egenskap som kan brukes til å definere tykktarmskreft stamcelle (CSC) befolkningen, men det er også regulert av den ytre mikromiljøet [29-32] . Wnt aktivitet er forbinder med T-celle faktor /lymfoid enhancer faktor (TCF /LSF) familie av transkripsjonsfaktorer som aktive spesifikke Wnt målgener [33, 34].
For å avhøre om exosomes prime cscs via Wnt signal
