Abstract
Cell morfologi bestemmer celle atferd, signaltransduksjon, protein-protein interaksjon, og respons på ytre stimuli. I kreft, disse funksjonene dypt bidra til resistensmekanismer til radio- og kjemoterapi. Med hensyn til dette aspekt av denne undersøkelsen sammenlignet genomet bred genekspresjon i eksponentielt voksende cellelinjer fra forskjellige tumortyper, lungecarcinom og karsinomer, under mer fysiologisk tre-dimensjonale (3D) i forhold til monolaget celledyrkningsbetingelser. Hele genomet cDNA microarray analyse ble utført ved hjelp av Affymetrix HG U133 Plus 2.0 genet chip. Betydning analyse av mikroarray (SAM) og t-test-analyse viste signifikante endringer i genekspresjonsprofiler av 3D forhold til 2D-celledyrkningsbetingelser. Disse endringene påvirket den ekstracellulære matrise og var hovedsakelig knyttet til biologiske prosesser som vev utvikling, celle adhesjon, immunsystem og forsvar svar i motsetning til vilkår knyttet til DNA-reparasjon, noe som manglet vesentlige endringer. Utvalgte gener ble verifisert ved semi-kvantitativ RT-PCR og Western blotting. I tillegg, viser vi at 3D vekst medierer en signifikant økning i tumorcelle radio- og chemoresistance forhold til 2D. Resultatene viser signifikante genekspresjon forskjeller mellom 3D- og 2D-cellekultursystemer og indikerer at cellulær respons til ytre stress slik som ioniserende stråling og kjemoterapeutiske midler er i det vesentlige påvirkes ved differensiell ekspresjon av gener som er involvert i reguleringen av integrin signalering, celleform og celle-celle- kontakt
Citation. Zschenker O, Streichert T, Hehlgans S, Cordes N (2012) Genome-Wide Gene Expression Analysis i kreftceller avslører 3D Vekst å påvirke ECM og prosesser knyttet til celle adhesjon men ikke DNA Repair. PLoS ONE 7 (4): e34279. doi: 10,1371 /journal.pone.0034279
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 21 juni 2010; Godkjent: 27 februar 2012; Publisert: 11 april 2012
Copyright: © 2012 Zschenker et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen og forfatterne var delvis støttet av en bevilgning fra Federal Kunnskapsdepartementet, Tyskland (BMBF Contract 03ZIK041 til NC) og ved EFRE (European Regional Development Fund) Europäische Fonds für regionale Entwicklung, Europa fördert Sachsen (100.066.308). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikromiljø er en grunnleggende regulator av celle atferd [1], [2], [3]. En stor mengde arbeid har vist hvordan interaksjoner av celler med den ekstracellulære matriks (ECM), som en av de viktigste komponentene i mikromiljøet, bidra til regulering av viktige cellefunksjoner slik som celleform /arkitektur, overlevelse, proliferasjon og differensiering [2], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Celle-interaksjoner ECM også kontrollere genekspresjon og kromatin organisasjon i en vekst og ECM-avhengig måte [10], [11]. Nyere nye funn viser at særlig de vekstbetingelser spiller en vesentlig rolle for den cellulære respons på ytre stimuli. Dette ble tydelig i tre-dimensjonal (3D) ex vivo-cellekulturer dyrket i ECM og i sfæroide modeller [4], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17]. Viktigere, disse 3D-cellekultur modeller bedre etterligner et fysiologisk mikromiljøet enn konvensjonelle ikke-belagte eller ECM-forbelagt cellekultur plast [15], [18].
I tillegg til bruken av 3D-cellekultur-modeller i vevsteknologi [ ,,,0],19], [20], [21] og studier på embryoutvikling og fysiologi [18], 3D-cellekulturer i økende grad anvendes i kreftforskning [7], [8], [9], [12], [16], [22]. I de aller fleste tilfeller, tumorcellelinjer av forskjellig opprinnelse viser en forbedret motstand mot radio- og kjemoterapi i et 3D-miljø indikativ av økt clonogenicity og redusert apoptose [12], [13], [14], [16], [ ,,,0],17], [23], [24], [25], [26], [27]. Bortsett fra en betydelig innvirkning på integrin-mediert celle-ECM interaksjoner [28], et komplekst samspill av biokjemiske signalveier og biofysiske /mechanotransduction relaterte faktorer er tenkt å gi denne forbedrede tumorcelle motstand som underliggende mekanismene er fortsatt skal fastsettes både på gen og på proteinnivå [2].
Med hensyn til genekspresjon, store anstrengelser har blitt gjennomført for å identifisere spesifikke diagnostiske, prognostiske og terapi-overvåking genutrykksmønster i biopsier av ulike menneskelige maligniteter [2], [5], [6], [29], [30], [31]. Intriguingly, noen av disse studiene viser sterk overlapping mellom in vivo og 3D, men ikke 2D cellekultur datasett, som til slutt muliggjort identifisering av genet signaturer prediktive for total overlevelse av kreftpasienter. Det gjenstår å avklares om endringer i genuttrykk i henhold 3D versus 2D vekstvilkår kan forklare eller gi hint på visse stress eller DNA reparasjon pathways involvert i den forbedrede radio- eller chemoresistance av 3D voksen tumorceller. Hvis ja, målrettet terapeutiske tilnærminger mot nøkkel tumorpromotere kunne optimaliseres.
For å ta opp dette spørsmålet, denne studien sammenlignet basal genuttrykk av to menneskelige kreftcellelinjer av ulik opprinnelse og med varierende genetisk bakgrunn i en 3D ECM stillas eller under konvensjonelle 2D monolags forhold med hensyn til deres oppførsel ved stråling og kjemoterapi.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP, dyrkningsbetingelser og celledoblingstider
lungetumorcelle linje A549 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, USA). Den plateepitelkarsinom cellelinje UT-SCC15 var en slags gave fra R. Grenman (Åbo universitet Central Hospital, Finland). For konvensjonell 2D cellekultur, ble cellene dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; PAA, Cölbe, Tyskland) inneholdende Glutamax-I (L-alanyl-L-glutamin) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS; PAA) og en % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA; PAA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 7% CO
2. For 3D-cellekultur, ble cellene sådd ut i en blanding av 0,5 mg /ml laminin rike ekstracellulære matriks (Matrigel, BD, Heidelberg, Tyskland) og komplett DMEM-medium på et lag av agarose (Sigma, Taufkirchen, Tyskland) i en 24- vel cellekulturskål (BD) som er publisert [12], [13], [14], [16].
Fordoblingstid av celler som vokser som monolag i cellekulturflasker ble telt i henhold til standard protokoller. I korte trekk ble enkeltceller sådd ut i 2D eller 3D og trypsinert og overført til 10 ml medium inneholdende FCS. Etter forsiktig blanding i mediet, ble 10 ul av celleløsningen pipettert på et Neubauer tellekammer ved anvendelse av en passende fortynning. Celler i 4 ruter ble tellet mikroskopisk (Zeiss, Jena, Tyskland), og antallet celler ble beregnet som tidligere beskrevet [32]. For celler som vokser i en 3D Matrigel miljø, ble cellene isolert som tidligere beskrevet [23], [33] med en Neubauer tellekammer.
3D og 2D kolonidannende analyser
klonogene overlevelse etter 3D betingelser ble testet som tidligere er publisert [15], [16], [17], [34]. I korte trekk ble enkeltceller sådd ut i 0,5 mg /ml Matrigel supplert med DMEM /10% FCS /1% NEAA. Etter 24 timer ble enkeltceller bestrålt (0-6 Gy) eller behandlet med økende Cisplatin konsentrasjoner (0,1, 1, 5, 10 uM, i 24 timer; Neocorp). Cisplatin ble fjernet ved 3- (2D) eller 15 ganger (3D) vasking med DMEM /10% FCS /1% NEAA. Deretter ble cellene tillatt å vokse til kolonier /cellegrupper. På 8 (A549) eller 11 dager (UT-SCC15) etter plating, dyrket kolonier /cellegrupper ( 50 celler) ble mikroskopisk telles. 2D celleoverlevelse ble gjennomført som publiseres [23]. Etter 8 dager (A549) eller 11 dager (UT-SCC15), ble cellene farget med Coomassie-blått (Merck, Darmstadt, Tyskland) og kolonier (mer enn 50 celler) ble tellet. Plating effektiviteten ble beregnet som følger: antall kolonier dannet /antall celler belagt. Overlevende fraksjoner ble beregnet som følger: antall kolonier dannet /(antall celler plettert (bestrålt /cisplatin) × plating effektivitet (ubestrålt /ubehandlet)). Hvert punkt på overlevelseskurver representerer den midlere overlevende fraksjonen fra tre uavhengige eksperimenter.
Bestråling av cellekulturer
Bestråling ble levert ved romtemperatur ved anvendelse av enkeltdoser (0-6 Gy) på 200 kV X -rays (YXLON Y.TU 320; YXLON, København, Danmark) filtrert med 0,5 mm kobber. Dosen-rate var ca 1,3 Gy /min ved 20 mA. Den absorberte dosen ble evaluert med en tosidig dosimeter (PTW, Freiburg, Tyskland).
cDNA microarray
Gene uttrykk profil ble målt med RNA ekstrahert fra 5 × 10
6 celler dyrket i 3D eller 2D. Total RNA ble fremstilt ved NucleoSpin RNA II Kit i henhold til produsentens instruksjoner (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland). Prosedyrer for cDNA-syntese, merking og hybridisering ble utført i henhold til produsentens protokoll (Affymetrix) og som er publisert [35]. Alle forsøkene ble utført ved bruk av Affymetrix humane genome genet chip HG U133 Plus 2.0. Førstetråds-cDNA-syntese med 90 ng av total RNA syntese av biotin-merket cRNA og rydde opp ble utført ved anvendelse av 3′-IVT Express Kit (Affymetrix). For hybridisering, ble 15 ug av fragmentert cRNA inkubert med brikken i 200 ul hybridisering oppløsning i Hybridisering Ovn 640 (Affymetrix) ved 45 ° C i 16 timer. GeneChips ble deretter vasket og farget med Affymetrix lufthåndtering Station 450 i henhold til Genechip Expression Vask, Stain og Scan Manuell bruk av Genechip Hybridisering, Vask og Stain Kit (Affymetrix). Mikromatriser ble skannet med Affymetrix Genechip Scanner 7G, og signalene ble behandlet ved hjelp GCOS (versjon 1.4, Affymetrix). Å sammenligne prøver og eksperimenter RMA algoritmen ble brukt (Expression Console, v.1.1), ble ytterligere analyse utført med TIGR MeV (v.4.6.2). Tre replikater ble anvendt for microarray analyse og statistikk. For SAM analyse ble en signal logg forhold på 0,8 (-0,8) anvendt som en terskel som er lik et gangers endring på 1,6 og -1,6, respektivt. Genuttrykk data er tilgjengelig på GEO tilgangsnummer GSE17347. For genet liste, funksjonelle berikelse vi brukte ToppGeneSuite [36]. Trasé og andre funksjonelle grupperinger av gener ble evaluert for differensialregulering ved hjelp av visualiseringsverktøy GenMAPP (Ver. 2.1) som tidligere beskrevet [37].
SAM krever bruk av en «delta» verdi. Den «delta» verdi angir terskelen av antallet av falske positive gener i den validerte datasett. For å identifisere en liste over potensielt betydelige gener, beregnet vi den falske funnraten (FDR). Den estimerte FDR (median antall falskt betydelige gener) for hver gitt «delta» ( «delta» verdi) ble bestemt i henhold til Tusher et al. [38].
Semi-kvantitativ RT-PCR
For å validere microarray data ved hjelp av PCR, total RNA isolert for genekspresjon profilering ble brukt. cDNA ble utarbeidet med Super ™ III revers transkriptase kit i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Karslruhe, Tyskland). I korthet cDNA ble syntetisert i et 20 ul volum inneholdende 1 ug DNase-behandlede total RNA, 1 ul oligo (dt)
20 (50 pM), og 1 ul 10 mM dNTP-miks, 4 ul 5 x Først tråd buffer, 1 ul 0,1 M DTT, 1 mikroliter av RNase OUT, og 1 ul av Superscript III (200 U /ul). RNA, dNTP og oligo (dt) primer ble blandet først, oppvarmet til 65 ° C i 5 minutter og plassert på is før tilsetning av de gjenværende reaksjonskomponentene. Deretter ble reaksjonsblandingen inkubert ved 55 ° C i 45 minutter og avsluttet ved varmeinaktivering ved 70 ° C i 15 minutter. En identisk reaksjon uten revers transkriptase ble utført for å bekrefte fraværet av genomisk DNA. Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført for genene TXNIP, DUSP6, CEACAM1, NPC1 og BCL2A1 bruke primere som er oppført i tabell 1 (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Tyskland), 2 pl cDNA og HotStar Taq polymerase (Qiagen, Hilden ) i henhold til standard PCR-protokoller. Forward primere for alle gener ble valgt ved å søke den opprinnelige oligonukleotid sekvens av tilsvarende genet identifikasjonsnummeret til Affymetrix genet chip på Affymetrix nettsiden (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). Den reverse primere ble utformet basert på gensekvensen anordnet på Affymetrix nettsiden. Annealing temperaturer på 50 ° C ble anvendt for TXNIP, DUSP6 og BCL2A1 eller 55 ° C i CEACAM1 og NPC1. For normalisering, ble en β-aktin-fragment på 540 bp amplifisert samtidig ved anvendelse av primere som er oppført i tabell 1 [39]. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter ble analysert ved hjelp av 1% agarose (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) gels og densitometrisk analyse med bilde J® programvare (National Institutes of Health, Bethesda, USA) etter farging gels med etidiumbromid (Carl Roth).
Totalt proteinekstrakter og Western blotting
Totalt proteinekstrakter fra 4-dagers 3D og 2D cellekulturer ble isolert som tidligere beskrevet [13]. I korte trekk ble celler behandlet med modifisert RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl (Carl Roth), pH = 7,4), 1% Nonidet-P40 (Sigma), 0.25% natriumdeoksycholat (AppliChem, Darmstadt, Tyskland), 150 mM NaCl (VWR International, Darmstadt, Tyskland), 1 mM ethylendiamintetraeddiksyre (Merck), komplett proteasehemmer cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland), 1 mM NAVO
4 (AppliChem), 2 mM NaF (AppliChem)). Prøvene ble lagret ved -80 ° C. Totalt protein beløpet ble målt ved hjelp av bicinchoninic syre analysen (Pierce, Bonn, Tyskland). Etter natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese og overføring av proteinene til nitrocellulosemembraner (Schleicher pepperrot peroksidase-konjugert esel anti-kanin, esel anti-geit og sau anti-mus (Amersham, Freiburg, Tyskland) sekundære antistoffer. SuperSignal® West Dura Utvidet Varighet substrat (Pierce, Bonn, Tyskland) og Amersham Hyperfilm ECL (GE, München, Tyskland) ble brukt for deteksjon. Densitometry ble utført ved hjelp av Image J® programvare. Tre uavhengige forsøk er blitt utført.
Resultater
3D og 2D cellevekstegenskaper og celleoverlevelse etter radio- eller kjemoterapi
Cell form og morfologi var annerledes mellom 3D og 2D celle vekstbetingelser (fig. 1a). Fire dager etter plettering ble cellene eksponentielt voksende med tilsvar doblingstid (Fig. 1B). Denne likheten i celle dobling ganger gitt sammenlignbare forsøksbetingelser for hele genomet genekspresjonsanalyse. Viktigere, ble tidligere forsøk som evaluerer stråling overlevelsen av A549 og UT-SCC15 celler gjentok dermed danner begrunnelsen for presenterte studien til koblingen vekst avhengige radio- og chemoresistance med vekst-avhengig genekspresjon modifikasjon [11]. Under 3D-betingelser, begge cellelinjer viste signifikant høyere klonogene overlevelses ved å utsettes for økende enkle doser av røntgenstråler eller økende konsentrasjoner av Cisplatin, sammenlignet med 2D (fig. 1C og D). Disse dataene antyder en sammenheng mellom vekstbetingelser og cellemorfologi og celle radio- og chemoresistance.
(A) Representative bilder og skjematisk av 2D (
i
,
iii
) og 3D (
ii, iv
) cellevekst som finnes på dag 4 rett før RNA isolasjon. Barer, 50 mikrometer. (B) Dobling tider av 2D og 3D cellekulturer på dag 4 etter plating. Resultater viser middelverdi ± SD (n = 3). N.S., ikke signifikant. Klonogene overlevelses av 2D- eller 3D dyrkes cellene eksponert mot økende X-ray doser (2, 4 eller 6 Gy) (C) eller Cisplatin konsentrasjoner (0,1, 1, 5, 10 uM) (D) påført 24 timer etter utplating. Cisplatin ble fjernet etter 24 timer etter 3- (2D) eller 15 ganger (3D) vasking med DMEM /10% FCS /1% NEAA. Resultater viser middelverdi ± SD (n = 3; t-test). * P 0,05; ** P 0,01. CDDP, Cisplatin. Bar, 200 mikrometer.
Hele genomet genuttrykk analyse av A549 og UT-SCC15 dyrket i 3D eller 2D
Dette genom bred analyse av genuttrykk ble utført under ubehandlede betingelser og ment å identifisere spesifikke genuttrykk mønstre av enkeltgener eller funksjonelt forbundet genet grupper som kan knyttes til tumorceller radio- og chemoresistance. Fra genet profilering, hierarkisk clustering og statistisk analyse ved hjelp av SAM, var det åpenbart at vekstforholdene påvirker genekspresjon mønstre (Fig. 2A og B). Den estimerte falske funnraten (FDR) var 0 ned til settet «delta» ( «delta» = 2,873 i A549, «delta» = 2,445 i UTSCC15). Et høyere antall gener ble uttrykt forskjellig i A549 (376 transkripsjoner) enn i UT-SCC15 (178 transkripsjoner) celler (figur 2A, Tabell 2,. Tabell S1 og S2). I 3D, A549 og UT-SCC15 celler viste flere gener oppregulert enn nedregulert i forhold til 2D (Fig. 2A og B).
(A) Hierarkiske klynger av gener av 2D og 3D cellekulturer på dag 4 etter plating. Rødt indikerer gener uttrykt over gjennomsnittet; grønn indikerer gener uttrykt under gjennomsnittet og svart indikerer gjennomsnittlig uttrykk etter Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM). «Positiv» indikerer gener oppregulert i 3D versus 2D. «Negative» indikerer genene nedregulert i 3D versus 2D. (B) Plot av antall vitnemål mot signal logg forholdstall fra 3D versus 2D cellekulturer fra A549 og UT-SCC15 celler. (C) Gene ontologi avhengig plotting av absolutte tall og i prosent av vesentlig modifiserte gener i 3D versus 2D cellekulturer i henhold til SAM analyse.
Ifølge SAM, A549 celler hadde 242 transkripsjoner opp – og 134 nedregulert mens UT-SCC15 celler hadde 125 transkripsjoner opp- og 53 transkripsjoner nedregulert (fig 2A og B, Tabell S1 og S2.). Forbløffende nok disse to forskjellige cellelinjer viste en overlapping av cellulære komponenter og biologiske funksjoner å bli påvirket i henhold 3D vekstbetingelser med hensyn til genet ontologi (Fig. 2C, Bord S3 og S4). UT-SCC15 celler, generelt, viste mindre gener modifisert ved 3D-vekst i forhold til A549-celler (fig. 2A, Tabell S2). Fra en en-til-en-genekspresjon sammenligning, ble det åpenbart at modifiseringer forekommer i forskjellige gener innenfor de samme grupper av cellulære komponenter eller biologiske funksjoner i et cellelinje-avhengig måte. På toppen av SAM, ble t-test analyse utført som 856 gener ble oppregulert og 721 nedregulert i 3D A549 cellekultur i forhold til 2D (å merke seg: SLR terskel +/- 0,8). I UT-SCC15 celler, ble 429 gener oppregulert og 277 nedregulert i 3D i forhold til 2D. Overlappingen av forskjellig uttrykt gener ved SAM og t-test for 3D-til-2D sammenligning avslørte 238 transkripsjoner oppregulert og 128 transkripsjoner nedregulert i A549 celler og 119 transkripsjoner oppregulert og 52 transkripsjoner nedregulert i UT- SCC15 celler (tabell S5 og S6) .Disse funn tyder på at prosesser knyttet til celle adhesjon, biologisk vedheft, immunsystemtiltak, forsvar svar, utvikling vev og respons på organisk stoff er hovedsakelig regulert via differensial genuttrykk når cellene blir overført fra en 2D til en 3D-matrise-baserte mikromiljøet. Uten uttalt uttrykk endringer av gener involvert i DNA-reparasjon, kan det spekulert i at radio- og chemoresistance av 3D vokst celler resultater fra Spesielt ennå uidentifiserte, endringer av celle arkitektur og herved indusert modifikasjoner av celle interactome i form av signaloverføring og protein -protein interaksjoner.
Validering av microarray data ved PCR og Western blotting
for microarray datavalidering, ble utvalgte gener og proteiner undersøkt ved hjelp av semi-kvantitativ RT-PCR (thioredoxin samspill protein (TXNIP) , dual spesifisitet fosfatase 6 (DUSP6), carcinoembryonic antigen relaterte celleadhesjonsmolekyl 1 (CEACAM1), Niemann-Picks sykdom, type C1 (NPC1) og BCL2 relaterte protein A1 (BCL2A1)) og Western blotting (Fibronektin (FN1), bindevev vekstfaktor (CTGF), v-erb-b2 erythroblastic leukemi virus-onkogen homolog 3 (ErbB3) og BCL2A1), henholdsvis.
signal~~POS=TRUNC prosenter av utvalgte gener fra 3D eller 2D cellekulturer vises i Figur 3. TXNIP og DUSP6 liggende gener i økende grad uttrykt i begge cellelinjene når de dyrkes i 3D forhold til 2D (fig. 3). CEACAM1 induksjon og NCP1 og BCL2A1 undertrykkelse ble bare observert i 3D-A549 cellekulturer (Fig. 3). Semi-kvantitativ RT-PCR på RNA prøver som brukes for microarray analyse bekreftet indusert TXNIP ekspresjon i 3D mens økt DUSP6 ekspresjon kunne bare bekreftes i UT-SCC15 celler (fig. 4A og B). Forbedrede CEACAM1 mRNA-nivåer ble påvist i både 3D-A549 og 3D-UT-SCC15 cellekulturer, som var bekreftende for A549 og borderline for UT-SCC15 celler med hensyn til DNA mikroarray data (Fig. 4A og B). Den gener NPC1 og BCL2A1 viste redusert eller stabile nivåer i genomet brede analysen i A549 eller UT-SCC15 celler, henholdsvis; Resultatene fullt ut bekreftet ved semi-kvantitativ RT-PCR (fig. 4A og B).
Ekspresjon av genene TXNIP1, DUSP6, CEACAM1, NPC1 og BCL2A1 er avgrenset forhold fra 3D 2D versus cellekulturer fra A549 og UT -SCC15 celler.
(A) Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført som beskrevet under materialer og metoder. Vist er 1% agarosegel med RT-PCR fragmenter av TXNIP, DUSP6, CEACAM1, NPC1 og BCL2A1 mRNA isolert fra A549 eller UT-SCC15 celler. Prøver ble amplifisert fra cDNA generert ved revers transkripsjon av total RNA fra 4-dagers gammel 3D- og 2D-cellekulturer. Alle eksperimenter (V1, V2, V3) er utstilt. p-aktin uttrykk fungert som lasting kontroll (540 bp). (B) Grafer vise resultater fra densitometrisk analyse av indikert mRNA uttrykk etter normalisering p-aktin. Resultatene viser gjennomsnittlig ± SD (n = 3).
Neste, et annet sett av gener (FN1, CTGF, ErbB3, BCL2A1) ble sjekket på proteinnivå ved Western blotting. Signallogg prosenter av disse genene som genereres av DNA microarray var: FN1 = 1,6 /n.c. (A549 /UT-SCC15); CTGF = 1,2 /-3,8 (A549 /UT-SCC15); ErbB3 = 2,2 /n.c. (A549 /UT-SCC15); BCL2A1 = -3,8 /n.c. (A549 /UT-SCC15) (Fig. 5A, Tabell S1 og S2). I 3D-A549-cellekulturer, bekreftet protein ekspresjon analyse DNA mikromatrisebasert oppregulering av Fibronectin, CTGF og ErbB3, så vel som nedregulering av BCL2A1 (fig. 5B og C). 3D UT-SCC-15-cellekulturer viste ingen forandringer av undersøkte proteiner, inkludert CTGF, som viste sterk undertrykkelse i henhold til vår microarray-baserte analyser (fig. 5B og C). I de fleste tilfeller er disse data viste lignende resultater mellom hele genomet bred genekspresjon analyse ved hjelp av mikromatriseformat og RT-PCR eller Western blotting.
(A) Signal log forhold av utvalgte gener (FN1, CTGF, ErbB3 og BCL2A1 ) fra DNA microarray-baserte analyse utsatt for Western blot analyse. (B) Hele cellelysater ble fremstilt fra 3D og 2D cellekulturer på dag 4 etter plating. SDS-PAGE og Western blot-analyse ble utført som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Representative bilder viser uttrykk for fibronektin (240 kDa), CTGF (38 kDa), ErbB3 (180 kDa) og BCL2A1 (20 kDa). β-actin tjente som lasting kontroll. (C) Densitometriske enheter av proteinbåndene som vises i «B» er plottet på normalisering p-aktin.
Diskusjoner
Tap av funksjonelle og fenotypiske egenskaper oppstår når celler dyrkes ex vivo i et 2D-mikromiljøet [1], [4], [18], [20]. Dette kan forhindres ved å dyrke cellene i fysiologiske 3D ECM stillaser vist for forskjellige endepunkter som protein ekspresjon, morfologi, og prediksjon av gene signaturer for klinisk utfall [2], [5], [6], [29], [30] . Vurderer disse punktene, fokuserte vi på de mekanismene modulerende svulst celle følsomhet for radio- og kjemoterapi. For å vurdere effekten av basale genuttrykk profiler på flere fysiologiske 3D versus kunstige 2D cellekultur modeller, ble denne studien utført på menneskelige epiteliale kreftcellelinjer som stammer fra to av de hyppigste kreftformer på verdensbasis, dvs. lunge (A549) og hode og hals plateepitelkarsinom (UT-SCC15) [40]. Valgt fra ulike cellelinje modeller testet i vårt laboratorium, disse to kreftcellelinjer varierer i sin opprinnelse og genetisk bakgrunn og er førsteklasses eksempler som viser prosurvival effektene av vekst i en 3D ECM stillas i forhold til konvensjonelt brukes kultur plast [11], [ ,,,0],12], [13], [14]. Vi viser betydelige endringer i genuttrykk profiler av 3D versus 2D cellekulturer. Mens gener involvert i DNA-reparasjon pathways bodde umodifisert, ble de fleste av endrede gener i begge cellelinjer forbundet med biologiske funksjoner som vev utvikling, celle adhesjon, og forsvar respons. Validering av microarray data ble utført på utvalgte gener på mRNA og protein nivå.
3D-cellekulturer er i økende grad ansatt i kreftforskning samt tissue engineering, utviklings- og cellebiologi. For terapi utvikling, er cellerespons nøkkelen problemet og dramatisk annerledes i en 3D fysiologisk miljø i forhold til petriskål forhold. Med hensyn til klonogene celle overlevelse etter eksponering for røntgenstråler eller mye brukt kjemoterapeutiske stoffet Cisplatin, både A549 og UT-SCC15 celler viser økt overlevelse i 3D i forhold til 2D. Ettersom disse er bare to eksempler ut av flere [12], [13], [14], [15], [23], [24], paradigmer «celle adhesjon mediert radioresistance» og «celle adhesjon formidlet stoffet motstand» hovedsakelig undersøkt i konvensjonelle ECM-belagte cellekultur retter har å revurderes ved å ta alvorlige endringer i for eksempel signaltransduksjon, DNA-reparasjonsprosesser, etc i betraktning når cellene vokser i 3D. Viktigere, forskjeller i parametre som hypoksi, proliferasjon og strålingsdosimetri som er kjent som viktige determinanter for celledelte radiosensitiviteten kan utelukkes i et tidligere dybde komparativ analyse mellom celledyrkningsbetingelser [11] 3D- og 2D. Dermed blir 3D ECM-baserte cellekultur modell som brukes her er en rimelig og gjennomførbare metoden for undersøkelser av tumorcelle radio- og kjemosensitivitet og de underliggende mekanismene.
Til tross for vår kunnskap om alvorlige endringer i genuttrykk mønstre av skille celler fra vev for ex vivo-2D-cellekulturer [1], [41], [42], disse resultatene har vært mye neglisjert. I 2D, ble både antallet av differensielt uttrykte gener, og de genekspresjon nivåer i cellelinjer fra tumor- og normale vev redusert med opptil 70%, og hadde en svingning området fra ca. 1,5 ganger i forhold til opprinnelses vev, henholdsvis [43 ], [44]. Sammenligning av våre microarray analyse med andres arbeid, fant vi tilsvarende genuttrykk profiler. For eksempel, både A549 og UT-SCC15 viste karakteristiske basal mønstre av gener som koder for proteiner med funksjoner i modulering av ECM som Laminin, fibronektin, kollagen, et funn likeledes observert i en basal genekspresjon analyse av 60 cancercellelinjer og deres tilsvarende kreftvev og i en studie utført på melanom [30], [42]. Disse dataene støtter videre vår oppfatning at 3D-cellekulturer er mer fysiologisk og vev-aktig enn 2D. Til tross for tilsvarende vekstrater av våre testede humane tumorcellelinjer, cellulær differensiering prosesser knyttet til endringer i f.eks ECM proteiner kan utpreget innflytelse respons av kreftceller til ulike behandlingsformer.
Av største betydning for oss var å finne at 3D-cellekulturer ulikt uttrykte gener involvert i «ekstracellulære matrix «og» celle adhesjon «samt «forsvar svar «, men ikke i» DNA reparasjon «. Som en modulering av gener som er involvert i regulering av cellestørrelsen og adhesjon er ikke overraskende når cellene blir overført fra monolag til en 3D-miljø, disse funnene tyder sterkt på at nivået av ekspresjon av visse gener assosiert med DNA-reparasjon er ikke nødvendigvis knyttet funksjonelt til en observert celle atferd. I vårt tilfelle, bestrålt eller Cisplatin behandlet A549 og UT-SCC15 viste en høyere klonogene overlevelse etter 3D vekstvilkår i forhold til 2D; imidlertid en tilsvarende økning i ekspresjon av f.eks DNA reparasjonsgener som PRKDC (protein kinase, DNA-aktivert, katalytisk polypeptid), ATM (ataxia telangiectasia mutert) eller MDC1 (formidler av DNA-skade sjekkpunkt 1) var fraværende. Sammenfattende og i motsetning til å studere vurdere prediksjon av radioterapi og kjemoterapi reaksjonsevne, kan det spekulert i at det viktig determinant for denne forbedrede overlevelse er sannsynlig å være protein interactome og ikke transkriptom. Når det gjelder overføring av data fra benk til sengen for terapi, bør det understrekes at data generert i tumorprøver med konserverte fenotyper, inkludert genuttrykk profiler, vil trolig være mer relevant enn 2D data og kan brukes til å identifisere viktige signal hubber for target terapi.
i sammendraget, de presenterte data viser klart at vekstforholdene har stor innvirkning på genuttrykk. Siden 3D-cellekulturer reflektere fysiologiske vekstbetingelser og gi terapi motstand mot kreftceller, disse funnene tyder på at, på den transkriptomet nivå, celleform og celle-celle-kontakt er to av de viktigste faktorer som bestemmer cellulær respons til ytre stress. Dette begrepet kan formeres til en mer realistisk, høyere kompleksitet hvor strukturelle og kommunikative endringer i proteome legge til betydelige signaler for regulering av cellulære oppførsel, spesielt terapi motstand. Fremtidige studier i optimaliserte cellekultur modeller som 3D ECM-modellen er garantert å møte de transcriptomic og proteomikk mekanismer for tumorcellebiologi, kreftbehandling respons og evaluering av nye potensielle kreft mål.
Hjelpemiddel Informasjon
Table S1.
genekspresjonsanalyser i 3D versus 2D A549 cellekulturer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034279.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
genekspresjonsanalyser i 3D versus 2D UT-SCC15 cellekulturer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034279.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Gene ontologi Analysis, Cellular Component. Overlappingen er merket i kursiv /fet skrift.
